代谢组学在缺血性脑卒中诊断和中药治疗研究中的应用进展

陈怡华，吕文欣，李艺，李萍

（中国药科大学天然药物活性组分与药效国家重点实验室，江苏 南京 210009）

脑卒中又称脑血管意外，是由于脑部血管突然破裂或血管阻塞导致脑组织受损的中枢神经系统疾病，具有发病率高、死亡率高、致残率高的特点[1]。全球疾病负担研究的系统分析显示：在全球范围内，脑卒中是引起死亡的第二大原因，占总死亡人数的11.6%；同时也是引起残疾的第三大原因[2-3]。脑卒中严重威胁了人类的生命安全和生活质量，带来了巨大的经济和社会负担。脑卒中包括缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）和出血性脑卒中（cerebral hemorrhagic stroke，CH），其中IS 的发病率更高，占脑卒中总数的60% ~ 80%[4]。因此，研究IS 的病理生理过程，建立完善的IS 预防、诊断、治疗和预后体系具有重要的意义。

代谢组学是系统性研究代谢物的一种手段，通过研究内源性代谢产物种类、数量的改变及其变化规律，可以全面地表征生物体整体功能状态的变化。目前，代谢组学已广泛应用于生理病理过程研究[5]、疾病诊疗[6-7]、药物机制研究[8-9]等领域，并取得了瞩目成果。在对于IS 的研究中，代谢组学可发现IS生物标志物，有助于IS 的快速准确诊断；代谢组学还适用于中药治疗IS 的研究中，有助于揭示中药治疗IS 的药效物质、配伍原理和作用机制，推动IS诊治体系的进一步发展（见图1）。本文就近年来代谢组学在IS 诊断和中药治疗研究中的应用进展作一综述，以期为IS 诊治体系的进一步发展提供参考。

图1 代谢组学在缺血性脑卒中诊断和中药治疗研究中的应用Figure 1 Application of metabolomics in diagnosis and treatment of ischemic stroke with traditional Chinese medicine

1 文献检索与分析

以“metabolomics”或“metabonomics”或“metabolome”或“metabolic profile”和“stroke”或“cerebral ischemia”或“cerebrovascular accident”为关键词，在PubMed和Web of Science 数据库筛选2011 年1 月至2022年4 月发表的文献，排除综述、评论、会议记录等，共得到118 篇对于IS 进行代谢组学研究的实验性文章。

对上述118 篇文献的基本信息进行初步整理与分析，统计了发表时间、研究对象、研究方式、分析平台、生物样本、研究设计等信息，绘制了IS 代谢组学研究文献统计分析图。IS 代谢组学的研究呈逐年增多的趋势（见图2A），其中52 篇文章使用IS 患者的样本进行代谢组学分析，65 篇文章分析了IS 动物模型产生的样本，1 篇文章对IS 患者和动物样本同时进行了分析[10]。IS 代谢组学研究中，研究方式以非靶向研究居多，部分文献使用了靶向研究方式或非靶向结合靶向研究；研究平台以液相色谱-质谱联用（LC-MS）为主，其次是核磁共振（NMR）。从IS 患者中获得的研究样本多为血液，部分为尿液，个别文献对脑血栓组织进行了代谢组学分析[11-12]。对IS 动物模型进行的代谢组学研究中，血液、脑组织是使用较多的样本，尿液、脑脊液也得到一定的研究（见图2B）。

图2 缺血性脑卒中代谢组学研究文献统计分析图Figure 2 Statistical analysis of literature on metabolomics for ischemic stroke

对IS 患者进行代谢组学研究的52 篇文章中，有18 篇就IS 的诊断进行了研究讨论[13-30]，13 篇形成了用于IS 诊断的生物标志物模型（见表1）。对IS 动物模型进行代谢组学研究的65 篇文章中，有46 篇与中药活性成分、中药提取物或中药制剂治疗IS 相关。

表1 代谢组学在缺血性脑卒中诊断研究中的应用Table 1 Application of metabolomics in diagnosis and treatment of ischemic stroke

2 代谢组学在缺血性脑卒中诊断研究中的应用

由于IS 发病后病情紧急、病灶隐匿，对IS 患者进行快速准确的评估、诊断和再灌注治疗至关重要。目前，IS 的临床诊断主要依靠对患者病史、身体询问，以及通过计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）、经颅多普勒超声等手段对神经系统进行检查[31]。然而，这些检查过程复杂、耗时长、成本高，并且由于患者的病情紧急可能无法及时进行，可用性有限。

脑缺血会导致脑组织局部代谢和全身代谢的改变，为IS 的诊断提供了新的思路。通过代谢组学识别和监测IS 过程中存在的生物标志物，将有助于IS的诊断、预后和治疗策略的制定。如表1 所示，已有多项基于IS 患者的代谢组学研究，并报告了一系列与IS 诊断相关的生物标志物。

2.1 代谢组学用于发现缺血性脑卒中诊断生物标志物

在急性脑卒中的情况下，理想的生物标志物将能够准确、快速、客观地诊断疾病；代谢组学能以高通量方式检测到可以穿过血脑屏障的代谢物，是发现IS 生物标志物的有力工具。

Jiang 等[13]使用超高效液相色谱-飞行时间质谱（UPLC-TOF-MS）获得了67 名IS 患者和62 名健康对照者（normal control，NC）的血清代谢谱；通过多变量统计分析，将单碳循环中的一系列内源性代谢物如叶酸、半胱氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸和氧化型谷胱甘肽，确定为IS 的潜在生物标志物；建立了基于偏最小二乘-K 最近邻算法（PLS-KNN）的预测模型来区分IS 患者和NC，平均准确率达到100%。Liu 等[14]对包含80 个人血清样本（40 个IS和40 个NC）的训练集进行全局代谢分析，确定了26 种代谢物的显著变化。在此基础上，使用多种算法过程建立了一种由丝氨酸、异亮氨酸、甜菜碱、PC（5∶0/5∶0）和LPE（18∶2）组成的IS 生物标志物模型，表现出将IS 与NC 区分开的潜力。在训练集和测试集中，该模型受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线下面 积（area under curve，AUC）分别为0.988 和0.971，模型的敏感性和特异性较好。Wang 等[15]招募了40 名IS患者和29 名性别年龄匹配的NC，进行血清代谢组学研究。该研究结果显示，与NC 相比，IS 患者血清代谢谱表现出显著的扰动，主要与氨基酸代谢相关；酪氨酸、乳酸和色氨酸被筛选为一组潜在的IS生物标志物，具有通过分类和回归树（classification and regression tree，CRT）诊断IS 的高精度（91.7%）表现。Huang 等[16]对30 名IS 患者和17 名NC 的血浆样品进行UPLC-Q/TOF-MS 分析，获得了8 种IS 生物标志物，包括鞘氨醇、2-酮丁酸、十四烷二酸、二十二碳三烯酸、谷氨酰胺、植物鞘氨醇、LPE（0∶0/22∶0）和焦谷氨酸。ROC 结果显示，8 个生物标志物的AUC 均大于0.7，用于IS 早期诊断的准确率、特异性和敏感性均较高。Sun 等[17]从30个IS 和30 个NC 血清代谢谱中，鉴定出12 种具有显著变化的代谢物。对这些代谢物的多元逻辑回归分析研究显示，尿酸、鞘氨醇和肾上腺素乙醇酰胺被筛选为IS 的潜在生物标志物，三者构成的模型ROC 曲线的AUC 为0.941。

改革开放以来，农村发生了翻天覆地的变化，越来越多的中青年劳动力涌入城市发展，然而他们的孩子却在农村成了“留守儿童”。留守儿童问题已成为全社会关注的关乎中国未来和谐发展的重要问题，亟待解决。希望通过这篇调查研究，能够给人们一些启示，唤起全社会对义务教育阶段农村留守儿童的重视，使农村孩子的教育问题得到改善。

使用MetaboAnalyst 工具对已报道的IS 诊断生物标志物进行代谢途径分析（见图3），显著富集到氨酰-tRNA 生物合成，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢及半胱氨酸和蛋氨酸代谢等代谢途径中，这些代谢途径与IS 的发生发展密切相关。代谢组学研究为IS 的病理过程和临床诊断提供了新的见解，建立的生物标志物模型具有临床应用的潜力，为未来IS的诊断或治疗策略的开发提供了基础。

图3 用于缺血性脑卒中诊断的生物标志物的代谢途径分析图Figure 3 Pathway analysis of biomarkers for ischemic stroke diagnosis

2.2 代谢组学用于区分缺血性脑卒中和相似疾病

IS 与CH 通常具有一些共同的临床表现，例如偏瘫、失语和其他神经功能缺损等；在循环代谢中也有相似的特征，比如精氨酸水平升高。然而，IS和CH 的病理起源不同，治疗策略差异也很大，甚至截然相反。因此，由于发病机制、治疗和预后的显著差异，对IS 与具有相似症状的疾病进行快速准确地区分和诊断至关重要。

Hu 等[23]靶向测定了129 名IS 患者和73 名CH患者干血斑样品中氨基酸和肉碱的含量。该研究结果发现，与CH 相比，IS 患者血液中天冬酰胺、瓜氨酸、亮氨酸等多个氨基酸含量显著升高。该模型包含天冬酰胺、甲基巴豆酰肉碱、精氨酸/鸟氨酸、缬氨酸/苯丙氨酸和组合肉碱/瓜氨酸6 个参数，AUC 为0.873，并且在40 名IS 患者的独立集合中，准确预测率达到79.07%。这些结果表明，量化6 种氨基酸和6 种肉碱代谢物对于区分IS 和CH 具有一定的帮助。Sun 等[24]对38 名诊断明确的IS 患者和46 名有眩晕头痛症状的非卒中患者进行了靶向代谢组学研究，共测量了58 种代谢物，通过模式识别算法进行分析发现酰基肉碱是区分IS 和眩晕患者的主要代谢物，精氨酸及尿素循环代谢物对IS 和眩晕患者的区别也有一定的贡献。基于数据模式重组的特征，使用二元逻辑模型建立了包含精氨酸、精氨酸/鸟氨酸、瓜氨酸/精氨酸、十八碳烯酰肉碱、羟基丁酰肉碱和棕榈酰肉碱在内的生物标志物模式，在IS 鉴别诊断中AUC 为0.89。Tiedt 等[25]研究了早期代谢变化在区分IS 和卒中模拟病（stroke mimics，SM）中的效用，结果表明对称二甲基精氨酸、不对称二甲基精氨酸、硫酸孕烯醇酮和腺苷在区分IS 患者和SM 患者方面表现出很高的准确性。这4 个代谢物在验证样本中AUC 为0.90，甚至优于常规诊断中使用的多模式颅脑CT（AUC =0.80）。

这些研究为区分IS 和其他具有相似症状的疾病提供了新的依据，上述氨基酸和肉碱的含量与比例在IS 快速准确的鉴别诊断中具有潜在的应用价值。

3 代谢组学在中药治疗缺血性脑卒中研究中的应用

组织纤溶酶原激活剂（tissue plasminogen activator，t-PA）是目前唯一获得美国食品和药品管理局（FDA）批准的用于急性IS 患者的治疗剂，然而t-PA 在使用中存在治疗窗狭窄的局限性、再灌注损伤引起的不良反应和出血转化等潜在风险[32-33]。目前，临床上尚无用于IS 综合治疗的有效药物，寻找和发展抗IS 的有效药物和治疗策略迫在眉睫。中药具有多成分、多靶点、多途径的作用特点，在综合治疗IS 方面具有显著优势[34-36]。多种中药（如丹参、川芎等）、中药复方[如黄连解毒汤（Huang-Lian-Jie-Du-Decoction，HLJDD）、补阳还五汤等]、中成药[如安宫牛黄丸、七十味珍珠丸（Qishiwei zhenzhu pills，QSW）等]和中药提取物（如银杏叶提取物、蒺藜总皂苷等），已被报道可以通过抗炎、抗氧化、抗凋亡、抑制兴奋毒性等途径发挥神经保护作用，改善IS 引起的脑损伤[37-39]。这些中药在临床应用中疗效显著，但药效物质基础和作用机制尚不够明确，限制了其进一步的发展。

代谢组学能够从整体水平研究病理状态下和药物干预后内源性代谢物种类、数量的改变及其变化规律，从而系统地解析疾病发生发展与药物治疗作用的复杂机制。代谢组学集整体性、动态性、综合性分析于一体，符合中医药治疗的整体观、辩证观，在中药治疗IS 的研究中应用愈来愈多。

3.1 代谢组学用于中药治疗缺血性脑卒中的药效物质研究

中药药效物质研究是阐释中药整体功效及作用本质的核心环节，在开发中药相关产品、指导中药临床应用等方面具有重要意义，代谢组学在中药的整体作用评价和药效物质研究中具有潜力和适用性[40]。HLJDD 由黄连、黄芩、黄柏和栀子4 味中药组方构成，是著名的清热解毒方剂，已在中国和亚洲其他国家的中医临床实践中用于治疗IS。Zhang 等[41]为探讨HLJDD 中4 味中药治疗IS 的最佳药物比例和协同机制，采用正交实验设计，使用全局代谢组学结合相关网络分析的方法，证明HLJDD 的最佳比例为6（黄连）∶4（黄芩）∶1（黄柏）∶3（栀子）。代谢组学的综合效应评价和病理指标评估均显示出，这一配伍比例对大鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型具有最强的治疗效果。

Zhang 等[42]使用代谢组学的方法进一步探讨HLJDD 和其中3 个主要成分黄连素、黄芩苷和栀子苷对IS 的治疗作用和机制。通过使用质子核磁共振（1H-NMR）的代谢组学方法描绘了MCAO 大鼠血清和脑提取物的代谢谱变化，结合相关网络分析，揭示了HLJDD、黄连素、黄芩苷和栀子苷通过改善代谢紊乱和调节氧化应激、神经元自噬和炎症反应来治疗IS 的有效性。该研究初步证明了黄连素、黄芩苷和栀子苷是HLJDD 发挥抗IS 作用的部分药效物质，基于这三者的抗IS 药物具有开发潜力。

3.2 代谢组学用于中药治疗缺血性脑卒中的配伍原理研究

冰片是一味芳香开窍中药，具有芳香走窜、引药上行的作用特点。在IS 等心脑血管疾病的治疗中，冰片常与其他中药配伍使用，形成了麝香-冰片、丹参-冰片、川芎-冰片等君使配伍组合，开发了醒脑静注射液、丹参片、速效救心丸等多种药物。代谢组学研究有助于探讨君使药对的配伍机制，为中药治疗IS 的配伍原理和引经理论提供了研究思路和方法。李欢等[44]基于气相-质谱联用（GC-MS）的代谢组学获得了麝香-冰片配伍干预脑缺血再灌注大鼠的血浆代谢物图谱，从代谢调节的角度初步揭示了麝香-冰片配伍发挥脑保护作用的潜在机制。与MCAO 大鼠相比，麝香-冰片配伍给药后血浆中类脂类和氨基酸类代谢物的含量明显升高，总体血浆代谢表型往正常大鼠代谢状态的方向发生改变；表明麝香-冰片配伍干预能调节MCAO 大鼠的氨基酸代谢途径，并纠正整体代谢网络的紊乱，为麝香-冰片配伍治疗IS 提供了科学依据。Duan 等[45]进行了代谢组学结合病理学研究，评价了丹酚酸B 及丹酚酸B-冰片的神经保护作用，并初步阐述了丹酚酸B-冰片配伍的科学内涵和作用机制。该研究表明，丹酚酸B 可通过改善能量代谢、脂质代谢、炎性反应和氧化应激来改善MCAO 引起的脑缺血损伤；冰片配伍可以增强丹酚酸B 的神经保护作用，其作用可能与减弱脑缺血大鼠鞘脂代谢途径有关。

刺五加和天麻均是广泛用于治疗IS 的中药。通过数据挖掘和基于德尔菲法的专家问卷调查分析，Zhou 等[46]发现刺五加-天麻组合具有治疗IS 的临床和药用价值；但刺五加配伍天麻的联合治疗IS 的效果并未得到验证，作用机制也尚不明确。Lin 等[47]通过进行转录组学与代谢组学的结合分析发现，刺五加-天麻可以通过靶向调节苯丙氨酸代谢、嘧啶代谢、鞘脂代谢和蛋氨酸代谢等途径来预防大鼠脑缺血再灌注损伤，为刺五加和天麻的功效与配伍使用提供了数据支撑，为刺五加-天麻的进一步组合开发提供了科学依据。

3.3 代谢组学用于中药治疗缺血性脑卒中的作用机制研究

中药具有多成分、多靶点、多途径的治疗特点，中药的整体性作用在单一机制的药理模型和分子水平上难以得到全面的展示。代谢组学通过分析内源性代谢物的变化规律，筛选与疾病和药物作用相关联的代谢标志物及代谢途径，在揭示中药治疗疾病的作用机制方面具有重要作用。

Li 等[48]使用1H-NMR 的代谢组学方法探讨了何首乌对MCAO 大鼠的保护作用，并阐明其潜在作用机制。该研究发现IS 大鼠脑组织中葡萄糖、蛋氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、富马酸等代谢物的含量显著增加，而谷胱甘肽（GSH）、N-乙酰天冬氨酸（NAA）、烟酰胺、尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-葡萄糖）、抗坏血酸等含量显著降低；低剂量和高剂量的何首乌治疗可部分逆转这些受干扰代谢物的含量变化，提示其可通过调节能量代谢和氨基酸代谢、减轻氧化应激和炎症，来改善IS 引起的缺血再灌注损伤。Wang 等[49]通过血浆代谢组学研究天麻对IS 大鼠的保护作用和治疗机制，基于UPLC-Q/TOF-MS 检测到43 种与天麻治疗相关的血浆代谢物。天麻治疗后IS 大鼠血浆中花生四烯酸、L-组氨酸、鞘氨醇、胸腺嘧啶、亚精胺和脱氧胞苷的含量发生显著回调，表明天麻可通过调控花生四烯酸代谢、组氨酸代谢、嘧啶代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、鞘脂代谢和甘油磷脂代谢等途径来改善大鼠脑缺血再灌注损伤。

参归三圣散（Shengui sansheng san，SSS）是由人参、当归、肉桂配伍组成的中药名方，用于抗IS 治疗已有300 多年的历史。Luo 等[50]对MCAO大鼠脑脊液进行代谢组学研究，共鉴定出88 种内源性代谢物，主要参与柠檬酸循环、脂肪酸生物合成、氨基酸代谢等代谢途径。经SSS 处理后脑脊液中柠檬酸盐含量显著增加，表明SSS 抗IS 机制可能与柠檬酸循环有关。结合脑组织中葡萄糖转运蛋白（GLUT1、GLUT3）、单羧酸转运蛋白（MCT1）、乙酰辅酶A 合成酶（ACS）和柠檬酸合成酶（CS）的表达变化，发现SSS 干预可促进柠檬酸循环，增强葡萄糖的供应、运输和利用，进而产生大量的腺嘌呤核苷三磷酸（ATP），改善缺血后脑组织的能量缺乏，发挥改善神经功能的抗IS 作用。脑心通由黄芪、赤芍、丹参、当归、川芎等16 味中药组成，临床上广泛用于治疗脑血管和心血管疾病。Liu 等[51]基于UPLC-Q/TOF-MS 的血浆代谢组学研究，通过多变量和单变量统计分析，确定了MCAO 大鼠血浆中28 个生物标志物，显著富集到单胺类神经递质代谢、脂质代谢、氨基酸代谢等途径。其中，谷氨酰胺、PE（17∶0）和多种溶血磷脂酰乙醇胺水平在脑心通给药后显示出回归正常的趋势，提示脑心通可能通过调节谷氨酰胺代谢和脂质代谢发挥抗IS 作用。QSW 是著名的藏药制剂，由珍珠、檀香、降香、西红花、牛黄、麝香等加工制成，具有安神镇静、通经活络、调和气血、醒神开窍的功效，临床常用于治疗卒中、癫痫等中枢神经疾病。QSW 配方复杂，有效物质和作用机制尚不清楚。Xu 等[52]通过GC-MS 代谢组学研究了QSW 对大鼠脑缺血再灌注的保护作用和潜在机制，共鉴定出甘油、肉豆蔻酸、1-甲基-2-吡咯烷酮等11 种受QSW 影响的血浆差异代谢物，提示QSW 可能通过调节脂质代谢、脂肪酸代谢等途径发挥保护大脑、神经元和神经胶质细胞的抗IS 作用。

除此之外，还有文献报道了使用代谢组学研究刺五加叶[53]、黄连解毒汤[54-55]、脑得生[56-57]、苦碟子注射液[58-59]等中药或中药制剂治疗IS 的潜在作用机制。

4 结语与展望

IS 是一种病理机制复杂的中枢神经系统疾病，严重威胁了人类的生命安全和生活质量。通过代谢组学的研究，挖掘出了多种用于IS 诊断的生物标志物，建立了多个IS 与其他相似疾病区分的模型，推动了IS 快速、准确诊断的发展[60]。代谢组学还应用于单味中药、中药药对及中药复方治疗IS 的研究中，充分发掘了中药抗IS 的药效物质基础、配伍原理和作用机制，推动了中药防治IS 的进展。代谢组学技术在IS 诊断和中药治疗研究中取得了重要的成果，有助于完善IS 预防、诊断、治疗和预后体系的建立。

然而，代谢组学在疾病和药物研究中仍有发展的空间。首先，由于不同的研究者在进行代谢组学研究时使用的检测技术和数据分析方法存在差异，使得数据之间的交流和集成整合变得比较困难。因此，建立标准化的代谢组学研究流程和完善的代谢物数据库是十分有必要的。其次，代谢组学只能解决药物药效机制研究中的一部分问题，需要与药理学、生物信息学等其他学科交叉联用来获得更加全面综合的理解。“功能代谢组学”通过对差异代谢物及其上下游相关的酶、基因等进行功能验证，更好地阐释了生物学分子本质，更全面地反映了机体的状态，为疾病诊疗及药物机制研究提供了新的思路和方法。未来，随着代谢组学分析检测技术的发展和数据集成整合方法的进步，代谢组学在其他疾病和药物研究领域中势必取得更大的进展。