骨质疏松症的骨免疫机制及中药单体干预研究*

谢希,高曦,娄宏君,石晔,甘广,马欣玮,李丰杉

1.黑龙江中医药大学第一临床医学院,黑龙江 哈尔滨 150040; 2.黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040; 3.湖南中医药大学中西医结合学院,湖南 长沙 410208

骨质疏松症是一种以骨量减少、骨微结构破坏、骨硬度降低并伴随着骨折风险增加为主要特征的运动系统疾病[1]。与同性别、同种族的成人相比,骨密度降低程度≥2.5个标准差即可诊断为骨质疏松症[2]。最新流行病学调查显示,我国50岁以上人群中骨质疏松症患病率为19.2%,其中男性患病率为6%,而女性患病率为32.1%,是骨质疏松症的高发人群[3]。防治骨质疏松症是落实《“健康中国2030”规划纲要》的重要一环,已经成为了全社会的健康共识。骨质疏松症的危险因素有超重、吸烟、饮酒、糖皮质激素等药物的摄入和长时间制动等,常与糖尿病和库欣综合征等疾病并见,目前对于该病的防治主要是补充维生素D、钙剂、双磷酸盐、降血钙素、甲状旁腺素和雌激素等[4]。骨的新陈代谢依赖于成骨细胞和破骨细胞的动态平衡,当破骨细胞过于活跃时,骨量减少,从而引起骨质疏松症等一系列疾病。骨与免疫系统关系密切,骨髓可以产生免疫细胞,但免疫系统对于骨的调控研究较少,2000年,Arron等[5]正式提出“骨免疫学”概念,免疫系统与骨的“互动”已成为近年研究的热点,也为骨质疏松症的防治提供了新的思路和方法。随着骨免疫学的发展和对中医药治疗骨质疏松症研究的深入,发现相当多的中药单体均可以通过调控骨骼和免疫系统实现对骨质疏松症的干预,为骨质疏松症的防治提供了新的思路。本研究对骨免疫在骨质疏松的作用机制、中药单体对骨质疏松症免疫性调控的研究进行综述,以期为中医药防治骨质疏松症提供新的思路和见解。

1 骨质疏松症骨免疫机制研究进展

1.1 骨质疏松症与骨保护素(osteoprotegerin,OPG)/NF-κB受体活化因子(receptor activator of NF-κB,RANK)/NF-κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)系统OPG/RANK/RANKL均属于肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)家族,该系统的阐明为骨骼系统与免疫系统的“对话”提供了可能性。OPG基因最初是在对胎鼠肠道cDNA的测序过程中发现的[6],其定位在染色体的8q23-24位置,可编码一个含401个氨基酸的缺乏跨膜结构域的分泌性糖蛋白,OPG蛋白在细胞内以55 kD分子量大小合成,然后以110 kD二聚体形式被分泌到细胞外。同年,来自日本的科学家在人胚胎肺成纤维细胞的条件培养基发现了一种能抑制破骨细胞生成的因子,并将其命名为破骨细胞生成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor,OCIF)[7]。通过对二者的cDNA序列进行分析比较,发现OCIF即OPG[8]。RANK基因是通过对树突状细胞(dendritic cells,DC)的cDNA文库直接测序鉴别发现的[9],并通过直接表达筛选出其配体RANKL,RANK基因定位于人类染色体的18q22.1位置,编码一个含616个氨基酸的Ⅰ型跨膜蛋白,RANKL基因定位于13q14位置,编码一个含316个氨基酸的Ⅱ型跨膜蛋白。在骨骼系统中,成骨细胞合成并分泌RANKL和OPG,破骨前体细胞表达RANK,RANKL可与RANK结合,刺激破骨前体细胞分化成破骨细胞,促进骨吸收,而OPG则可作为诱饵受体竞争性地与RANKL结合,延缓破骨前体细胞的分化成熟,从而抑制骨吸收[10-11]。见图1。

图1 OPG/RANK/RANKL系统调节骨代谢示意图

1.2 骨质疏松症与免疫细胞

1.2.1 T细胞T细胞是调节细胞免疫的主要细胞。RANK作为来自DC的肿瘤坏死因子受体家族成员,其配体RANKL可以增强DC刺激T细胞增殖的能力,并可以增加白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)和转化生长因子(transforming growth factor,TGF)产生的RANK+ T细胞的活性,提示RANK/RANKL是T细胞和DC之间重要的调节因子[9]。进一步研究发现,RANK在DC中高度表达,RANKL增强DC介导的T细胞增殖,RANKL可以在体外抑制DC的凋亡[12]。活化的T细胞分泌RANKL可以调节破骨细胞的生成以及成熟破骨细胞的活性[13]。在卵巢切除小鼠模型中,通过靶向TNF-α受体P55可以介导T细胞增加TNF-α,进而促进巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,MCSF)和RANKL诱导的破骨细胞增加;但在缺乏T细胞的模型中并未观察到该效应,提示T细胞在骨代谢中的潜在重要性[14]。糖皮质激素无法在缺少T细胞的免疫缺陷小鼠诱导产生骨质疏松症模型,从野生型小鼠移植得到T细胞后,这些T细胞趋向骨髓,表达高水平的RANKL,可以重建骨质疏松症模型[15]。

1.2.2 B细胞B细胞在人体内主要负责免疫球蛋白的产生和参与体液免疫,与T细胞共同形成适应性免疫系统,同时B细胞与骨代谢也存在着诸多联系。B细胞是骨髓微环境中OPG的重要来源,缺乏B细胞的小鼠表现出骨质疏松症,重建B细胞可以逆转这一表型[16]。牙周病患者的牙龈组织中有大量T细胞和B细胞表达RANKL,从患者牙龈组织中分离出来的B细胞在体外诱导破骨细胞分化形成,而外周血中的淋巴细胞并无此效应,提示活化的B细胞可能是导致牙周病骨吸收的RANKL的来源[17]。人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染后可诱发骨质疏松症,临床研究显示,HIV患者骨吸收显著增加,表达RANKL的B细胞增加,而表达OPG的B细胞减少,导致破骨细胞增多,提示骨丢失加速与B细胞功能障碍有关[18]。未成熟B细胞占总B细胞比例增加,使HIV感染者B细胞中RANKL/OPG的比值增大,导致骨丢失,提示未成熟B细胞或是筛查骨质疏松症的新的生物标志物[19]。

1.3 骨质疏松症与细胞因子

1.3.1 TNF-αTNF-α主要介导炎症的发生,在急性炎症反应、自身免疫性疾病和慢性炎症反应过程中均发挥相应的作用。研究发现,TNF-α在骨吸收的病理生理过程中发挥重要作用[20]。TNF-α 可以诱导破骨细胞分化,该作用不依赖于RANK/RANKL通路,TNF-α招募TNF受体相关因子(TNF receptor related factors,TRAFs),依次激活转录因子NF-κB、P50、P52和c-Fos,然后转录因子活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT),促进破骨细胞分化[21]。在卵巢切除小鼠中,肠道内的总T细胞、TNF+T细胞和辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17)向骨髓归巢,释放TNF-α、RANKL和IL-17等细胞因子,从而导致骨流失[22]。一项临床研究对绝经后骨质疏松患者进行为期两年的随访发现,与健康组比较,绝经后骨质疏松患者血清TNF-α水平显著升高[23]。

1.3.2 IL-17IL-17主要由Th17细胞分泌,参与炎症和自身免疫性疾病等病理生理过程。研究发现,IL-17介导IL-34诱导的类风湿关节炎患者成纤维细胞样滑膜细胞和外周单核细胞RANKL/OPG比例升高,加重了骨破坏,而IL-17抑制剂可以减轻这种效应,提示IL-17是调控RANKL/OPG的潜在靶点[24]。糖尿病可以诱导小鼠口腔炎症、牙齿骨质流失以及口腔微生物群数量的减少,口腔菌群是导致牙齿骨质流失的重要因素,而IL-17抑制剂可以降低糖尿病小鼠口腔微生物的致病性,减轻牙周骨的损伤程度[25]。当共培养体系中成骨细胞和破骨细胞比例为201时,低剂量的IL-17能够显著促进体系中破骨细胞的生成,高剂量的IL-17却能够抑制破骨细胞生成,同样,高水平的IL-17可促进RAW264.7来源的破骨细胞前体细胞的凋亡,但低水平的IL-17表现出抗凋亡功能,Beclin1/TAB3/ERK信号通路介导了这一过程,提示IL-17对于破骨细胞的形成具有“双刃剑”作用[26-27]。

1.3.3 TGF-βTGF-β是一种多功能的细胞因子,可通过与其Ⅰ型和Ⅱ型受体结合发挥多种生物学作用。早期研究发现,分离出的无基质的单核细胞/巨噬细胞样造血细胞表达TGF-βⅠ型和Ⅱ型受体,在外源性TGF-β的刺激下可促进其分化为破骨细胞,且表现出剂量效应关系[28]。TGF-β通过激活丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogenactivated protein kinase,p38MAPK)促进破骨细胞的生成,而持续暴露于TGF-β则会下调RANKL的表达,减弱RANK/RANKL信号,从而抑制破骨细胞的生成[29]。最近,有研究揭示了不同于RANK/RANKL信号的促进破骨分化的途径,在TGF-β干预下,巨噬细胞对于TNF-α的刺激由炎症反应转化为促进破骨细胞生成的效应,在缺乏TGF-β信号的情况下该效应受到抑制,而一种新的细胞因子B-Myb介导了该效应[30]。

2 中医药参与骨免疫防治骨质疏松症研究进展

2.1 中医对骨质疏松症的认识中医学中无“骨质疏松症”的病名,根据其特点可归属于“骨痿”“骨痹”“骨枯”等范畴,其病因多为先天禀赋不足、后天摄养失调和外邪侵袭等,导致脏腑阴阳气血失调、气血经脉痹阻、骨失滋养、骨枯髓减从而为病,根本病机为肾精亏虚。根据该病临床表现和病因病机的不同,可将其分为肾阳虚证、肝肾阴虚证、脾肾阳虚证、肾虚血瘀证、脾胃虚弱证、血瘀气滞证[31]。随着对中药药理学作用的深入研究,很多中药被发现具有抗骨质疏松效应和机制,如研究广泛的补肾类中药淫羊藿、杜仲、牛膝等,均具有改善骨密度的作用,揭示了“肾主骨”的现代医学内涵,对于深化中医理论的研究具有积极意义[32-33]。

2.2 中药单体调节骨质疏松症骨疫的研究进展白藜芦醇属于非黄酮类多酚化合物,是很多植物受到刺激时产生的一种抗毒素。现代药理学研究发现,白藜芦醇具有抗肿瘤、抗炎、神经保护、抗细菌等作用[34]。有研究发现,白藜芦醇可以通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,PI3K)/蛋白激酶B信号通路,上调叉头转录因子(forkhead box O1,FoxO1)的转录活性,发挥抗氧化应激作用,并抑制破骨细胞的生成[35]。此外,白藜芦醇还能促进过氧化氢处理过的成骨细胞的增殖分化,抑制其凋亡[36]。运用固体脂质纳米粒改善白藜芦醇的水溶性,提高其生物利用度,促进骨髓间充质干细胞的成骨效应,为白藜芦醇的临床运用和相关药物研发提供了新的思路[37]。

淫羊藿是一种应用广泛的补肾类中药,可提取出淫羊藿苷、淫羊藿次苷和淫羊藿素等多种生物活性物质。淫羊藿苷与OPG具有较强的亲和力,能够提高斑马鱼和去卵巢大鼠的骨密度、OPG水平,降低RANKL水平[38]。Ⅰ型胶原在骨基质中含量丰富,胶原蛋白Ⅰ型α2链(collagen type I alpha 2 chain,COL1A2)对骨形成至关重要,淫羊藿苷可以通过提高COL1A2水平、降低骨吸收标志物抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartrate-resistant acidphosphatase 5b,TRAP5b)水平,促进卵巢切除大鼠骨质疏松症后骨折模型的骨形成[39]。研究发现,淫羊藿苷还可以通过降低RANKL/OPG的比例,抑制肺癌的骨转移,减轻其导致的溶骨性骨破坏[40]。朝藿定A和朝藿定C都是提取自淫羊藿的黄酮类化合物,朝藿定A可促进骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞,提高OPG/RANKL比例,发挥骨保护作用[41],朝藿定C可提高去势诱导的雄性骨质疏松小鼠Ⅰ型前胶原N端肽(N-terminal propeptide of typeⅠprocollagen,PⅠNP)和OPG水平、骨小梁数量、骨小梁连接密度,降低骨微结构的各向异性程度[42]。

丁香苷是从刺五加根茎中提取出的一种酚苷类化合物,能够显著改善卵巢切除小鼠的骨密度、骨最大负荷和骨小梁微架构,这种效应表现为骨矿物质含量、组织矿物质含量、组织矿物质密度、骨小梁厚度和小梁数量增加,其机制与肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor-necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)、NF-κB和RANKL水平的下调以及OPG、PI3K/AKT水平的升高有关[43]。

桑根酮C是一种黄酮类化合物,在中药桑白皮中含量丰富,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤的药理学作用[44]。据报道,桑根酮C治疗骨质疏松症具有一定的潜力,能够促进小鼠胚胎成骨细胞的增殖,提高碱性磷酸蛋白酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,上调矮小相关转录因子(runt-related transcription factor 2,Runx2)、I型胶原表达。此外,还能升高 OPG/RANKL比值,抑制破骨细胞形成,体现在表达TRAP的多核细胞数目减少,骨吸收凹陷面积减少。体内研究表明,桑根酮C能够逆转由强的松导致的骨丢失[45]。

佛手苷是从蛇床子中提取出的一种香豆素衍生物,在体外能够抑制骨髓巨噬细胞和RAW264.7细胞分化为破骨细胞,主要是通过特异性抑制RANKL诱导的NF-κB和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminalkinase,JNK)信号传导实现的。体内研究发现,佛手苷能够抑制破骨细胞相关转录因子活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)和c-fos的表达,这揭示了佛手苷治疗骨质疏松症的潜在机制[45]。

小檗碱又称黄连素,是从黄连中提取出的具有多种药理学作用的有效活性成分,对神经系统、泌尿系统、心血管系统等均具有保护作用[46]。在脂多糖诱导的小鼠骨丢失模型中,经小檗碱处理后,骨小梁数量和体积显著增加,TRAP阳性破骨细胞数量显著减少,为小檗碱治疗骨质疏松症提供了依据[47]。小檗碱抗骨质疏松的作用机制与p38MAPK、Wnt/β-catenin、腺苷酸激活蛋白激酶(Adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)、RANK/RANKL/OPG、PI3K/Akt、NFAT、NF-κB和氧化应激信号传导有关[48]。

阿克替苷是肉苁蓉的主要活性成分,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗糖尿病、保护神经系统和心血管系统以及骨骼系统的作用[49],可通过RANKL/RANK/TRAF6介导的 NF-κB失活和激活PI3K/AKT阻止去卵巢小鼠的骨丢失[50]。

特女贞苷作为女贞子内含量较高的环烯醚萜苷类成分,是女贞子质量控制的含量测定指标[51]。骨质疏松症是糖尿病的慢性并发症,特女贞苷可通过抑制RANKL从而诱导破骨细胞形成,其作用机制与抑制NF-κB和MAPK信号通路的激活有关[52]。

杜仲具有补肝肾、强筋骨、安胎的功效,主治肝肾不足、腰膝酸痛、筋骨无力、头晕目眩、妊娠漏血、胎动不安。松脂醇二葡萄糖苷作为杜仲质量控制的测定指标,能够显著提高青年大鼠股骨和椎骨的骨密度,提高松质骨骨小梁密度和数目、血清OPG水平、骨组织内骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)、Runx-2、成骨细胞特异性转录因子(osterix,Osx)水平,降低RANKL水平,提示松脂醇二葡萄糖苷是潜在的抗骨质疏松症的有效物质[53]。

吴茱萸次碱作为一种吲哚喹唑啉类生物碱,提取自吴茱萸,具有抗氧化应激、抗肿瘤、抗炎、抗病毒等作用[54-56]。吴茱萸次碱在保护骨组织方面也表现出较大潜力,能够显著抑制RANKL诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7向破骨分化,促进去卵巢大鼠骨形成,减少骨量丢失[57]。

补骨脂具有补肾壮阳、固精缩尿、温脾止泻等功效,现代药理学研究发现其具有抗炎、抗肿瘤、抗骨质疏松等作用[58]。异补骨脂素是补骨脂中主要的香豆素类成分,研究发现,在去卵巢大鼠模型中,异补骨脂素能够显著改善全身、股骨和腰椎的骨密度,提高骨钙素、降低RANKL/OPG的比例,这或是异补骨质素发挥抗骨质疏松作用的潜在机制[59]。

3 结语与展望

OPG/RANK/RANKL系统的发现对于扩展骨代谢的途径,加强免疫系统与骨骼系统的联系具有重要作用,基于OPG/RANK/RANKL系统及其下游信号通路调节骨代谢、抗骨质疏松症的研究已经十分广泛,有相当多的中药单体对于骨质疏松症有良好的治疗作用,大多数中药单体都是通过干预OPG/RANK/RANKL系统及其下游信号通路,抑制破骨细胞分化和形成,从而发挥抗骨质疏松症的作用,这对于阐明中药单体抗骨质疏松症的机制具有重要意义。但目前对于OPG/RANK/RANKL系统以及中药单体调控该系统实现对骨质疏松症治疗的研究存在一定的局限性:(1)现有研究着重于中药单体对OPG和RANKL水平的调节,通过对二者比例的调控实现对破骨细胞分化的干预,但中药单体直接作用于成骨细胞形成和分化的研究较少,中药单体是否可以通过增加成骨细胞的形成和活性实现抗骨质疏松效应,如果可以,又是通过哪些途径实现的,尚未明确;(2)T细胞可以分泌RANKL,巨噬细胞可以分泌OPG,目前的研究较少关注中药单体调节免疫细胞发挥抗骨质疏松效应,使得中药单体在骨与免疫系统“对话”中的作用不够突出;(3)中药单体是否可以通过其他信号通路或途径干预骨质疏松症,它们与OPG/RANK/RANKL系统之间有何关系,能否相互调控有待进一步探讨。近年来,外泌体凭借其在细胞通讯中发挥的重要作用受到广泛关注,有研究发现,利用外泌体搭载山药有效成分靶向成骨细胞可以促进其增殖分化,从而改善卵巢切除模型的骨代谢状况,增加骨密度。随着对外泌体生物学功能的深入研究,骨细胞与免疫细胞的“对话”会得到充分揭示,而以外泌体搭载中药有效活性成分靶向治疗骨质疏松症可作为未来的研究方向[60],进一步深化中药单体抗骨质疏松症的理论研究,助力其临床运用及新药研发。