基于网络药理学和分子对接探究桂枝茯苓丸治疗异位妊娠的作用机制*

刘颖,张天婵,2,张梦颖

1.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040; 2.黑龙江中医药大学附属第二医院,黑龙江 哈尔滨 150001

异位妊娠是受精卵留滞于子宫体腔以外部位不断发育的过程,着床位置可以在宫颈、输卵管和卵巢,也可以在腹腔、阔韧带以及剖宫产瘢痕部位,其中在输卵管部位着床更为常见,占比为90%～95%[1]。尽管异位妊娠的发病机制尚未完全明确,但多数情况下与吸烟、性传播疾病、流产手术、辅助生殖技术、输卵管病变(如囊肿、炎性浸润、先天发育不良)以及盆腔炎症等诱因有关[2]。作为妇产科常见的急腹症之一,异位妊娠的典型症状常表现为停经、下腹疼痛和阴道不规则出血,而随着病程的进展出现孕囊破裂、腹腔内大量出血等情况,进而会引起失血性休克等并发症,严重危害着女性的生命健康,因此,及时确诊和治疗十分必要。目前,临床治疗方法主要包含期待治疗、药物保守治疗以及手术疗法,方法的选择取决于患者的身体状况和个人意向[3],对于未孕并有强烈生育需求且符合保守治疗条件,生命体征平稳、血流动力学稳定的患者更倾向于选择药物保守治疗。西医通常选择单纯或联合应用甲氨蝶呤和米非司酮达到保守治疗的目的[4],而中医则认为气血失和运行不畅,脉络瘀阻致少腹血瘀为本病病因,选择从活血化瘀出发辨证施治[5]。

经方桂枝茯苓丸乃活血化瘀之方,出自东汉医家张仲景所著的《金匮要略》:“妇人宿有癥病,经断未及三月,而得漏下不止,胎动在脐上者,为癥痼害。妊娠六月动者,前三月经水利时,胎下血者,后断三月下血也。所以血不止者,其癥不去故也。当下其癥,桂枝茯苓丸主之。”方含桃仁、桂枝、茯苓、牡丹皮和赤芍,共奏活血化瘀,缓消癥块之效[6],主要应用于瘀血留滞于胞宫,妊娠胎动不安、漏下不止等病症,可以用于治疗痛经、卵巢囊肿、盆腔淤血综合征、子宫肌瘤和异位妊娠等疾病[7]。中医认为异位妊娠属 “癥瘕”“少腹血瘀”,越来越多的医家在选择药物保守治疗异位妊娠时使用桂枝茯苓丸随证加减,或联合应用西药甲氨蝶呤、米非司酮,或配合使用其他活血消癥方药以提高疗效。在充分了解患者健康状况并密切观察病情变化的情况下,李洪艳[8]使用桂枝茯苓丸联合活血消癥汤治疗异位妊娠,患者血清β-HCG水平明显下降,症状体征改善显著,不良反应发生减少。刘春杰[9]使用桂枝茯苓丸加疏肝理气、活血止血之品达“气行则血行”的目的,治疗4例异位妊娠患者发现患者腹痛、阴道出血等症状皆逐渐消失,4周左右包块消失,月经恢复正常。刘三连等[10]应用杀胚药物甲氨蝶呤联合桂枝茯苓胶囊治疗要求保守治疗的患者,与单纯应用甲氨蝶呤对比,联合用药能显著减少血清β-HCG恢复正常的时间,促进包块吸收,陈旧性异位妊娠发生概率下降,疗效显著。

桂枝茯苓丸应用于临床治疗异位妊娠效果较好,但药物成分复杂,作用靶点众多,其作用机制尚不清楚,因此本研究使用网络药理学和分子对接技术从不同的角度探索桂枝茯苓丸干预异位妊娠的潜在作用机制,为临床治疗提供科学依据,以期为未来的深入研究提供参考。

1 资料和方法

1.1 经方桂枝茯苓丸中药物有效成分及其作用靶点的筛选和获取应用中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,https://tcmspw.com/tcmsp.php)在“Herb name”词条下输入关键词“Guizhi” “Fuling”“Mudanpi”“Taoren”“Chishao”进行检索,以化合物口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和类药性指数(drug-likeness,DL)≥0.18为筛选标准,分别获取组方内五味中药的有效成分,并基于TCMSP检索有效成分相应作用靶点。在Uniprot数据库的UniProt KB词条下,以“Human”和 “Reviewed”为标准锁定,从而得到基因symbol的注释文件,通过Perl语言5.32.1.1软件对获取的五味药物的有效成分和作用靶点进行合并、分析和整理,并使用获得的基因symbol的注释文件对其进行注释。

1.2 异位妊娠疾病相关靶点的筛选利用中国知网翻译出异位妊娠的检索词“ectopic pregnancy”,在DrugBank(https://go.drugbank.com/)、PharmGkb(https://www.pharmgkb.org/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)、治疗靶点数据库(therapeutic target database,TTD,https://db.idrblab.net/ttd/)和在线人类孟德尔遗传数据库(online mendelian inheritance in man,OMIM,https://www.omim.org/)五大数据库中用该关键词检索并获得与异位妊娠有关的靶点,在R语言4.2.2软件中分析整理并获得结果来绘制Venn图。

1.3 桂枝茯苓丸治疗异位妊娠潜在靶点的获取将经过筛选得到的桂枝茯苓丸有效成分的作用靶点的文件以及异位妊娠疾病靶点的文件导入R语言4.2.2软件,绘制Venn图,取交集得到桂枝茯苓丸治疗异位妊娠的潜在靶点。

1.4 中药复方调控网络的构建应用Perl语言5.32.1.1软件对药物有效成分及作用靶点、异位妊娠疾病总靶点及桂枝茯苓丸治疗异位妊娠的潜在靶点这三项信息进行处理,将软件整理过的文件导入Cytoscape_v3.9.1软件中形成中药复方调控网络,使用CytoNCA插件对网络中节点进行拓扑分析,计算需要的参数并将得到结果进行排序,经过筛选获得关键化合物,为后续操作做准备。

1.5 蛋白质互作网络(protein-protein interaction networks,PPI)的构建与分析在STRING蛋白质相互作用分析数据库(https://cn.string-db.org/)在线平台“Multiple Proteins”词条下导入桂枝茯苓丸治疗异位妊娠的潜在靶点,种属选择“Homo sapiens”,将“minimum required interaction score”设置为0.95,忽略游离点位,下载PPI蛋白互作网络关系并保存“tsv”文件。在Cytoscape_v3.9.1软件内打开“tsv”文件,选择CytoNCA插件对网络进行拓扑分析,获得靶点节点相关参数,应用R语言4.2.2软件过滤,经筛选得到PPI网络中的核心靶点。

1.6 富集分析应用David数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对桂枝茯苓丸治疗异位妊娠的潜在靶点进行基因本体(gene ontology,GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信号通路富集分析,于微生信网络平台(https://www.bioinformatics.com.cn/)对结果进行可视化处理,从而对药物治疗疾病的靶点基因的生物学过程和发挥药理作用的主要通路有更加清晰的认识。

1.7 分子对接将关键化合物与核心靶点进行分子对接。首先准备小分子配体文件,在PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中用关键化合物名称检索并下载最佳匹配结果的2D结构,在Chem3D插件中优化力学结构使其能量最小化然后转化为3D形式,应用AutoDockTools-1.5.6软件导出“PDBQT”文件。其次准备受体蛋白文件,以靶点基因名为检索词在Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)中获取相应基因的PDB ID,使用基因ID在RSCB PBD数据库(https://www.rcsb.org/)中找到符合条件的蛋白质构象并保存,在Pymol软件中移除水分子和原配体结构,导出后运用AutoDockTools-1.5.6软件对蛋白质结构加氢、计算电荷并添加原子类型,操作完成后在软件内转化为“PDBQT”文件。再使用AutoDockTools-1.5.6软件寻找核心靶点蛋白的活性口袋位置,并记录坐标数值,最后运行AutoDock vina软件实现小分子配体与蛋白受体分子结构之间的对接,根据生成的评分评估配体与定义的结合位点的潜在互补性。

1.8 研究流程本研究的具体研究流程如图1所示。

图1 研究流程图

2 结果

2.1 经方桂枝茯苓丸中药物有效成分及其作用靶点运用TCMSP数据库依照筛选标准得到桂枝茯苓丸有效成分85个,其中赤芍29个,茯苓15个,桂枝7个,牡丹皮11个,桃仁23个。在TCMSP数据库中提取相关作用靶点,运行Perl语言软件对有效成分和作用靶点进行去重并整理,汇总后得到有效成分作用靶点637个,应用Uniprot数据库获取基因symbol注释文件,使用Perl语言5.32.1.1软件对汇总后的有效成分相关作用靶点进行整理并标注,共得到有效成分作用靶点525个。

2.2 疾病相关靶点以“ectopic pregnancy”为关键词于DrugBank、PharmGkb、GeneCards、TTD、OMIM五大数据库中进行检索和筛选,其中从GeneCards数据库中检索得到6 263个靶点,按照“Relevance score≥1”的条件筛选出2 998个靶点;从OMIM数据库中获得61个靶点;通过PharmGkb数据库搜索得到97个靶点;应用DrugBank数据库获得靶点39个;在TTD数据库中未检索到异位妊娠“ectopic pregnancy”有关靶点信息。使用R语言4.2.2软件对来自五大数据库的疾病靶点基因进行去重并整合,得到疾病总靶点3 055个,将结果通过Venn图形式可视化。见图2。

图2 异位妊娠疾病相关靶点信息

2.3 桂枝茯苓丸治疗异位妊娠的潜在靶点通过运行R语言4.2.2软件对桂枝茯苓丸有效成分的作用靶点与异位妊娠疾病总靶点进行映射并绘制Venn图,见图3,得到145个交集靶点,即为桂枝茯苓丸治疗异位妊娠的潜在靶点。具体靶点如表1所示。

表1 桂枝茯苓丸治疗异位妊娠的潜在靶点

图3 桂枝茯苓丸治疗异位妊娠的潜在靶点Venn图

2.4 桂枝茯苓丸—异位妊娠调控网络应用Perl语言5.32.1.1软件对上述操作得到的药物有效成分及作用靶点、异位妊娠疾病总靶点及桂枝茯苓丸治疗异位妊娠的潜在靶点这三项信息进行处理,即寻找桂枝茯苓丸治疗异位妊娠的潜在靶点对应的桂枝茯苓丸组方药物活性成分及作用靶点,实施整合和标注,从而获得“network”和“type”输入文件,运用Cytoscape_v3.9.1软件构建中药复方调控网络,见图4。图中有节点“Node”184个,圆形外层为药物有效成分节点39个,中心矩形方阵为潜在靶点节点145个,与329条边“Edge”呈现相互作用关系并形成网络。应用CytoNCA插件计算图中184个节点的网络拓扑参数,获得节点存在于网络关系中的自由度(degree)、中介中心性(betweenness centrality,BC)和接近中心性(closeness centrality,CC),并用这些参数评价节点在网络中的影响和重要程度,数值越高说明该节点越接近中心,影响越大。以degree>10为条件对39个药物有效成分节点进行筛选,得到6个关键化合物即槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、黄芩素(baicalein)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)、鞣花酸(ellagic acid),关键化合物详细信息见表2。

表2 关键化合物信息

图4 桂枝茯苓丸-异位妊娠调控网络

2.5 PPI蛋白互作网络及拓扑分析经过STRING在线分析平台绘制的PPI蛋白互作网络如图5所示。将由平台分析得到的“tsv”文件导入Cytoscape_v3.9.1软件中,应用CytoNCA插件对文件所含的112个节点进行网络拓扑参数的计算并得到相应文件,使用R语言4.2.2软件找出文件中BC、CC、度中心性(degree centrality,DC)、特征向量中心性(eigenvector centrality,EC)、局部边连通性(local average connectivity,LAC)、网络中心性(network centrality,NC)这6项参数均大于中位值的靶点,对其进行分析整合,得到符合要求的靶点节点34个,然后对这些靶点再次计算拓扑参数并获取文件,运用R语言4.2.2软件以相同的方式对34个靶点基因进行二次筛选,得到10个核心靶点基因并绘制网络图,如图6所示,核心靶点及网络关系相关参数如表3所示。

表3 核心靶点信息

图5 潜在靶点PPI蛋白互作网络

注:a:潜在靶点PPI网络;b:关键靶点网络;c:核心靶点网络。图6 相关靶点PPI网络

2.6 GO富集分析结果将上述145个潜在靶点导入David数据库进行GO富集分析,得到生物学进程条目,其中包含725种生物学过程(biological process,BP)以及154类分子功能(molecular function,MF)和78个细胞组分(cellular component,CC),按照P值大小排序,气泡图中-log10(Pvalue)值越大,表明当前富集的结果越可信,颜色越红,富集越显著。选择前20个条目应用微生信网络平台进行可视化分析,分析结果如图7所示,气泡图中纵坐标GO条例信息根据-log10(Pvalue)值由大到小、自上而下排列。

图7 潜在靶点的GO富集分析

2.7 KEGG富集分析结果在David数据库中对筛选出的潜在靶点进行KEGG信号通路富集分析,共得到167条信号通路,对167条富集结果按照P值大小排序,取前20条信息应用微生信平台进行可视化处理,结果见图8的气泡图及表4。根据KEGG pathway对前20条通路进行分类,如图8的条形图所示,TNF信号通路(TNF signaling pathway)与 HIF-1 信号通路(HIF-1 signaling pathway)属于环境信息处理(Environmental Information Processing)类;IL-17 信号通路(IL-17 signaling pathway)归属有机体系统(Organismal Systems)类;其余皆与人类疾病(Human Diseases)相关。

表4 潜在靶点的信号通路与基因分布

图8 潜在靶点的KEGG通路富集分析

2.8 分子对接结果分析经筛选获取的6个关键化合物与10个核心靶点使用AutoDock vina软件进行分子对接来预测结合能力,结果如表5所示,其中药物关键化合物所对应的作用靶点若未在核心靶点内,则不进行对接,亦不展示其结合能。相关文献表明,小分子配体与蛋白受体分子结构结合越稳定时,其结合能量值越低,亲和力越理想[11],当结合自由能小于-5 kcal·mol-1时认为二者结合活性较好,结合能小于-7 kcal·mol-1认为其结合活性较强。对接结果显示,关键化合物中槲皮素和黄芩素能够作用于一半以上的核心靶点,结合活性较强(<-7 kcal·mol-1),其次是山柰酚和鞣花酸。其中鞣花酸与ESR1,槲皮素与TNF,槲皮素与MAPK1,黄芩素与HSP90AA1以及山柰酚与RELA的亲和力较好,配体与蛋白构象结合姿态通过Pymol软件可视化处理,结果见图9。因此可以判断桂枝茯苓丸的多数有效成分与核心靶点蛋白之间拥有较强的结合活性,亲和力良好。

表5 关键化合物与核心靶点的分子结构对接结果 (kcal·mol-1)

图9 分子对接结果可视化

3 讨论

异位妊娠的发病率正逐步上升,严重威胁着女性的生命健康,目前对其发病机制的认识尚不清楚。有学者发现,当健康完整的盆腔、输卵管和子宫内环境被炎症浸润以及人流手术、腹部手术、剖腹产等操作改变后,其正常的生理功能将受到不良影响,患异位妊娠等不良生殖结局的风险将显著增加[12]。在异位妊娠中,输卵管妊娠的发病率最高,有学者认为输卵管炎是输卵管妊娠发生的主要原因[13]。致病微生物可以是细菌、支原体、衣原体、梅毒等,它们可以通过上行感染的方式引起输卵管感染,并导致输卵管结构和功能的改变,其中包括黏膜纤毛的损伤、管腔变窄,从而影响孕卵的正常运输。此外,致病菌还能通过淋巴与血液感染输卵管致输卵管周围组织炎症,导致输卵管周围组织发生粘连,管体扭曲变形,因而管腔变狭窄,管壁肌肉蠕动缓慢,孕卵输送受阻。

现代药理学研究认为,桂枝茯苓丸具有显著的抗炎、抗癌、抗凝、镇痛以及参与免疫调节等能力,还能改善宫体血液微循环和输卵管阻塞状态,提高妊娠率,调节体内激素水平,从而调节月经周期,使卵泡发育和排卵恢复正常。本研究依靠网络药理学方式,通过构建中药复方调控网络,筛选得到桂枝茯苓丸有效成分中degree>10的6个关键成分节点,按照degree值由大至小的顺序,依次为槲皮素、山柰酚、黄芩素、β-谷甾醇、豆甾醇、鞣花酸,提示这些成分在治疗异位妊娠时可能起到关键作用。其中槲皮素、山柰酚、黄芩素均属黄酮类化合物,此类化合物生物活性多样。槲皮素作为关键化合物之一其作用靶点众多,相关研究表明该成分能够有效抑制细菌,且抗氧化能力显著,浓度越高能力越强,能有效清除体内过多影响健康的自由基[14],并具有抗癌特性,通过干扰细胞信号传导以及抑制激活致癌物的酶的能力等机制发挥作用[15]。山柰酚在天然植物中广泛存在,其药理活性包括诱导肿瘤细胞凋亡、抗炎、抗氧化、抗脑缺血损伤及免疫调节等[16]。黄芩素是黄芩的重要单体成分,同样能够抗炎、抗氧化、抗癌和抑制细菌,此外还能抗凝血和血栓[17]。而 β-谷甾醇和豆甾醇属于植物甾醇,抗炎能力显著[18],且对胆固醇有调节作用,能降低低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)的水平,亦具备一定的抗癌能力。鞣花酸被认为是癌症最有前景的化学预防剂之一,具有很强的抗癌特性以及抗炎和抗氧化能力[19]。

经过拓扑分析筛选得到蛋白激酶B 1(protein kinase B 1,AKT1)、FOS、TP53等10个潜在核心靶点,且通过分析KEGG富集结果的基因分布发现有9个核心靶点富集在癌症通路上,其中靶点基因AKT1在网络中处于关键位置,其次是靶点肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、HSP90AA1。AKT1(又称PKB)参与调节代谢和转录,细胞的存活、生长、迁移,调节血管生成和肿瘤发生。PKB不仅在早期胚胎发育的滋养层中表达,而且在成熟胎盘中也存在高表达,并广泛分布于所有类型的滋养层细胞,PKB的失活将引起胎盘的营养不良和结构异常,可能导致胎盘功能不全和随后的胎儿生长障碍。TNF是一种多功能的促炎细胞因子,主要由巨噬细胞分泌,它能通过与受体TNFRSF1A/TNFR1和TNFRSF1B/TNFBR结合发挥作用,参与调节细胞增殖、分化、凋亡、脂质代谢和凝血等广泛的生物学过程,并与癌症、自身免疫性疾病和胰岛素抵抗等疾病相关。HSP90AA1属于热休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)家族成员,存在于细胞质中,并负责编码细胞质中的HSP90α蛋白,该蛋白在癌细胞中高表达,有利于致癌信号转导以及细胞的增殖和迁移。

有研究认为,当输卵管妊娠发生时,体内的雌、孕激素下降,输卵管黏膜上皮细胞的细胞毒性因子Toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4)、核转录因子-κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)、TNF-α含量增加,免疫反应加强[20]。NF-κB是广泛存在于细胞中的核蛋白因子,能促进炎症相关因子的表达,导致过度炎性反应,其含量减少对妊娠成功尤为关键。TNF-α作为TNF亲和力强的受体,多存在于胎盘中,对精子和卵子的结合以及早期胚胎发育存在负面影响。生殖道受天然防御细胞保护,人体内存在的TLR4属于Ⅰ型跨膜蛋白,该蛋白可以辨别病原体,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是其主要的外源性配体,蛋白与相应配体结合后,NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶通路被激活,致炎因子的生成和释放增加,从而激活机体的免疫反应。槲皮素能够抑制LPS引起的免疫应答和炎症反应,调节NF-κB的活化,从而抑制IL-1β诱导A549细胞表达细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)[21]。黄芩素对多种细菌及真菌具有较强的抑制能力,能明显抑制二甲苯诱导的小鼠耳郭肿胀和白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、TNF-α因子含量增加[22]。黄芩素还可以通过对TNF-α、IL-6和NF-κB的表达进行抑制,有效预防在癌症引起的恶病质模型中的骨骼肌萎缩[23]。鞣花酸能够通过显著减少结肠癌中的诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、NF-κB、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、IL-6、TNF-α因子的含量从而有效的抑制由炎症诱导的结肠癌;亦可以影响AKT信号通路传导,从而减少HCT-15结肠癌细胞增殖并诱导其凋亡;还可以通过抑制炎症因子的分泌、促炎细胞因子释放以及阻碍LPS-TLR4-NF-κB信号通路传导来达到抗炎目的[24]。

通过构建潜在靶点的PPI网络发现,桂枝茯苓丸治疗异位妊娠可能涉及靶点众多,靶点与靶点之间关系紧密,作用机制复杂多样,通过KEGG富集分析发现,交集靶点富集在多条信号通路上,桂枝茯苓丸可能通过癌症通路、脂质和动脉粥样硬化、IL-17、TNF、HIF-1和人类巨细胞病毒感染等通路干预异位妊娠疾病的治疗。且GO富集分析结果表明,疾病的治疗与炎症应答、凋亡过程、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正向调控、对外来生物刺激的反应、对脂多糖的反应、细胞对肿瘤坏死因子的反应、甾体结合、蛋白结合、细胞核、细胞质和质膜等生物过程关系紧密。

通过对关键化合物以及与主要成分相映射的关键靶点进行分子对接显示,关键化合物中绝大多数成分与相应的靶点蛋白的结合能<-7 kcal·mol-1,鞣花酸与ESR1分子结构对接结果最佳(-8.9 kcal·mol-1),其中与槲皮素相映射的核心靶点最多,其次是黄芩素,二者均能够与相应靶点蛋白较好的结合。有一半以上的成分能够与靶点HSP90AA1稳定结合,亲和力良好,其中黄芩素与该靶点的结合能最低(-8.4 kcal·mol-1)。

本文通过网络药理学和分子对接技术对桂枝茯苓丸治疗异位妊娠的作用机制进行分析得到槲皮素、山柰酚、黄芩素、β-谷甾醇、豆甾醇、鞣花酸等关键化合物通过结合AKT1、TNF、HSP90AA1、FOS、RELA、TP53、MYC、ESR1、HIF1A、MAPK1等靶点调节癌症、脂质和动脉粥样硬化、IL-17、TNF、HIF-1等相关信号通路来实现对异位妊娠疾病的干预,达到缓解症状和治疗疾病的目的。