3D打印技术在牙周病学领域的研究进展

王瑞奇 杨玉 杨竹君 综述 王忠山 审校

牙周组织是由牙齿周围的牙周膜、牙槽骨、牙骨质和牙龈四部分组成,其主要功能是支持、固定以及为牙齿提供营养。其中牙周膜是一种致密的纤维组织,其一端埋入牙骨质,另一端连接牙槽骨,将牙齿悬吊固定在牙槽窝内。因此牙槽骨、牙周膜和牙骨质是一个密不可分的整体,又被称为牙周复合体(periodontal complex)[1]。牙周病(periodontal disease)是指发生在牙周组织的慢性炎症,在人群中发病率高达90%。其发生与菌斑微生物、牙结石等局部因素以及内分泌、吸烟等全身因素有密切关系。若未及时治疗,往往会导致牙周附着丧失、深牙周袋的形成、牙槽骨吸收等,最终导致牙齿的松动脱落。此外,由于外伤、肿瘤切除等原因,也会造成牙周组织的缺损。维护牙周健康,对于牙齿的长期留存非常重要。近几十年来,3D打印技术(3D Printing)因方便、快捷、易于成型等优点,已被大量应用于牙周领域[2],本文主要就3D打印技术在牙周领域的研究和应用进行总结,主要包括牙周沟通和教学、牙周缺损临床治疗以及牙周再生3 个方面。

1 牙周临床治疗

近年来,随着3D打印技术的进步,3D打印技术在牙周病治疗以及前牙区牙龈美容手术中得到广泛应用。在国外的一项研究报道中,使用3D打印技术为一位重度牙周炎患者设计了牙周缺损的光敏树脂支架,然后抽取患者的自体静脉血制备富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF),与Bio-Oss骨粉混合后加载到支架上并进行塑形,最后在支架上覆盖PRF膜以及Bio-Gide胶原膜。术后15 个月,临床和影像学检查结果显示:患牙的牙周袋深度减小,并有少量牙槽骨再生[3]。

以细胞为基础的3D生物打印技术在临床上也有应用。在国外一项研究中,将人骨髓来源的间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)和3D打印的个性化聚己内酯(polycaprolactone,PCL)支架复合后修复唇腭裂患者的牙槽突裂。术后6个月,新生骨体积达到了原缺损总体积的45%,新生骨密度达到周围天然骨密度的75%,该临床研究也为修复严重的牙周骨缺损提供了一种潜在的治疗方案[4]。

3D打印的个性化钛网也被应用于临床。我国学者在2018年发现:3D打印的个性化钛网支架联合引导骨再生技术(guided bone regeneration,GBR)对于牙周病中牙槽骨缺损的修复具有良好的临床效果,但需要探索更好的设计方案来解决或延缓钛网暴露的问题[5]。

2015 年,意大利研究人员利用3D打印的生物可吸收的聚己内酯(PCL)支架和生长因子治疗牙周缺损,支架覆盖12 个月后,较治疗前增加了约3 mm的牙周附着以及部分牙根面的新生骨覆盖;但术后第13 个月时,移植部位出现较大的感染裂口,最终不得不将整个支架取出,导致治疗失败[6]。因此,如何保证生物材料的无菌植入以及避免生物材料的后期感染,需要在以后的牙周治疗中进一步优化。

2 牙周再生

牙周病伴随牙周软、硬组织丧失,3D生物打印技术主要是通过向缺损牙周组织提供个性化设计的支架材料以及生长因子、种子细胞或生物活性蛋白等,在一定时间内修复牙周组织以及牙周骨缺损。牙周组织再生的一个重要原则是防止快速生长的口腔上皮、真皮纤维结缔组织向骨缺损区生长,同时为缓慢生长的骨组织提供稳定的再生空间。根据缺损区域的再生需求,可以灵活选择不同的3D打印技术应用于组织再生。干细胞、基因治疗、生物打印和分层仿生技术等领域的前沿研究,推动了牙周组织再生的进一步发展,并可进一步应用于口腔颌面部缺损的治疗[2,7]。

2.1 牙槽骨再生

由牙周炎症、创伤和外科手术等导致的牙槽骨丧失给功能性的牙槽骨重建带来了很大的困难。近十年来,随着3D打印技术在各学科领域研究应用的迅速发展,将3D打印技术和再生医学的组织工程技术相结合便产生了生物打印技术(bioprinting)。纳米羟基磷灰石(nanometre hydroxyapatite,nHA)和脱蛋白牛骨基质(deproteinised bovine bone matrix,DBBM)是目前牙槽骨再生的常用材料,尤其是DBBM因其疏松多孔的结构而被广泛应用。国内有学者将nHA和DBBM分散到胶原蛋白(collagen,CoL)中制备“生物墨水”,随后比较了两种支架材料的物理、化学和生物性能。结果发现nHA/CoL和DBB/CoL 均可用于3D打印支架的制作,两种支架对于骨髓间充质干细胞(BMMSCs)都有成骨诱导作用,均可作为临床应用的良好支架材料[8]。Mangano等[9]使用羊上颌窦缺损模型评估3D打印的双相磷酸钙(biphasic calcium phosphate,BCP)支架植入45 d和90 d的生长情况,结果表明: 在窦腔内该支架与周围骨组织完全融合,新生骨小梁数量随时间延长明显增加,但最终新生骨数量和成熟度仍与自体骨存在差异。Tamimi等[10]在兔颅骨缺损模型中分别放置3D打印的三斜磷钙石(monetite)移植物和自体骨移植物, 8 周后进行比较发现两种支架材料在接触或接近天然骨的部位均有新骨形成,尤其在血液供应较丰富的移植物外侧新生骨量较多,二者骨高度的增加没有显著差异,这些结果表明3D打印的三斜磷钙石支架可作为自体骨移植物的替代品。

由于牙槽骨的生物特性,拔牙会导致牙槽嵴宽度和高度降低。据文献统计,拔牙后3 个月牙槽骨的平均宽度和高度分别降低了3.87 mm和1.67 mm。目前,3D打印技术可用于制作个性化的拔牙窝缺损支架,在拔牙后植入拔牙创,用于保存牙槽窝并维持其尺寸,即位点保存技术(site preservation)[11]。Park等[12]研究证实3D打印的PCL支架可用于犬牙槽窝位点保存。Goh等同样报道了3D打印的PCL支架在牙槽骨保存中的应用,支架植入6 个月后骨愈合正常,牙槽嵴保存效果明显优于无支架组[13]。Pennapa等[14]报道3D打印的羟基磷灰石移植材料也可用于拔牙窝位点保存。

对于现有支架材料的改性,也是目前3D打印技术在牙槽骨再生领域的研究热点。比如,PCL/PLGA复合支架材料是目前牙周骨再生的热点研究材料。然而,脂肪族聚酯降解后会释放出大量酸性副产物,这可能导致组织炎症坏死和支架的缓慢暴露。最新研究发Mg/PLGA支架可被应用于牙槽骨位点保存,其中镁可以抵消PLGA降解产物的酸性作用,从而降低组织炎症的发生风险,最终达到更好的骨再生效果[15]。Li等[16使用了一种冻干的富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)涂层来改善PCL支架的生物特性。将该涂层涂于3D打印的PCL支架上,然后置于-80 ℃下30 min进行冷冻干燥,与PRP-PCL支架或单纯PCL支架相比,冻干PRP-PCL支架具有更好的成骨效果。有研究者使用3D生物打印技术制备个性化的多孔β-TCP/胶原支架修复大鼠牙槽骨缺损,将大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)和复合支架体外共同培养后结果显示:3D打印的β-TCP/胶原支架外形与缺损部位匹配良好,具有可控的多孔隙结构,促进了大鼠BMMSCs的成骨活性。此研究为牙槽骨缺损的修复提供了新的解决思路和探索方向[17]。

此外,对于加载生长因子的3D打印支架材料的研究也是牙槽骨再生的热点研究领域。最近研究发现,生长因子和支架的协同作用能够更好的促进牙周组织再生。国外一项研究利用骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)、骨髓间充质干细胞以及3D打印的生物玻璃(3D printed bioglass,3D-BG)支架来修复恒河猴牙槽骨上10 mm×10 mm×5 mm大小的缺损,研究结果表明,加载BMP-2的复合支架可以更好地促进骨愈合[14]。双嘧达莫(Dipyridamole)是一种具有成骨潜能的腺苷受体间接激动剂。研究发现分别加载双嘧达莫和人重组BMP-2的生物陶瓷支架对于治疗牙槽嵴裂缺损的作用相同。该研究将双嘧达莫加载至3D打印的β-TCP支架上,移植入兔颅骨缺损模型,在24 周时DIPY-3DPBC支架明显促进了兔颅骨缺损的成骨再生,此研究证明DIPY-3DPBC支架策略是一种安全、有效的骨组织工程策略,可以在不影响儿童颅骨生长的情况下用于骨缺损再生[18]。

2.2 牙周膜再生

牙周膜干细胞(PDLSCs)在牙周膜再生领域发挥重要作用。有学者系统地研究了不同浓度的甲基丙烯酰化明胶(gelatin methacrylic acid,GelMA)的打印性能,通过评估不同打印参数,如光引发剂浓度、紫外线照射时间、压力大小等对水凝胶包裹的PDLSCs存活率的影响,从而确定最合适的打印参数。优化后的3D生物打印系统不仅可以提高打印分辨率,保持支架的尺寸稳定性,还能最大程度保持细胞的活力,有助于牙周组织再生治疗[19]。另外国内有研究发现压力可控的3D打印系统可以极大降低材料打印过程中产生的剪切力,并使打印温度维持在一个较低的水平,而不致于使包裹的细胞死亡。这种在细胞层面的3D打印技术可以更好地促进牙周再生[20]。最近一项研究发现,通过调整镁-钙-硅酸盐水泥(Mg-CS)中Mg的含量,对于牙周膜干细胞(periodontal ligament cells,PDLSCs)生物学影响也发生改变,研究发现该复合材料可以刺激PDLSCs向牙周膜以及血管方向分化,是可用于牙周再生的良好生物陶瓷[21]。

近年来,随着定向冷冻铸造、增材制造以及软光刻等技术的进步,精确控制牙周膜(periodontal ligament,PDL)纤维的方向有望实现。研究证明利用定向冷冻浇铸法可以形成斜向牙周膜纤维,该类纤维在牙周膜占比约70%,但形成其他方向的牙周膜纤维仍然需要进一步探索。该方法可以引导生成具有天然牙周膜纤维束特点的牙周膜样结构[22]。

细胞膜片技术(cell sheet engineering)是指将目的细胞在一定条件下进行连续培养,诱使其形成多层细胞,同时使种子细胞在短时间内形成大量细胞外基质,最后无需酶消化便可以得到一张由细胞和细胞外基质构成的完整膜片。该技术与3D打印支架的结合也被用于牙周组织再生。Vaquette等[23]使用熔融沉积制造(fused deposition modeling, FDM)技术打印出PCL支架,并与牙周膜干细胞膜片复合,发现加载细胞膜片的支架比单纯支架更容易附着在牙本质表面。Farag等[24]将牙周膜干细胞膜片脱细胞,进一步降低该类细胞材料的免疫原性,然后将脱细胞的PDLSC膜片与3D打印的PCL支架复合用于牙周再生,发现该复合结构上调了牙周膜干细胞矿化标志物的表达。Bakirci等[25]根据细胞膜片理论,开发了一种用于“无支架3D打印”的生物墨水,将皮肤成纤维细胞体外培养成富含细胞外基质的细胞膜片,膜片成熟后离心制成生物墨水用于3D生物打印。虽然这项研究并未涉及到牙周再生领域,但该方法使得开发新型的牙周膜干细胞生物墨水成为可能。

2.3 牙骨质再生

牙骨质形成也是牙周组织再生重要步骤,牙周膜干细胞和相关的生长因子对于牙骨质再生具有重要作用。研究证明加载牙周膜干细胞和生长因子的3D打印支架可以在人牙根表面形成完整的牙骨质样结构;一些促进牙骨质生成的生物制剂,如血小板衍生生长因子-BB(platelet derived growth factor-bb,PDGF-BB)复合PLGA支架对成牙骨质细胞的活化和牙骨质形成发挥重要作用[26]。Mao等[27]研究表明,纳米生物陶瓷材料可以促进人牙周膜干细胞分化成类牙骨质细胞,形成类似于牙骨质-牙周膜的分层结构。Wang等[1]研究证实牙周膜干细胞膜片复合PRF在HA/β-TCP支架表面形成了牙骨质样结构。目前牙骨质的再生仍然依赖于移植干细胞的增殖、分化或自体细胞激活、归巢等,在空间上如何精确控制牙骨质在牙根表面沉积厚度,值得进一步探讨。

2.4 神经和血管再生

3D打印技术可用于制备新型仿生支架和复杂组织结构模型,其在周围神经缺损的修复和再生方面具有广阔的应用前景,近年来3D多孔神经导管(nerve guide conduit, NGC)支架在周围神经再生领域中成为一个研究焦点。有研究利用3D生物打印技术制备GelMA人工神经导管,导管内壁填充EHS(engelbreth-holm-swarm)水凝胶,结果证实该复合导管能促进周围神经纤维的修复[28]。同样,以聚吡咯(polypyrrole,PPy)和PCL为材料3D成型的多孔的神经导管也具有促进神经细胞和周围神经纤维生长与成熟的作用[29]。除此以外,3D打印技术也被应用于面神经缺损的修复与再生[30]。

最近的研究发现利用3D打印技术可以精确加工血管模型,其可作为治疗血管病变的药物筛选工具,或用于血管再生修复。有研究者将人主动脉平滑肌细胞(aortic smooth muscle cells,ASMCs)接种在纤维蛋白水凝胶上,水凝胶在平滑肌细胞固有的收缩特性的帮助下,形成一个个包裹平滑肌细胞的组织环,这些环状物堆叠形成类似于天然动脉的血管结构[31]。因此,3D打印技术在血管再生领域也有巨大的应用潜力。

2.5 牙周复合体再生

牙周复合体作为牙齿的支持结构,包含有3 种不同的组织,牙骨质、牙周膜和牙槽骨。如何实现3 种类型组织的同时再生,包括定向牙周膜纤维的重新形成,以及如何使其牢固地附着在新的牙骨质和牙槽骨上,是目前牙周再生面临的主要挑战。研究发现多相支架可以更好地模拟牙周复合体的形成。Lee等[32]利用3D打印技术创建了一个PCL-HA多相支架,他们发现将牙髓干细胞(dental pulp stem cells, DPSCs)植入支架后,细胞群能够自动分化为牙骨质、PDL和牙槽骨。Saito等[33]设计出具有不同孔径大小的PCL支架,加载牙周膜干细胞后,用于牙周复合体的再生,发现采用3D打印设计的不同孔径的支架具有诱导不同类型组织再生的特点。

研究表明透明质酸水凝胶支架可以为成骨细胞提供良好的生存环境,同时刺激成骨细胞的矿化基因表达[34]。纤维蛋白水凝胶可以促进成牙骨质细胞或成骨细胞的分化,改性后的纤维蛋白水凝胶,可以在不同矿化组织之间形成纤维附着,具有牙周复合体再生的潜在功能。由于牙周复合体的特殊结构层次,对牙周纤维方向有着严格的要求,因此,将3D打印技术应用于牙周复合体再生需要进一步的深入探索[35]。

3 牙周病教学和医患沟通

随着3D打印技术的进步,快速成型具有逼真形貌的牙周解剖模型成为了可能。以往的牙周教学,学生往往通过理论授课的形式来学习牙周检查和治疗的规范化操作以及进行相关牙周评分的培训等,教学条件好的院校可在仿真头颅模型上进行牙周培训。由于学生缺乏临床经验,在进行临床牙周检查时,常常导致患者不适,比如疼痛和出血等[36]。因此,打印出具有相应牙周组织学特征并能够模拟天然牙龈萎缩、牙槽骨丧失的典型牙周炎缺损模型成为一个更好的选择。在3D打印过程中,可采用多种材料、多种颜色来打印具有复杂三维结构的牙周缺损模型,可以为学生模拟牙周手术提供更加真实的操作体验,加强学生对牙周疾病的正确认识和掌握准确的牙周临床技能[37-38]。国内也有研究者将3D打印的数字化牙周病例数据库应用于牙周教学,并与传统的平面教学和视频教学对于牙周教学的实际效果和学生课堂评价进行对比,最终表明3D打印的数字化病例数据库在教学中的应用,加强了学生对于牙周理论知识的理解, 实践操作也更加熟练[39]。

有研究者成功使用3D打印技术制作出了与临床牙周缺损的真实尺寸模型,方便了患者了解所患牙周病的病变阶段,提高了患者对于牙周治疗的依从性和配合性,从而使牙周医生与病人的沟通交流变得更加容易。此外,国外也有学者采用3D打印技术来打印具有牙龈美学缺陷的牙龈缺损模型,此模型有利于牙周医生的术前规划和手术方案制定[2,40]。

3D打印技术在种植体周围炎的维护方面也有应用,打印的种植体模型便于患者掌握正确的种植体维护方法,从而延长种植体的使用寿命。此外,3D打印的种植体模型辅助患者更加直观的了解种植体的植入程序,有助于减少病人的术前焦虑和恐惧。这些模型也有助于医学生、进修生等在种植体型号选择、种植体植入等方面进行更好的术前模拟[41]。

4 总结与展望

3D打印技术在牙周沟通和教学、牙周临床治疗以及牙周再生领域中具有更加广阔的应用前景,它能够满足医疗产品的个性化设计需求,便于小规模生产,同时能够克服现有的牙周组织再生方法的局限性,构建出更接近天然牙周组织的复杂结构。目前,根据3D打印技术的理念所提出的教学模式已有所研究,在动物实验水平运用3D打印复合支架进行牙周再生也不断取得新的进展,但在临床治疗中仍应用较少,未来3D打印技术将不断联合牙周治疗的新理念新技术,推动牙周领域的进一步发展。