miR-134-5p、miR-34a、CCL20预测肺癌根治术后复发的价值

李静 李志娜 田浩印 李万刚 李杨

非小细胞肺癌 (non small cell lung cancer,NSCLC)为常见的肺癌类型,死亡率较高[1]。其病因主要有吸烟、遗传、电离辐射及大气污染等[2]。早期表现为胸部胀痛、痰血、低热及咳嗽等,晚期则伴有乏力、呼吸困难及咯血等症状[3]。首选外科手术对其治疗,但术后仍有大量患者出现转移或复发,预后欠佳[4]。因此,寻找可精确预测术后复发的血清指标,对预后判断和术后辅助治疗的选择意义较大。血清微小核糖核酸-134-5p(miRNA-134-5p,miR-134-5p)位于14号染色体,是非编码调控RNA,参与细胞发育、分化等,与肿瘤等疾病关系密切[5]。趋化因子20(chemokine20,CCL20)基因位于2q36.3,参与免疫调节[6]。研究表明[7],CCL20可影响肺癌等肿瘤的发生,其对肿瘤免疫反应起到抑制作用,促进癌症发生发展。血清微小核糖核酸-34a(miRNA-34a,miR-34a)可影响血管生成,在大量恶性肿瘤中异常表达,如结肠癌、肺癌等[8]。因此本研究探讨NSCLC患者血清miR-134-5p、CCL20及miR-34a表达情况,分析三者对NSCLC患者肺癌根治术后复发的预测价值。

资料与方法

一、一般资料

1 选取河北中石油中心医院2018年1月—2020年1月收治的符合条件的90例非小细胞肺癌(NSCLC)患者作为研究对象,所有患者均在我院接受胸腔镜下肺癌根治术治疗,术后接受24个月的电话或门诊随诊检查,经病理学检查发现患者出现与原发病灶有关的肿瘤转移病灶或肺部出现新的癌症病灶,其中出现复发的患者61例(复发组)、未出现复发的患者29例(对照组)。纳入标准:(1)患者年龄范围19～79岁。(2)NSCLC患者的诊断标准参考《CSCO 2015年肺癌诊疗指南》[9]中关于非小细胞肺癌的诊断标准。(3)所有NSCLC患者均为初诊患者,在我院接受根治性手术治疗,术后愿意接受随访观察。(4)术前经胸部CT、MRI检查证实病情,术后经病理学检查证实。(5)患者术前纤维支气管镜取活组织病检或术后病理学检查:TNM分期Ⅰ～Ⅲ期。(6)研究方案符合医学伦理委员会规定(KYLL-2022-16),并获得研究对象及其家属知情同意。排除标准:(1)已经发生远处转移的患者或既往有放化疗病史。(2)合并严重的肺部其他类型基础疾病(肺栓塞、肺纤维化、矽肺、支气管哮喘等)。(3)伴有严重心衰(NYHA)≥Ⅲ级、急性心肌梗死、脑血管疾病。(4)合并其他系统的重大疾病等。

2 指标检测方法 CCL20检测:采集复发组及对照组术前1周以内的空腹静脉血5 mL,采用EDTA对血液进行抗凝,离心半径10 cm,以2500 r/min的速度进行离心10 min,取上清液,保存在-20℃的冰箱内待检。采用ELISA法检测血清CCL20,按试剂盒说明操作。采用美国赛默飞 Multiskan Ascent型酶标仪对血清样品450nm处吸光度值进行检测,计算相应样品的浓度。血清miR-134-5p检测,采集复发组及对照组术前空腹静脉血5mL,采用Trizol法提取两组血清总RNA,用40 μL DEPC水溶解。当260nm与280nm处的吸光度比值为1.8～2.1时,表明合格。采用荧光定量PCR法对miR-134-5p表达量进行检测。反应体系:包括cDNA 2 μL,上下游引物各0.5μL,2×SYBRGreenmix10 μL,无RNA酶水7 μL。以U6为内参,用2-ΔΔct法对miR-134-5p相对表达量进行计算。采用RT-PCR法检测miR-34a相对表达量,采集复发组及对照组术前空腹静脉血5mL,保存于抗凝管内,以3000 r/min的速度离心,离心时间为10 min,半径10 cm。取上清液,于-80°冰箱内保存。用试剂盒提取血清内总RNA,用反转录试剂盒将其反转录为cDNA,以此cDNA为模板行PCR扩增。采用2-ΔΔct计算miR-34a标准化后的表达水平。肺癌TNM分期[10]为:T表示原发肿瘤大小,N表示淋巴结转移,M表示肺癌有远处转移。依据情况分成Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期。Ⅰ期:肿瘤≤5 cm,且无淋巴结转移。Ⅱ期:肿瘤为5～7 cm,但不伴淋巴结转移,或仅有N1淋巴结转移。Ⅲ期:肿瘤伴有N1、N2或N3淋巴转移。Ⅳ期:患有肺癌后没有正确治疗,只要发生癌细胞远处转移,即为Ⅳ期肺癌,即晚期肺癌。

二、统计学方法

结 果

一、两组患者术前血清miR-134-5p、miR-34a、CCL20水平比较

复发组患者术前的血清miR-134-5p水平显著低于对照组(P<0.05),复发组患者术前血清miR-34a和CCL20水平显著高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 两组患者术前血清miR-134-5p、miR-34a、CCL20水平比较

二、术前血清miR-134-5p、miR-34a、CCL20预测NSCLC患者根治术后复发的价值

以术前血清miR-134-5p、miR-34a、CCL20水平作为预测变量绘制ROC曲线,结果显示术前血清miR-134-5p、miR-34a、CCL20预测NSCLC患者术后复发的ROC曲线下面积AUC值分别为0.783(95%CI:0.670～0.897)、0.656(95%CI:0.537～0.775)、0.675(95%CI:0.563～0.787)(P均<0.05),说明其具有一定的预测价值(图1)。

图1 A:术前血清miR-34a、CCL20水平预测NSCLC患者术后复发的ROC曲线;B:术前血清miR-134-5p水平预测NSCLC患者术后复发的ROC曲线

三、两组患者一般临床资料比较

对比复发组患者和对照组患者的年龄、BMI、吸烟、饮酒、性别、合并疾病、肺癌家族史等情况,两组差异不具有统计学意义(P>0.05)(表2)。

表2 两组患者一般临床资料比较

四、两组患者病理学特征及部分实验室指标比较

复发组TNM分期≥Ⅱ期患者占比75.41%,高于对照组的51.72%,复发组患者肿瘤低分化患者占比42.62%高于对照组的17.24%,复发组患者发生淋巴结转移患者占比62.30%,高于对照组37.93%,复发组患者切缘阳性患者45.90%高于对照组的20.69%,上述指标差异均具有统计学意义(P<0.05)(表3)。

表3 两组患者病理学特征及部分实验室指标比较[n(%)]

五、miR-134-5p、miR-34a、CCL20与NSCLC患者根治术后复发的多因素分析

以NSCLC患者的TNM分期(<Ⅱ期=0,≥Ⅱ期=1)、肿瘤低分化程度(高+中分化=0,低分化=1)、淋巴结转移情况(否=0,是=1)、切缘阳性情况(否=0,是=1)、血清miR-134-5p、miR-34a、CCL20水平作为自变量,以患者是否发生术后复发作为因变量(否=0,是=1),Logistic结果显示:NSCLC患者术前miR-134-5p降低、miR-34a增高、CCL20增高、TNM分期≥Ⅱ期、淋巴结转移阳性是其术后复发的独立危险因素(P<0.05)(表4)。

表4 Logistic回归因素模型

讨 论

NSCLC在肺癌中占比极高,其发病率高、死亡率高且预后差[11]。其主要受遗传、大气环境及不良生活习惯所影响[12]。其早期有胸痛、咳嗽、咳痰等表现,晚期常表现为咯血、呼吸困难等症状[13]。临床常用手术对其治疗,但术后容易出现复发,预后欠佳。为此,临床亟待寻找可精确评估术后疗效的预测指标。miR-134-5p参与肿瘤细胞的发生发展,可反映病程进展[14]。CCL20参与炎症及免疫调节过程,其经过促进髓源性抑制细胞等细胞的作用,对肿瘤免疫反应进行抑制[15]。miR-34a可在肺癌等多数恶性肿瘤内异常表达[16]。因此本研究采用三者对NSCLC患者术后复发的预测价值进行探究。

本研究结果显示,复发组患者术前的血清miR-134-5p水平显著低于对照组,复发组患者术前血清miR-34a、CCL20水平显著高于对照组。术前血清 CCL20含量显著高于对照组,说明血清CCL20高表达的患者出现肿瘤复发的可能性较高。CCL20为巨噬细胞炎症蛋白-3α,是小细胞因子CC基因的亚家族[17]。当肿瘤出现复发时,会造成其水平增高,因此其可作为预测NSCLC患者术后复发的关键血清指标[18]。miRNA是非编码RNA分子,主要经过转录来调控基因表达,在肿瘤、免疫及感染等多种疾病中发挥作用。miR-134-5p于肺癌、结直肠癌等肿瘤内异常表达,可经过调控抑癌基因表达,进而对肿瘤发生发展造成影响。本研究结果显示,NSCLC组血清 miR-134-5p相对表达量比对照组显著降低,可能受miR-134-5p表观遗传学修饰影响。有研究[19]表明,长链非编码RNA可经过甲基化修饰,抑制miR-134-5p表达,致使细胞出现上皮间质转化,促使肿瘤恶性发展[20]。miR-34a为是 miR-34家族中一员,共有22个碱基,此基因定位1p36.23 上,与细胞周期、凋亡等生物学行为密切相关。研究表明[21]miR-34a可负向调控蛋白表达,阻止癌细胞生长、增殖。本研究显示,复发组患者血清中miR-34a呈高表达,提示其可作为评估NSCLC复发的肿瘤指标。本研究结果表明,术前血清miR-134-5p、miR-34a、CCL20预测NSCLC患者术后复发的ROC曲线下面积AUC值分别为0.783、0.656、0.675,说明术前血清miR-134-5p检测对NSCLC患者术后复发的预测价值较高,可作为评估术后复发的关键血清指标。

本研究对两组患者的病理学特征及部分实验室指标进行比较,结果显示,复发组TNM分期≥Ⅱ期患者占比、肿瘤低分化患者占比、淋巴结转移患者占比、切缘阳性患者占比均高于对照组。进一步的多因素回归分析结果显示NSCLC患者术前miR-134-5p降低、miR-34a增高、CCL20增高、TNM分期≥Ⅱ期、淋巴结转移阳性是其术后复发的独立危险因素。低分化相比于中高分化的肿瘤恶性程度高,因此复发率相对较高[22]。TNM分期是应用最为广泛的肺癌分期方法,TNM分期越高,肿瘤进展程度越高,越容易复发。NSCLC主要依靠淋巴系统和血液进行转移,淋巴结转移同样提示肿瘤进展程度较高,因此淋巴结转移也是NSCLC术后复发的影响因素[23]。Logistic回归分析的结果进一步说明了miR-134-5p、miR-34a、CCL20与NSCLC患者术后复发有关。miR-134-5p可抑制癌基因表达,肿瘤出现时miR-134-5p下调可造成BTG-2高表达,致使肿瘤增殖及转移能力增强[24]。有研究表明[25],术前血清miR-34a高表达可以使肿瘤增殖分化,是肺癌患者术后出现复发的危险因素之一,同样说明患者术前血清miR-34a表达量的检测有利于评估复发及预后状况。

综上所述,术前血清miR-134-5p、miR-34a、CCL20预测NSCLC患者术后复发有一定的价值,miR-134-5p价值更高,且均与患者术后复发具有密切关系。