从AQP4/Kir4.1的表达和分布探讨水平衡在糖尿病视网膜水肿中的机制与研究进展

黄栊瑢，付美林，2，3，4，刘志敏，2，3，4，陈向东，2，3，4

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）的严重并发症[1]，而糖尿病视网膜水肿，尤其是糖尿病黄斑水肿（diabetic macular edema，DME）是DR 的一种严重并发症，在DR 早期即可出现，是导致DM 患者视力丧失的最常见原因之一[2]。DME 是指由于高糖环境导致血-视网膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）破坏，视网膜细胞内、外环境水液平衡被破坏，造成黄斑中心凹一个视盘直径范围内的细胞外液积聚，使黄斑部视网膜增厚或硬性渗出沉积，进而影响中心视力的黄斑部病变。目前，引起这种视网膜水肿的潜在分子机制尚不清楚，现代研究[3]发现，DME 的成因不仅有视网膜血管的渗漏，还有BRB 水液主动转运机制被破坏，即视网膜水液清除机制的不足。

1 视网膜水肿与水平衡的关系

视网膜是人体最重要的感觉组织之一，需要精细的液体平衡来维持细胞内环境的稳态以期达到最佳视觉效果。在生理状态下，钾离子（K+）和水分子出入视网膜受BRB 的完整性以及Müller 细胞和视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞的调控[4]。在病理状态下，Müller 细胞的功能障碍会促进水液积聚，导致细胞水肿[5]。有研究[6]认为，水肿的视网膜组织由肿胀和死亡的Müller细胞形成。

Müller 细胞是负责视网膜的快速水转运、及时清除多余水液的神经胶质细胞，约占整个视网膜结构的95%～97%。其主要功能就是介导视网膜的水液转运，促进水液向玻璃体和血管内流动，以维持视网膜的水液稳态，使视网膜组织保持相对脱水状态[7]。视网膜的导水率与Müller细胞的水液清除功能息息相关[8-9]。而这一功能主要依赖于表达在Müller细胞上的水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP4）和内向整流性钾通道4.1（inwardly rectifying K+4.1，Kir4.1），二者共同参与K+和水分子的共转运，调节水分子和K+的稳态[10-11]，维持水平衡。视网膜水肿的形成和水平衡息息相关，视网膜导水率的失衡导致水液在视网膜积聚、进而引起视网膜水肿，日久则会累积黄斑中心凹，严重影响患者视功能[12]。

2 AQP4与Kir4.1的关系

水通道跨膜蛋白（aquaporin，AQP）是细胞膜上负责转运水分子的跨膜蛋白，其双向转运水分子的功能可以改变渗透压梯度，进到维持水和离子稳态[13]。通过细胞膜上的AQP进行快速水分子运输是一种重要的分子交换过程，其正向调控腺体组织分泌液体，通过促进细胞内、外环境的液体流动交换营养物质和代谢产物，并通过调节水液代谢影响细胞的体积[14-15]。Müller 细胞膜上高表达的AQP4 是AQP 家族的一员，该蛋白质对于视网膜水液的快速清除至关重要，通过调控该水分子跨膜转运通道可对视网膜细胞内、外的水分子进行双向调节。

Kir4.1 是Müller 细胞特异性的内向转运K+的主要通道蛋白[16-17]，并通过调控K+的跨膜转运而起到排水的作用[18]。当视网膜神经元兴奋时，Kir4.1 使K+从Müller 细胞中排出[19]，形成离子浓度差，进而形成跨膜渗透压，为水分子的转运提供动力，使水分子通过AQP4 的转运从细胞外进入细胞内，同时可以带动K+的虹吸，以缓冲细胞外过量的K+，保持视网膜始终处于水液平衡的状态[20-21]。研究[22]证实，敲除α-syntrophin 基因（敲除血管周围的AQP4，但是Kir4.1 量正常）的小鼠较野生型小鼠K+清除速度延迟率达2 倍，提示AQP4 在胶质细胞中的分布与活性可能影响Kir4.1 的转运功能。

生理状态下，Müller 细胞中AQP4/Kir4.1 表达和分布平衡、结构和功能耦联，共同维持Müller 细胞的水平衡。高糖环境下AQP4/Kir4.1 表达失调导致Müller 细胞水肿，可能是导致DME的关键因素。

3 AQP4/Kir4.1的分布与水平衡的关系

Müller 细胞通过K+通道对细胞外的离子浓度和pH 值进行调节，实现视网膜组织的水、电解质平衡，避免神经元细胞肿胀[23-24]。Müller 细胞的水液清除功能是否正常，取决于表达在Müller 细胞膜上的AQP4/Kir4.1 的表达与分布是否平衡。

血液或玻璃体内的液体成分能够通过AQP4 进入视网膜细胞的外间隙[25-26]，AQP4 在视网膜组织的液体平衡过程中起到关键作用。研究[27]发现，缺血、缺氧状态的血管周边的K+通道下调可能导致AQP4/Kir4.1 解耦联，从而可能导致Müller 细胞及周边视网膜血管的水转运速率改变，引发视网膜水肿。Kir4.1 介导的K+跨膜转运，形成了渗透梯度，为水分子经AQP4 跨膜转运提供动力。因此，只有Müller 细胞膜上的Kir4.1 充分发挥调节K+的跨膜转运作用，AQP4 介导视网膜组织的跨膜水转运作用才能正常发挥[28]。同时，AQP4介导的快速跨膜水转运又是Kir4.1 持续存在的必要条件[28-29]。

Kir4.1/AQP4 蛋白质复合物通过肌营养不良蛋白（dystrophin 71，DP71）锚定于Müller细胞膜，表达于靠近视网膜血管周围区域的Müller细胞终足处[30-33]。Müller细胞终足是视网膜血管系统和视网膜之间维持K+平衡进行水液交换的重要细胞膜结构[34]，其清除Müller 细胞与邻近视网膜血管细胞外环境中的K+离子，起到“K+缓冲”的作用。据报道[35-36]，在视网膜静脉阻塞、视网膜缺血再灌注等许多眼部疾病中，Kir4.1、AQP4 和Dp71 的下调或重新分布是引起Müller 细胞肿胀的重要因素。Kir4.1/AQP4 的分布及其功能性是Müller细胞发挥清除液体、保持内层视网膜处于干燥状态的作用的重要前提[37]。

4 AQP4 及Kir4.1与糖尿病视网膜水肿的关系

高糖环境导致视网膜持续处于缺血、缺氧状态[38]，Kir4.1与AQP4 的表达和分布失衡，导致K+的转运功能异常，引起水平衡失调，进而引起视网膜细胞和组织水肿，Müller 细胞发生反应性增生[26,39]。缺氧早期的Müller 细胞中Kir4.1 蛋白质功能性脱位，AQP4 与Kir4.1 失耦联[40]，Kir4.蛋白下调[41]，Kir4.1 出现低水平分布[41-43]，导致Müller 细胞的排钾功能障碍，细胞内K+累积过多，导致细胞内渗透压明显上升。同时，AQP4 的表达明显增加，随着AQP4 的激活，视网膜血管中的水分子大量进入视网膜组织，导致视网膜组织内积聚过多的液体，大量液体无法被及时地重新吸收回血液中，引起细胞肿胀[42,44-45]。K+浓度增加亦引起Müller 细胞的极化，从而导致谷氨酸累积[46]，使Müller 细胞的肿胀更加严重，最终导致细胞自噬和凋亡[4]，降低Müller 细胞介导的血管源性视网膜水肿的清除效率。Müller 细胞凋亡亦破坏了K+的空间稳定性，加重了水液代谢失衡，形成恶性循环，而肿胀和死亡的Müller 细胞最终形成黄斑部囊样水肿[5]。此外，K+浓度的改变亦使血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α ，TNFα），白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等过量释放，导致血管通透性增加，加速DR的进展[47]。

5 维持水平衡治疗糖尿病视网膜水肿

AQP4/Kir4.1 表达失调导致细胞毒性和血管原性细胞水肿，最终导致DME。视网膜水液稳态的维持有赖于BRB 的稳定和水液清除机制的正常运转。最新研究[48-50]发现，康柏西普（conbercept）可以通过降低Müller 细胞中AQP4 的表达缓解视网膜水肿，但对Müller细胞本身的生长并无影响。雷珠单抗（ranibizumab）亦通过直接结合VEGF-A 上调Kir4.1和AQP4，保护Müller 细胞免受DM 细胞内水肿的影响，同时降低细胞内渗透压[6]，这都证明抗VEGF 药物，可能通过靶向调节Kir4.1和AQP4恢复水液平衡治疗DME。

中医学方面，张仲景言：“血不利则为水”[51]。《血证论》[52]曰：“血与水本不相离”“病血者未尝不病水；病水者，亦未尝不病血也。”故在糖尿病视网膜水肿的治疗中当治血以治水[53]。DR 是伴随DM 气阴两虚证向阴阳两虚证转化过程中所发生的眼部血行不畅，目络瘀阻[54]。水与血在病理上一致，血不行则水不行，胶着眼底，发为水肿[55]。AQP4与Kir4.1在整个维持视网膜水液代谢平衡的过程中，此消彼长，维持着一种接近稳态的平衡。维持AQP4 与Kir4.1 表达平衡，以期维持视网膜水液代谢效率，改善视网膜水肿，亦体现以调整阴阳为基本原则，从活血利水的角度入手，治疗“血不利之水”[56]。

贾鑫等[9]用含有不同浓度活血通络利水方的大鼠血清，均显著降低缺氧Müller 细胞中AQP4 并升高Kir4.1 表达，且呈剂量依赖性。证实了中药活血通络利水方能够对缺氧视网膜Müller 细胞中AQP4 和Kir4.1 蛋白表达发挥调节作用，通过恢复AQP4/Kir4.1 耦联进而维持Müller 细胞离子和液体平衡。张勇等[57]研究发现早期DM 大鼠视网膜中AQP4 上调，Kir4.1 表达下调，说明在高血糖环境下，视网膜内AQP4表达升高，Kir4.1 表达降低，且丧失了自和平衡的能力，促进了视网膜水液清除机制的破坏。证明Kir4.1和AQP4的表达需要在一个动态平衡的状态，协同发挥正常的生理功能，才能保证视网膜水液进出的动态平衡。如不使AQP4、Kir4.1表达平衡状态，必将导致视网膜水肿加重，累及黄斑，最终导致失明。

6 小结

DR的成因十分复杂，整个视网膜微环境稳态的维持，包括视网膜水肿清除机制，牵涉到微观层面众多视网膜细胞间的相互作用（信号传导、炎症因子表达释放、巨噬细胞极化等）、连接（包括突触连接、构成BRB 的紧密连接等）以及宏观层面血液供应的重新分布等。近年来，视网膜水液机制的破坏引起了国内、外学者的广泛关注。目前AQP4/Kir4.1 是当前国内、外学者研究糖尿病视网膜水肿形成的病理过程中的热点分子，有望成为治疗的新靶点，但关于二者的表达关系及变化在其发生发展过程中所起的作用尚未有定论。