健脾消癌方对结肠癌HCT116细胞增殖、侵袭及迁移的影响及机制研究*

何威华,邓兰,蒋益兰

1.武汉市中医医院,湖北 武汉 430050; 2.湖南中医药大学,湖南 长沙 410208; 3.江西中医药大学附属医院,江西 南昌 330006; 4.湖南省中医药研究院附属医院,湖南 长沙 410006

研究显示,结直肠癌2020年新增病例占全球新增癌症病例的10%[1],肝转移是其主要死因[2]。因此,积极探索结直肠癌的肝转移机制,并采取有效的防治措施以提高结直肠癌患者的生存期具有重要意义。1993年,Ioannides和Whiteside正式提出“肿瘤微环境”的概念[3],它是由各种细胞(肿瘤细胞、基质细胞、内皮细胞、免疫细胞)、细胞因子(炎症因子、趋化因子和血管生成因子)、相关信号分子等共同构成的局部内环境,具有低氧、低pH值、间质高压、生长因子和蛋白水解酶产生、炎症反应以及免疫抑制等生物学特征,为肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等恶性生物学行为提供了“肥沃土壤”[4-5]。研究表明,肿瘤细胞之所以能在特定的器官发生或转移,肿瘤微环境起着至关重要的作用[6]。肿瘤微环境中存在与结直肠癌肝转移密切相关的因子,包括趋化因子受体 4(chemokine receptor 4,CXCR4)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、整合素αv β5(integrin αv β5,ITG αv β5)、血清钙结合蛋白 A4(calcium-binding protein A4,S100A4)、血清钙结合蛋白 A8(calcium-binding protein A8,S100A8)、血清钙结合蛋白 A9(calcium-binding protein A9,S100A9)等。

健脾消癌方是湖南省名中医蒋益兰主任医师的经验方,既往临床研究显示,健脾消癌方能够降低结直肠癌患者术后复发率、转移率,延长其无病生存期及总生存期[7-8]。实验研究发现,健脾消癌方可降低结直肠癌裸鼠模型的肝转移率[9],但其具体机制尚未完全阐明。本实验拟探索健脾消癌方对结肠癌HCT116细胞增殖、侵袭及转移的影响及对肿瘤微环境中肿瘤转移相关因子(CXCR4、TGF-β、ITG αv β5、S100A4、S100A8、S100A9)表达的影响,为健脾消癌方治疗结肠癌的临床应用提供循证依据。

1 材料

1.1 细胞与动物人结肠癌HCT116细胞株购自广州吉妮欧生物科技有限公司,编号JNO-373,传至第4代进行后续研究。SPF级SD大鼠14只,体质量(20±2) g,雄性,购自三峡大学实验动物中心,合格证号:SCXK(鄂)2017-0012。所有大鼠均饲养于恒温(25±2) ℃,湿度50%～60%的SPF级屏障环境中,自由进食和饮水。本实验获得武汉市中医医院伦理委员会批准,伦理审批号:武中医伦KW2021-039。

1.2 药物与试剂人参、薏苡仁、淫羊藿、白花蛇舌草、藤梨根、郁金、炒枳壳、重楼按《中华人民共和国药典》2015年版的标准采购,由武汉市中医医院中药房提供,并由张义生主任药师鉴定为正品。CXCR4抗体、S100A4抗体(Bioss公司,货号:bs-1011R、bs-3759R);TGF-β抗体、S100A8抗体、S100A9抗体、ITG αv β5抗体(Affinity公司,货号:AF1027、DF6556、DF7596、AF0185);HRP标记山羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司,货号:BA1054);GAPDH抗体(杭州贤至生物有限公司,货号:AB-P-R 001);CCK-8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(Biosharp公司,货号:BS350B);Transwell小室(美国BD Biosciences公司,货号:353097);McCoy′s 5A培养基、胎牛血清、青链霉素混合液(美国Gibco公司,货号:16600-082、10091-148、15070-063);RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,货号:P0013B、P0010);蛋白marker(美国Thermo公司,货号:26616);Trizol(美国Ambion公司,货号:15596-026);HiScript Reverse Transcriptase (RNase H)(Vazyme公司,货号:R101-01/02)。

1.3 仪器CO2恒温培养箱(日本SANYO公司,型号:MCO-15AC);电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司,型号:DHG 9203A);倒置显微镜(日本OLYMPUS公司,型号:IX51);超净工作台(苏州集团安泰空气技术有限公司,型号:SW-CJ-1FD);PCR仪(东胜创新生物科技有限公司,型号:EDC-810);微量移液器(美国ThermoFisher公司);低速离心机(德国Eppendorf公司,型号:5702R);酶标仪(美国Molecular Devices公司,型号:Flexstation®3)。

2 方法

2.1 药物制备健脾消癌方由人参15 g,薏苡仁30 g,淫羊藿10 g,白花蛇舌草30 g,藤梨根15 g,郁金15 g,炒枳壳6 g,重楼10 g组成。按生药量加入10倍量水,煎煮1 h,保存药液;药渣再加入8倍量水,煎煮1 h。合并两次药液,浓缩成近2倍水量时,放置过夜。去沉淀,继续浓缩成2.4 kg·L-1的储备液,保存备用。

2.2 健脾消癌方含药血清制备14只SD大鼠随机分为无药血清组及健脾消癌方组,每组各7只,适应性饲养1周后开始灌胃。药物剂量根据动物体表面积与剂量换算得出[10],按70 kg成人每日生药用量120 g进行人与大鼠等效剂量换算,大鼠临床等效剂量为10.8 g·kg-1。无药血清组按大鼠体质量灌胃等体积生理盐水,两组均连续灌胃7 d。末次给药后,以10 %水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,剂量为 3.3 mL·kg-1,小心剪开腹腔和胸腔,以环氧乙烷灭菌后的注射器进行心脏采血,放于10 mL灭菌离心管中,静置2 h以上,无菌分离血清,56 ℃水浴 30 min 灭活后,分装并用封口膜封口,放于-20 ℃冰箱保存备用。

2.3 细胞培养HCT116细胞采用含10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM高糖培养基,于37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。待细胞贴壁,约铺满培养瓶底 90%时,进行细胞传代,传代比率为13,取汇合率为80%的对数生长期细胞进行后续实验处理。

2.4 CCK-8实验检测细胞增殖能力取生长状态良好的HCT116细胞,以每孔5×103个细胞的密度种植于96孔板内,放入恒温培养箱(37 ℃、5%CO2)中过夜。待细胞贴壁后,分为空白组(含细胞及培养基)、5%无药血清组、10%无药血清组、20%无药血清组、5%健脾消癌方含药血清组、10%健脾消癌方含药血清组、20%健脾消癌方含药血清组,每组设置3个复孔。各组细胞分别培养24 h、48 h、72 h,每孔加入10 μL CCK-8溶液,继续培养2 h后,使用酶标仪测定 450 nm 处的光密度(optical density,OD)值,并最终根据每孔细胞的OD值绘制细胞生长曲线,筛选最佳干预血清浓度和最佳干预时间。

2.5 Transwell实验检测细胞侵袭、迁移能力取对数生长期HCT116细胞,调整细胞浓度为2.5×105mL-1。取预先制备好的Transwell小室,在Transwell上室分别接入200 μL 20%无药血清培养的细胞或20%健脾消癌方含药血清培养的细胞,在培养箱(37 ℃,5%CO2)中培养48 h。取出Transwell小室,用70%冰乙醇溶液固定细胞1 h后,用0.5%结晶紫染色20 min,在光学显微镜下随机取3个视野进行计数,以细胞数目衡量细胞的侵袭能力。细胞迁移实验除不在小室铺胶外,其余步骤同细胞侵袭实验。

2.6 Western Blot实验检测CXCR4、TGF-β、S100A4、S100A8、S100A9、ITG αv β5蛋白表达水平以20%无药血清或20%健脾消癌方含药血清处理细胞,48 h后收集细胞,分别加入100 μL RIPA 蛋白裂解液,冰上裂解30 min,4 ℃、12 000 r·min-1离心5 min,取上清,采用BCA试剂盒进行蛋白定量,按照比例加入SDS-PAGE蛋白缓冲液,煮沸 5 min,立即分装,置于-20 ℃冰箱中备用。取 50 μg 蛋白上样,SDS-PAGE凝胶电泳后转膜至PVDF膜,封闭,一抗(稀释比例为15 000)室温孵育4 h,二抗(稀释比例为15 000)室温孵育2 h,ECL发光液显影,分别检测CXCR4、TGF-β、S100A4、S100A8、S100A9、ITG αv β5蛋白的表达水平,用 BandScan软件分析蛋白灰度值。以GAPDH作为内参蛋白,通过测量各目的蛋白与内参蛋白的灰度值比值来反映各目的蛋白的相对表达水平。每次独立重复实验3次。

2.7 RT-PCR法检测CXCR4mRNA、TGF-βmRNA、S100A4mRNA、S100A8mRNA、S100A9mRNA、ITGαvβ5mRNA的表达水平以20%无药血清或20%健脾消癌方含药血清处理细胞,48 h后收集细胞。采用Trizol法提取细胞总RNA,采用HiScript Reverse Transcriptase (RNase H)反转录为 cDNA,逆转录条件为50 ℃,15 min;85 ℃,5 min;-80 ℃ 冰箱中保存。以GAPDH作为内参,通过PCR仪对CXCR4、TGF-β、S100A4、S100A8、S100A9、ITGαvβ5进行扩增,扩增条件为95 ℃预变性10 min,1个循环;95 ℃变性 15 s;60 ℃退火 40 s,40个循环;95 ℃延伸15 s;60 ℃降温60 s;95 ℃ 终延伸15 s,1个循环;50 ℃保存。每个实验重复3次。使用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。引物由擎科生物科技有限公司合成,见表1。

表1 引物序列表

3 结果

3.1 健脾消癌方对结肠癌HCT116细胞增殖的影响实验24 h时,10%健脾消癌方含药血清组OD值低于同浓度的无药血清组,差异有统计学意义(P<0.05);5%、20%浓度的健脾消癌方含药血清组OD值和同浓度的无药血清组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。实验48 h时,5%、10%、20%浓度的健脾消癌方含药血清组OD值均低于同浓度的无药血清组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验 72 h 时,5%、10%浓度的健脾消癌方含药血清组OD值低于同浓度的无药血清组,差异有统计学意义(P<0.05);20%的健脾消癌方含药血清组OD值和同浓度无药血清组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。其中,实验48 h时,20%健脾消癌方含药血清组OD值低于其余各组,差异有统计学意义(P<0.001),因此后续实验选择20%健脾消癌方含药血清处理细胞,干预时间为48 h。见图1。

注:与20%无药血清组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;与10%无药血清组比较,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001;与5%无药血清组比较,△P<0.05。图1 健脾消癌方对HCT116细胞增殖的影响

3.2 健脾消癌方对结肠癌HCT116细胞侵袭及迁移的影响结果显示,与20%无药血清组比较,20%健脾消癌方含药血清能显著抑制HCT116细胞的侵袭及迁移,差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2—图4。

注:与20%无药血清组比较,*P<0.05,**P<0.01。图2 健脾消癌方对HCT116细胞侵袭及迁移的影响

注:A:20%无药血清组;B:20%健脾消癌方含药血清组。图3 健脾消癌方对HCT116细胞侵袭能力的影响

注:A:20%无药血清组;B:20%健脾消癌方含药血清组。图4 健脾消癌方对HCT116细胞迁移能力的影响

3.3 健脾消癌方对HCT116细胞CXCR4、TGF-β、S100A4、S100A8、S100A9、ITG αv β5蛋白表达的影响结果显示,与20%无药血清组比较,20%健脾消癌方含药血清能明显降低CXCR4、TGF-β、S100A4、S100A8、S100A9、ITG αv β5的蛋白表达水平,差异具有统计学意义(P<0.01)。见图5、表2。

图5 蛋白表达条带图

表2 健脾消癌方对CXCR4、TGF-β、S100A4、S100A8、S100A9、ITG αv β5蛋白表达的影响

3.4 健脾消癌方对HCT116细胞CXCR4、TGF-β、S100A4、S100A8、S100A9、ITGαvβ5mRNA表达的影响结果所示:与20%无药血清组比较,20%健脾消癌方含药血清能显著降低CXCR4、TGF-β、S100A4、S100A8、S100A9、ITGαvβ5mRNA表达水平,差异具有统计学意义(P<0.01)。见表3。

表3 健脾消癌方对CXCR4、TGF-β、S100A4、S100A8、S100A9、ITG αv β5 mRNA表达水平的影响

4 讨论

肿瘤微环境具有微观整体性,与中医的整体观有着相似性。学者们认为中医药防治肿瘤转移的优势在于可以从整体上改善肿瘤患者机体内环境,即肿瘤微环境,从而起到抗肿瘤转移的作用[11-12]。“种子与土壤”理论说明了“土壤”即肿瘤微环境可以影响“种子”即癌细胞的转移潜能[13]。以整体观念为指导思想的中医药治疗方法,一方面可以抑制“种子”即癌细胞及其分泌或携带的相关物质的活性,另一方面又可以调整“土壤”即肿瘤微环境,以使癌细胞难于在此微环境中种植、存活、生长,从而达到抗肿瘤转移的作用[14]。基于肿瘤微环境在肿瘤转移过程中的重要作用,针对肿瘤微环境的治疗措施已成为防治肿瘤转移的新策略[15-17]。

蒋益兰主任医师经过长期临床实践,认为“虚、毒、瘀”是结直肠癌的基本病机特点。根据此病机研制了用于防治结直肠癌的经验方:健脾消癌方。本方方药为人参、郁金、薏苡仁、白花蛇舌草、藤梨根、重楼。人参、薏苡仁健脾益气,白花蛇舌草、藤梨根、重楼清热解毒散结,郁金行气活血化瘀。诸药合用,共奏健脾益气、行气活血解毒之功,以达到“健脾消癌”的目的。研究表明,人参活性成分通过重塑肿瘤微环境来实现抗癌作用[18]。人参衍生的纳米颗粒通过重新编排肿瘤微环境来增强免疫检查点抗体的功效[19]。薏苡仁提取物能抑制NF-κB的表达从而抑制结直肠癌细胞系中TNF-α介导的上皮间质转化,从而发挥抗结直肠癌的作用[20]。它还能通过抑制缺氧条件下ERK1/2和AKT通路的活化来抑制结肠癌细胞的迁移、侵袭和黏附[21]。白花蛇舌草能抑制肿瘤干细胞的活性从而发挥抗结直肠癌的作用[22]。此外,藤梨根乙醇提取物能够调控多条结直肠癌相关信号通路,并调节多种炎症因子和血管生成因子的表达,从而诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖及肿瘤血管的生成[23]。藤梨根可通过调节Notch/DLL4/Hes通路抑制体内肿瘤血管生成从而抑制结肠癌细胞的增殖,还可通过Notch信号通路抑制结肠癌细胞的侵袭及迁移[24]。重楼可抑制核梭杆菌来源和外泌体诱导的结直肠癌细胞迁移,还可通过诱导自噬从而抑制结直肠癌细胞的增殖,同时能提高化疗药物阿霉素的疗效[25-26]。郁金-黄芪药对通过Sp1/ZFAS1/miR-153-3p/CCR5调节轴抑制M2型巨噬细胞极化,以抑制结直肠癌细胞的增殖和转移[27]。本课题组前期研究发现,健脾消癌方能下调缺氧微环境中结肠癌细胞HIF-1α水平,间接影响其下游靶基因的表达,从而抑制结肠癌细胞增殖、促进细胞凋亡、减弱细胞迁移,发挥抗癌作用[28]。

CXCR4是G蛋白偶联的趋化因子受体,有研究显示,结肠癌细胞来源的外泌体可通过提高趋化因子受体CXCR4的表达促进肝转移微环境的形成,从而促进结直肠癌细胞在肝脏中种植与生长[29-30]。TGF-β是一种多功能的细胞因子,在肿瘤的发生、发展以及转移中都具有重要作用。肿瘤微环境中,TGF-β通过影响上皮间质转化从而加速肿瘤进展[31],活化后的TGF-β可促进结直肠癌细胞与间质的相互作用,导致结直肠癌进展与转移[32-33]。整合素属于细胞黏附受体家族,在微环境中发挥重要作用,因为它们能够将细胞机械地固定在细胞外基质上,在细胞之间、细胞与外环境之间传送有关信息[34]。整合素几乎涉及癌症的每一个步骤,包括癌症的起始和增殖、局部侵袭和内浸润进入血管系统、循环肿瘤细胞的存活、转移前微环境的启动,以及远处器官上的转移定植[35]。循环结肠癌细胞通过ITG αv β5的介导作用选择性地黏附在肝脏的微血管中,从而促进结肠癌肝转移[36]。S100家族蛋白是钙结合蛋白中最大的亚族之一,有20余个成员,包括S100A1-A5、S100B、S100P等,S100蛋白在大量肿瘤中高表达,与肿瘤细胞的增殖、浸润及疾病的发展密切相关。S100家族蛋白S100A4、S100A8、S100A9等是癌细胞和基质细胞之间联系的纽带,有助于肿瘤转移前微环境的形成[37],从而促进结直肠癌转移。

本研究发现健脾消癌方能抑制HCT116细胞的增殖、侵袭及迁移,并能降低CXCR4、TGF-β、S100A4、S100A8、S100A9、ITG αv β5的表达,提示健脾消癌方可能通过作用于CXCR4、TGF-β、S100A4、S100A8、S100A9、ITG αv β5等肿瘤微环境相关因子从而发挥抑制结肠癌转移的作用。下一步,我们将开展动物实验探究健脾消癌方能否在体内通过作用于肿瘤微环境相关因子发挥抑制结肠癌肝转移的作用。