氮气气调对赤拟谷盗的防治效果及抗氧化酶活性的影响

鲁玉杰, 杨 丽, 卢少华, 刘嘉澍, 胡海生, 罗文凤, 刘亚伟

(河南工业大学粮食和物资储备学院1,郑州 450001)

(江苏科技大学粮食学院2,镇江 212100)

赤拟谷盗(TriboliumcastaneumHerbst)是一种重要的世界性分布的储粮害虫[1],其幼虫和成虫均可为害谷物及其制品,且成虫体内的臭腺可以分泌含苯醌等致癌物质的臭液,使小麦粉等结块、变色和发臭而丧失食用价值,造成了巨大的经济损失[2]。目前,生产中对赤拟谷盗的防治主要依赖熏蒸剂和防护剂,长期单一性地过度使用化学药剂不但会导致赤拟谷盗的抗药性越来越强,而且残留的化学药剂也会危害人畜和环境[3,4]。随着社会的发展,世界各国对食品安全和环境保护越来越重视,对使用化学药剂防治储粮害虫的限制日益严格,已逐步减少化学药剂在储粮上的使用[5]。为了可持续地有效防治储粮害虫,需要寻求新的解决途径。

氮气气调储粮是指在密闭的粮堆内抽去空气,充入氮气,达到杀虫的目的[6]。氮气气调储粮技术不仅能防虫、杀虫和抑霉,而且避免了化学药剂对人体的危害和对环境的污染,是一种安全、环保的绿色害虫防治方法[7,8]。氧气是需氧生物维持正常能量代谢和体内平衡所必需的,而氮气气调的杀虫机理主要是低氧致死[9]。低氧胁迫会导致生物身体或身体的一部分组织缺乏足够的氧气而呈现一种病理状态,进而对生物体造成不可逆的损伤[10]。低氧胁迫会破坏昆虫脂质代谢和抑制蛋白质合成[11],增加体内活性氧(ROS)含量从而引起氧化损伤[12]。为了中和ROS过多带来的毒性,昆虫像其他真核生物一样进化出了一套抗氧化酶系统来抵御氧化损伤,抗氧化酶系统可以清除体内过多的ROS,维持体内ROS代谢的平衡,减少低氧胁迫导致的氧化损伤[13,14]。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)是昆虫体内ROS防御系统的主要抗氧化酶系。SOD可以直接催化超氧自由基转化为H2O2和O2,而CAT和POD催化H2O2降解为H2O和O2[15],这3种抗氧化酶协调作用,共同维持昆虫体内ROS的动态平衡状态,保护昆虫免受低氧等逆境环境的迫害。已有研究表明,在低氧条件下,摇蚊(Chironomusriparius)幼虫体内的GST、CAT、SOD等抗氧化酶活性增强[16];加勒比按实蝇(Anastrephasuspensa)体内的SOD2过量表达[17];低氧再复氧后的四纹豆象(Callosobruchusmaculatus)幼虫的耐辐射能力增强,可能是由于体内GST等抗氧化酶活性升高,消除ROS的能力增强[18]。赤拟谷盗幼虫经缺氧再复氧后总抗氧化能力增加,SOD和CAT的活性在刚开始复氧时就不断增加并保持在较高的水平,这些抗氧化酶是响应缺氧再复氧而诱导的,表明幼虫增强了体内的抗氧化酶系的活性以抵御高水平的ROS[19],而条纹角石蛾(Stenopsychemarmorata)经缺氧再复氧后CAT的活性被显著抑制[20]。

在生产实践中,经常会发现即使在充氮低氧气调后的粮仓中仍有残存的赤拟谷盗继续为害,针对这一现象,研究采用不同体积分数氮气处理不同虫态的赤拟谷盗,测定不同虫态的赤拟谷盗对低氧的耐受性以及低氧胁迫下赤拟谷盗体内抗氧化酶系的活性变化,分析赤拟谷盗对低氧的耐受性及其体内抗氧化酶对低氧胁迫的响应,初步探讨赤拟谷盗低氧耐受性的形成原因,为赤拟谷盗在粮仓内的气调防治提供基础数据,为低氧适应性的防治或者延缓低氧适应性的发展提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

赤拟谷盗T.castaneum原种采自广东省汕头市,在河南工业大学储藏物昆虫实验室培养数年。将全麦粉和酵母以质量比19∶1的比例混合配成饲料,用于培养赤拟谷盗。试虫在温度29～31 ℃、相对湿度70%～80%、无光照的恒温恒湿培养箱中培养,分别选取幼虫(14 d)、蛹(28 d)和成虫(羽化后7 d)用于实验。

1.2 主要试剂与仪器

SOD试剂盒、CAT试剂盒和POD试剂盒;电热恒温培养箱,RT-6100型酶标仪,TG16W型微量高速离心机,TGL16M型台式高速冷冻离心机,HT-111B型恒温摇床,AE1204型电子分析天平,XB220A型电子分析天平,81-2型恒温磁力搅拌器,JY98-IIIN型细胞破碎仪。

1.3 赤拟谷盗低氧耐受性测定

低氧胁迫实验参考Kharel等[21]的方法并稍作修改。将相同生命阶段的赤拟谷盗放置在30 mL的透明玻璃瓶中,瓶中加入0.5 g饲料,瓶盖上开有小孔以便昆虫进行气体交换。将玻璃瓶置于不同体积分数的氮气(95%、97%、98%)气调室中,气调室由60 cm×35 cm×40 cm(长×宽×高)的透明聚碳酸酯材料制成。

实验在25 ℃的空调房内进行。通过充入氮气排出气调室中的空气,使其达到目标氮气体积分数,气源为钢瓶装高纯氮。氮气气调的处理时间分别设置为1、3、5、7 d。不同时间的处理均分别独立进行,即处理到目标时间后从气调室中取出后,再重新开始另一个时间的处理,每个处理重复3次。将低氧处理后的赤拟谷盗转移至培养箱中,观察死亡情况,用毛笔触碰虫体,如果赤拟谷盗身体及附肢均不动即视作死亡,记录死亡数据,计算校正死亡率,校正死亡率计算公式为[22]：校正死亡率=处理死亡率-对照死亡率100-对照死亡率×100%。

1.4 抗氧化酶活性测定

取经过低氧处理的50 mg赤拟谷盗幼虫置于2 mL离心管内,加入pH为7.4的磷酸缓冲液(实验前4 ℃预冷),2个小钢珠,使用组织研磨仪研磨充分后,将匀浆液置于3 000 r/min离心20 min,收集上清。采用酶联生物的昆虫超氧化物歧化酶(SOD)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒(产品编号ml036253)、昆虫过氧化氢酶(CAT)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒(产品编号ml062687)和昆虫过氧化物酶(POD)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒(产品编号ml332569),酶活性测定按照试剂盒说明书进行操作。抗氧化酶活性的测定原理是应用双抗体夹心法测定标本中昆虫抗氧化酶水平。用纯化的抗氧化酶(SOD、CAT或POD)捕获抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被的微孔中依次加入昆虫抗氧化酶,再与HRP标记的检测抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的昆虫抗氧化酶呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中昆虫抗氧化酶活性,每个处理均设3个生物学重复和4个技术重复。

1.5 数据统计分析

使用SPSS 20.0软件进行数据统计分析。首先检测数据方差齐性和正态性,并对校正死亡率数据进行平方根反正弦转换。采用单因素方差分析(One Way ANOVA)评价赤拟谷盗的死亡率和抗氧化酶活性,当方差差异显著时再用Duncan’s新复极差法对平均值进行多重比较,差异性显著水平设置为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 不同体积分数氮气对赤拟谷盗的致死效果

通过比较不同体积分数的氮气处理对赤拟谷盗校正死亡率(简称“死亡率”)的影响,发现随着氮气体积分数的增大和处理时间的延长,赤拟谷盗的幼虫、蛹和成虫的死亡率均逐步升高。

2.1.1 不同体积分数氮气对赤拟谷盗幼虫的致死效果

由表1可见,采用体积分数95%和98%的氮气处理赤拟谷盗幼虫7 d的死亡率分别达到89.58%和98.61%,并且显著高于同等体积分数氮气处理1 d和3 d时的死亡率(P<0.05),而与相同体积分数氮气处理5 d时的幼虫死亡率差异不显著(P>0.05);用体积分数97%的氮气处理赤拟谷盗幼虫7 d的死亡率达到了92.36%,并且显著高于同等体积分数氮气处理1 d的幼虫死亡率(P<0.05),而与相同体积分数氮气处理3 d和5 d时的幼虫死亡率差异不显著(P>0.05)。当低氧处理1 d时,随氮气体积分数的升高,赤拟谷盗幼虫的死亡率显著升高(P<0.05);低氧处理3 d时,体积分数98%的氮气处理赤拟谷盗幼虫的死亡率显著高于氮气体积分数为95%和97%的处理(P<0.05);低氧处理5 d和7 d时,体积分数98%的氮气处理赤拟谷盗幼虫死亡率和氮气体积分数为95%和97%的处理差异不显著(P>0.05)。说明使用氮气气调防治赤拟谷盗时,氮气体积分数越大且处理时间越长对赤拟谷盗的防治效果越好,而且对赤拟谷盗幼虫的防治来说,氮气气调的效果是以时间为主导因素的,使用氮气气调时延长处理时间在防治战略上比增加氮气体积分数效果更好。

表1 不同体积分数的氮气处理赤拟谷盗幼虫的校正死亡率

2.1.2 不同体积分数氮气对赤拟谷盗蛹的致死效果

由表2可见,采用体积分数95%的氮气处理赤拟谷盗蛹7 d的死亡率达到45.83%,并且显著高于同等体积分数氮气处理1、3、5 d时的蛹死亡率(P<0.05);用体积分数97%的氮气处理赤拟谷盗蛹,随着处理时间的延长,赤拟谷盗蛹的死亡率依次显著升高(P<0.05),死亡率分别为71.92%(7 d)>53.86%(5 d)>46.95%(3 d)>43.86%(1 d);用体积分数98%的氮气处理1 d后,赤拟谷盗蛹的死亡率已达到52.75%,而处理7 d时的死亡率则高达80.19%,且显著高于处理1、3、5 d蛹的死亡率(P<0.05)。说明在适当的低氧条件下,随着处理时间的延长,赤拟谷盗蛹的死亡率逐渐升高。而在相同的低氧处理时间内,随着氮气体积分数的增大,赤拟谷盗蛹的死亡率依次显著升高(P<0.05)。说明与处理时间相比,氮气体积分数对赤拟谷盗蛹的死亡率的影响更大。

表2 不同体积分数的氮气处理赤拟谷盗蛹的校正死亡率

2.1.3 不同体积分数氮气对赤拟谷盗成虫的致死效果

由表3可见,采用体积分数95%、97%、98%的氮气处理7 d的赤拟谷盗成虫的死亡率分别为13.19%、21.68%、30.55%,均显著高于相同体积分数氮气处理1、3、5 d时的成虫死亡率(P<0.05)。说明相同体积分数的氮气处理条件下,随着处理时间的延长,赤拟谷盗成虫死亡率逐渐上升。低氧处理1 d时,体积分数98%的氮气处理赤拟谷盗成虫的死亡率为8.36%,显著高于体积分数95%和97%的氮气处理赤拟谷盗成虫的死亡率(P<0.05),而体积分数95%和97%氮气对赤拟谷盗成虫的杀死效果差异不显著(P>0.05);与体积分数95%的氮气相比,体积分数98%的氮气处理3 d的赤拟谷盗成虫的死亡率显著升高(P<0.05),而与体积分数97%的氮气的赤拟谷盗成虫的死亡率差异不显著(P>0.05);与体积分数95%和97%的氮气相比,体积分数98%的氮气处理5 d和7 d的赤拟谷盗成虫死亡率显著升高(P<0.05)。说明相同处理时间内,随着氮气体积分数的增大,赤拟谷盗成虫的死亡率逐渐上升。在体积分数95%、97%、98%的氮气条件下,低氧会对昆虫产生亚致死效应,而随着低氧处理时间的延长,赤拟谷盗成虫的死亡率会逐渐升高,Kharel等[21]的研究也证明了这个观点[21]。

表3 不同体积分数的氮气处理赤拟谷盗成虫的校正死亡率

低氧气调防治储粮害虫的效果与气体体积分数、昆虫物种、发育阶段、虫龄和低氧胁迫时间有关[6,23]。通过比较不同体积分数的氮气对赤拟谷盗幼虫、蛹和成虫处理不同时间的死亡率发现,赤拟谷盗的不同虫态对低氧的耐受性顺序为成虫>蛹>幼虫,氮气体积分数越大,处理时间越长,赤拟谷盗的死亡率越高。有研究表明,赤拟谷盗成虫对低氧耐受性最高,可能与成虫具有调节氧通量和水分平衡的有效系统有关,其提高了成虫对低氧的耐受性[24]。而赤拟谷盗的蛹较幼虫的死亡率低,这可能是因为赤拟谷盗蛹期的呼吸代谢速率比较低[6]。尽管低氧处理对蛹的杀死效果较弱,但低氧处理能够延迟赤拟谷盗蛹的羽化时间,这能够有效地延缓害虫种群的增长,从而有助于在密闭环境中更有效地控制害虫的数量[21,25]。李双宇等[26]研究赤拟谷盗对低氧的耐受性时发现,赤拟谷盗对低氧的耐受性顺序为:蛹>幼虫>成虫,而韩欣等[27]发现,不同氧气条件下不同虫态对氧气耐受性顺序有所差异,在体积分数4%氧气环境下,耐受性顺序为:蛹>成虫>老熟幼虫>中龄幼虫>低龄幼虫。与本研究结果的差异可能与选用的赤拟谷盗的品系、氮气体积分数、低氧处理时间以及温湿度有关。

2.2 不同体积分数氮气对赤拟谷盗幼虫体内抗氧化酶活性的影响

2.2.1 不同体积分数氮气对赤拟谷盗幼虫体内超氧化物歧化酶活性的影响

由表4可见,体积分数98%的氮气处理5 d时间内,赤拟谷盗幼虫体内SOD酶的活性先上升后下降;体积分数95%的氮气处理5 d时间内,赤拟谷盗幼虫体内SOD酶的活性逐渐上升。说明赤拟谷盗幼虫体内SOD酶对不同条件的低氧处理的响应程度不同,对高体积分数氮气的响应速度更快,说明高体积分数氮气对赤拟谷盗幼虫的胁迫作用更强,杀虫更快[28],SOD酶活性的升高可以降低有毒产物对昆虫的影响,从而增强昆虫对氮气的耐受性[29]。

表4 不同体积分数氮气对赤拟谷盗幼虫体内超氧化物歧化酶活性的影响

在体积分数95%的氮气条件下,随着处理时间的延长,赤拟谷盗幼虫体内SOD酶的活性逐渐升高,分别为1 391.03 U/g(5 d)>1 293.31 U/g(3 d)>858.87 U/g(1 d)(P<0.05)。与处理1 d和5 d时相比,体积分数98%的氮气处理3 d时的赤拟谷盗幼虫体内SOD酶的活性最高(P<0.05),达到了1 489.32 U/g。低氧处理1 d和3 d时,体积分数98%的氮气较95%的氮气对赤拟谷盗幼虫体内SOD酶的活性与对照组相比升高程度更显著(P<0.05),分别升高了238%和313%;而低氧处理5 d时,体积分数95%的氮气较98%的氮气对赤拟谷盗幼虫体内SOD酶的活性升高程度更显著(P<0.05),升高了288%。

2.2.2 不同体积分数氮气对赤拟谷盗幼虫体内过氧化氢酶活性的影响

由表5可见在体积分数95%的氮气条件下,随着处理时间的延长,赤拟谷盗幼虫体内CAT酶的活性逐渐升高,分别为566.86 U/g(5 d)>345.49 U/g(3 d)>318.60 U/g(1 d)(P<0.05)。在体积分数98%的氮气条件下,随着处理时间的延长,赤拟谷盗幼虫体内CAT酶的活性逐渐下降,分别为700.01 U/g(1 d)>627.63 U/g(3 d)>484.04 U/g(5 d)(P<0.05)。

表5 不同体积分数氮气对赤拟谷盗幼虫体内过氧化氢酶活性的影响

表6 不同体积分数氮气对赤拟谷盗幼虫体内过氧化物酶活性的影响

低氧处理1 d和3 d时,体积分数98%的氮气较95%的氮气对赤拟谷盗幼虫有显著高的CAT酶活性(P<0.05),与对照组相比分别升高了200%和181%;而低氧处理5 d时,体积分数95%的氮气较98%的氮气对赤拟谷盗幼虫有显著高的CAT酶活性(P<0.05),升高了162%。

随着低氧处理时间的延长,体积分数95%的氮气处理赤拟谷盗幼虫体内CAT酶的活性逐渐升高,而体积分数98%的氮气处理赤拟谷盗幼虫体内CAT酶的活性逐渐降低,这可能与赤拟谷盗幼虫的CAT酶对不同体积分数氮气胁迫的响应程度不同,CAT酶响应体积分数98%的氮气处理较体积分数95%的氮气处理的速度更快。

2.2.3 不同体积分数氮气对赤拟谷盗幼虫体内过氧化物酶活性的影响

在体积分数95%的氮气条件下,随着处理时间的延长,赤拟谷盗幼虫体内POD酶的活性先降低后升高,分别为2 411.90 U/g(1 d)>2 201.61 U/g(5 d)>2 194.79 U/g(3 d) (P<0.05)。在体积分数98%的氮气条件下,随着处理时间的延长,赤拟谷盗幼虫体内POD酶的活性逐渐降低,分别为3 401.35 U/g(1 d)>2 950.13 U/g(3 d)>2 411.25 U/g(5 d)(P<0.05)。但在相同的处理时间内,体积分数98%的氮气较体积分数95%的氮气有显著高的POD酶活性,与对照组相比分别升高了185%、160%、132%。说明赤拟谷盗幼虫体内的POD酶能够较快地对低氧处理做出响应,并且对高体积分数氮气做出的响应更快更强。

抗氧化酶活性的显著增加是氧化应激的标志,也体现了昆虫较强的抗氧化应激能力[30]。通过比较赤拟谷盗幼虫的3种抗氧化酶对不同体积分数氮气处理的响应,发现POD酶对低氧的响应速度最快、强度最强;CAT酶对高体积分数氮气的响应速度较快,对较低体积分数氮气的响应速度较慢;而SOD酶对低氧的响应速度较POD酶和CAT酶均要慢。因此,推测POD酶和CAT酶在赤拟谷盗幼虫短时间或瞬时的低氧胁迫中发挥作用,而SOD酶在赤拟谷盗幼虫应对相对较长时间的低氧胁迫或适应中发挥作用。有研究表明,经过4 mg O2/L的低氧胁迫的条纹角石蛾幼虫体内SOD酶的活性显著升高,然而更严重的2 mg O2/L的低氧胁迫后体内的SOD酶的活性与对照组的差异不显著,CAT酶在2 mg O2/L的低氧胁迫下的活性比在4 mg O2/L的低,且均低于对照组的活性,表明CAT酶和SOD酶对低氧胁迫有不同的响应模式[20]。

3 结论

随着氮气体积分数的增大和低氧处理时间的延长,赤拟谷盗幼虫、蛹和成虫的死亡率均逐步升高,赤拟谷盗不同虫态对低氧的耐受性由强到弱的顺序为成虫>蛹>幼虫。在条件允许的情况下,尽可能降低氧气体积分数,较低的氧气体积分数能够有效杀死赤拟谷盗或延迟蛹和幼虫的发育,以达到控制害虫种群的目的。低氧处理能够激活赤拟谷盗体内抗氧化酶的响应,其中POD酶对低氧的响应速度最快、强度最强;CAT酶对高体积分数氮气的响应速度较快,对较低体积分数氮气的响应速度较慢;而SOD酶对低氧的响应速度较POD酶和CAT酶均要慢。POD酶和CAT酶可能在赤拟谷盗应对短时间或瞬时的低氧胁迫中发挥作用,而SOD酶可能在赤拟谷盗应对相对较长时间的低氧胁迫或适应中发挥作用。