大蒜素通过JAK2/STAT3 信号通路改善高糖诱导的人腹膜间皮细胞-间充质转化

甘林望李乾程高利超刘 琦李 莹王玉洁欧三桃*

(1.西南医科大学附属医院肾病内科/四川省肾脏疾病临床医学研究中心,四川 泸州 646000;2.西南医科大学附属医院呼吸内科,四川 泸州 646000)

慢性肾病(chronic kidney disease,CKD)是影响人们健康的重要疾病,据统计我国成人患CKD 的比例已超过10%,其中终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD) 患 者 约 为300 万[1]。 腹 膜 透 析(peritoneal dialysis,PD)具有保护肾功能、维持血流动力学稳定、改善贫血等优点,已成为治疗ESRD 的主要方式之一。 而当腹膜长期处于生物不相容性的高糖透析液时其组织结构容易损伤而引起结构重塑,使腹膜纤维化(peritoneal fibrosis,PF)透析效能下降,超滤衰竭发生从而制约腹膜透析技术在临床上的应用[2]。 人腹膜间皮细胞的上皮细胞-间充质转分化是长期处于腹膜透析患者的腹膜组织中很常见的病理特征,是导致腹膜纤维化始动使腹膜超滤衰竭的主要原因之一[3]。 EMT 表现为上皮细胞表型逐渐消失,成纤维细胞的标志物增加,合成细胞外基质的能力提升等特征,其病理过程复杂,与多种细胞因子和信号通路密切相关[4]。 截至目前,对于EMT 在纤维化的作用被广泛研究,但腹膜间皮细胞发生EMT 的分子机制尚未清楚。

大蒜素(allicin,AL)是大蒜由水蒸气蒸馏而得到的一种挥发油,是大蒜主要的有效成分[5]。 研究发现大蒜素在抗氧化、抗肿瘤、降血脂、提升机体免疫力等方面发挥作用[6]。 大蒜素的抗纤维化作用是近年来新发现的药理作用之一。 研究表明大蒜素可抑制胃癌、卵巢癌等多种癌症的上皮间质转化,抑制癌症迁移和侵袭[7-8]。 许宁宁[9]的研究结果表明大蒜素可通过抑制炎症反应和肾组织纤维化保护慢性肾功能衰竭的大鼠。 因此,大蒜素影响部分组织纤维化的过程,但目前其对于腹膜纤维化的影响尚不清楚。 本研究通过分析D-葡萄糖(Dglucose,DG)对细胞形态及细胞增殖、EMT 发生及JAK2/STAT3 信号通路的影响,阐明其介导EMT 发生的分子机制;同时,通过分析高糖诱导后进行大蒜素处理是否能改善EMT 和炎症,为减少腹膜间皮细胞的损伤及改善腹膜透析相关性腹膜炎症的预后提供理论依据,为大蒜素在临床上的应用提供理论及实验依据。

1 材料和方法

1.1 细胞

人腹膜间皮细胞株HMrSV5,购自Procell 公司,货号:CP-H180。

1.2 主要试剂与仪器

葡萄糖(Solarbio,货号:G8150,规格:250 g);大蒜素(Solarbio,货号:SA8720,规格:20 mg)。 ELISA检测试剂盒(上海茁彩生物科技有限公司,货号:ZC-32420,ZC-32446,ZC-35733);肌动蛋白(β -actin)、酪氨酸蛋白激酶2(JAK2)、磷酸化的酪氨酸蛋白激酶2(p-JAK2)、磷酸化的信号转导和转录激活因子(p-STAT3)、信号转导和转录激活因子(STAT3)、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、E-钙粘蛋白(N-cadherin)、p65、pp65、波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白抗体(α-SMA)(abclonal,货号:AC026,A19629,AP0531,AP0705,A19566,A20798,A7277,A19083,A19653,AP0123,A19607,A17910);生物素化山羊抗兔IgG(abcam,货号:ab6721);人腹膜间皮细胞完全培养基(Procell,货号:CM-H180);胰酶(Hyclone,货号:SH30042.01);胎牛血清(TRAN,货号:P20522);双抗(Basalmedia, 货 号: S110JV); CCK-8 试 剂 盒(Biosharp, 货 号: BS350A); 无 菌 PBS 溶 液(Servicebio, 货 号: G4202)。 倒 置 生 物 显 微 镜(LEICA,型号DMI1);台式低速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司,型号TDZ4-WS);CO2培养箱(三洋电机国际贸易有限公司,型号:MCO-15AC);掌上离心机(赛洛捷克,型号:S1010E);酶标仪(Molecular Devices,型号:spectra max PLUS 384);垂直电泳槽(北京君意东方电泳设备有限公司,型号:JY-SCZ4+);电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司,型号:JY200C);水平脱色摇床(江苏科析仪器有限公司,型号:TY-80A);化学发光凝胶成像仪5200(上海天能科技有限公司);电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司生产,型号:DZKW-4)。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

将人腹膜间皮细胞HMrSV5 解冻离心后,用含10%胎牛血清的DMEM 培养基悬浮细胞在培养皿中进行接种,于37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。

1.3.2 细胞分组及处理

分组1:培养人腹膜间皮细胞后将其随机分为5组:①对照组;②8.5 mmol/L DG 组:8.5 mmol/L D-葡萄糖诱导组;③17 mmol/L DG 组:17 mmol/L D-葡萄糖诱导组;④34 mmol/L DG 组:34 mmol/L D-葡萄糖诱导组;⑤68 mmol/L DG 组:68 mmol/L D-葡萄糖诱导组。 除对照组外,其余各分别用8.5、17、34、68 mmol/L 的D-葡萄糖诱导48 h。 分组2:培养人腹膜间皮细胞后将其随机分为6 组:①对照组;②HG 组:34 mmol/L D-葡萄糖诱导组;③AL-L组:34 mmol/L D-葡萄糖+低剂量大蒜素诱导组;④AL-M 组:34 mmol/L D-葡萄糖+中剂量大蒜素诱导组;⑤AL-H 组:34 mmol/L-葡萄糖+高剂量大蒜素诱导组;⑥JAK2 组:34 mmol/L D-葡萄糖+JAK2 抑制剂诱导组。 对照组不做任何处理,HG 组用34 mmol/L 的D-葡萄糖诱导48 h,AL-L 组、AL-M 组、AL-H 组用34 mmol/L 的D-葡萄糖预处理6 h 后分别用10、20 和40 ng/mL 大蒜素诱导48 h,JAK2 组加入1 μmol/L AG490 预处理6 h 后用34 mmol/L的D-葡萄糖诱导48 h。

1.3.3 CCK-8 分析

取对数生长期的HMrSV5 细胞,PBS 洗涤,胰蛋白酶消化后收集,250 r/min 离心5 min,吸除上清液,加入适量培养基使其成为单细胞悬液;细胞计数后调节细胞密度为4×104/mL,每孔100 μL 接种于96 孔板中,37℃、5% CO2恒温培养。 待细胞贴壁后,根据1.3.2 进行分组并处理,用无血清培养基1 ∶10 稀释CCK-8 试剂,加入已稀释CCK-8 工作液每孔110 μL;并轻轻晃动培养板数次,37℃、5% CO2恒温继续培养2 h。 使用酶标仪在450 nm 波长处测定各孔的吸光值,根据公式细胞相对存活率=(各组OD 值/对照组平均OD 值)×100%,细胞抑制率=(1-实验组平均OD/对照组平均OD)×100%计算相应的细胞存活率及抑制率,并在光镜下观察细胞形态并拍照。

Grange 葛兰许：又叫 Bin 95，俗称澳洲酒王，为Penfolds旗下常规酒款中的最顶级，首个年份为1951。

1.3.4 ELISA 试剂盒检测

根据ELISA 试剂盒说明书检测各组细胞上清中白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)的含量。

1.3.5 蛋白免疫印迹(Western blot)

使用总蛋白提取试剂盒提取各组人腹膜间皮细胞的总蛋白,并用BCA 法进行定量。 各组取等量蛋白质用的SDS-PAGE 进行分离,分离后的蛋白质转移至PVDF 膜上,用5%的脱脂奶粉封闭1 h 后,加入β-actin、JAK2、 p-JAK2、 STAT3、 p-STAT3、 Ecadherin、MCP-1、N-cadherin、p65、p-p65、Vimentin、α-SMA 抗体,4℃孵育过夜后TBST 清洗,然后二抗孵育,TBST 清洗,ECL 暗室显色。 显色后的蛋白使用Bio-Rad 全功能成像系统采集图像,Image-Pro Plus 软件分析光密度,以β-actin 为内参,计算各组蛋白质的相对表达量。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计分析软件进行统计分析,数据用平均数±标准差(±s)表示。 对于各组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),对于组间均数的比较采用最小显著差数(LSD)法,以P＜0.05 作为评定差异有统计学意义的标准。

2 结果

2.1 HG 诱导对HPMCs 及JAK2/STAT3 信号通路的影响

2.1.1 HG 诱导对HPMCs 增殖的影响

与对照组相比,4 种浓度的葡萄糖都能不同程度地抑制HPMCs 的增殖。 其中8.5 mmol/L D-葡萄糖诱导组具有显著性的统计意义(P＜0.05),其余3 组有极显著性的统计意义(P＜0.01)。 34 mmol/L D-葡萄糖诱导组细胞的相对存活率是对照组的一半,其可以明显抑制HPMCs 增殖,但不会过度抑制,所以选择34 mmol/L D-葡萄糖为后续高糖诱导模型的浓度(见图1)。

注:与对照组比较, *P＜0.05, **P＜0.01。图1 高糖诱导对人腹膜间皮细胞增殖的影响Note.Compared with control group, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 1 Effects of hyperglycemia on proliferation of human peritoneal mesothelial cells

2.1.2 HG 诱导对HPMCs 形态学变化的影响

注:异常梭形细胞(⇧)。图2 高糖诱导对人腹膜间皮细胞形态学变化的影响Note.Abnormal spindle cells(⇧).Figure 2 Effects of high glucose induction on morphological changes of human peritoneal mesothelial cells

2.1.3 HG 诱导对HPMCs 发生EMT 的影响

通过Western blot 检测不同浓度的D-葡萄糖对EMT 相关蛋白表达的影响。 与对照组比,34 mmol/L D-葡萄糖诱导组显著下调E-cadherin 的表达(P＜0.05),68 mmol/L D-葡萄糖诱导组明显下调Ecadherin 和 上调N-cadherin 的 表 达(P＜0.01);34 mmol/L D-葡萄糖和68 mmol/L D-葡萄糖诱导组明显上调Vimentin 的表达,17 mmol/L D-葡萄糖、34 mmol/L D-葡萄糖和68 mmol/L D-葡萄糖诱导组均明显上调α-SMA 的表达(P＜0.01)(见图3)。

注:与对照组比较, *P＜0.05, **P＜0.01。图3 高糖诱导对EMT 发生标志蛋白表达的影响Note.Compared with control group, * P＜0.05, * *P＜0.01.Figure 3 Effects of high glucose induction on the expression of EMT marker protein

2.1.4 HG 诱导对HPMCs 中JAK2/STAT3 信号通路的影响

结果见图4,与对照组比较,34 mmol/L D-葡萄糖诱导组显著上调p-JAK2的表达(P＜0.05),68 mmol/L D-葡萄糖诱导组明显上调p-JAK2 和p-STAT3 的表达(P＜0.01);JAK2 和STAT3 蛋白表达在对照组与四种不同浓度的D-葡萄糖诱导组间无显著性差异(P＞0.05)。

注:与对照组比较, *P＜0.05, **P＜0.01。图4 高糖诱导对JAK2/STAT3 信号通路相关蛋白表达的影响Note.Compared with control group, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 4 Effects of high glucose induction on the expression of JAK2/STAT3 signaling pathway related proteins

2.2 大蒜素对HG 诱导的EMT 及其引起的炎症的影响

2.2.1 大蒜素对HG 诱导的EMT 中HPMCs 增殖的影响照组和34 mmol/L D-葡萄糖+JAK2 抑制剂诱导组(见图5)。

注:与对照组比较, **P＜0.01;与HG 组比较, ##P＜0.01。图5 大蒜素对高糖诱导的EMT 中人腹膜间皮细胞增殖的影响Note.Compared with control group, **P＜0.01.Compared with HG group, ##P＜0.01.Figure 5 Effects of allicin on proliferation of human peritoneal mesothelial cells in EMT induced by high glucose

2.2.2 大蒜素对HG 诱导的EMT 中HPMCs 形态学变化的影响

通过CCK-8 检测不同浓度的大蒜素对HPMCs增殖的影响,结果表明HG 的诱导明显下调HPMCs的相对存活率。 相比于HG 诱导组,实验中设置的不同浓度的大蒜素及均能明显上调HPMCs 的相对存活率(P＜0.01)。 其中34 mmol/L D-葡萄糖+高剂量大蒜素诱导组的促增殖作用最佳并接近于对观察HPMCs 形态学变化发现HG 的诱导后异常梭形的HPMCs 比例增多。 而与HG 诱导组相比,3 种浓度的大蒜素均能使异常的HPMCs 减少,并且大蒜素的浓度越高,异常形态细胞的比例就越少,其中34 mmol/L D-葡萄糖+高剂量大蒜素诱导组的细胞形态与对照组更接近(见图6)。

注:异常梭形细胞(■)。图6 大蒜素对高糖诱导的EMT 中人腹膜间皮细胞形态学变化的影响Note.Abnormal spindle cells(■).Figure 6 Effects of allicin on morphological changes of human peritoneal mesothelial cells in EMT induced by high glucose

2.2.3 大蒜素对HG 诱导的EMT 发生的影响

HG 诱导后E-cadherin 蛋白表达明显下调,Ncadherin、Vimentin 和α-SMA 蛋白表达明显上调(P＜0.01),而经3种浓度的大蒜素处理后,E-cadherin蛋白表达上调,N-cadherin、Vimentin 和α-SMA 蛋白表达下调。 其中34 mmol/L D-葡萄糖+中剂量大蒜素诱导组的E-cadherin、Vimentin 和α-SMA 蛋白表达与HG 诱导组有显著性差异(P＜0.05),34 mmol/L D-葡萄糖+高剂量大蒜素诱导组、34 mmol/L D-葡萄糖+JAK2 诱导组的EMT 发生相关蛋白表达与HG 诱导组有极显著差异(P＜0.01)。 34 mmol/L D-葡萄糖+高剂量大蒜素诱导组的EMT 发生相关蛋白的水平与对照组更接近(见图7)。

2.2.4 大蒜素对HG 诱导的EMT 引起的炎症的影响

如图8 所示,HG 诱导后IL-1β、IL-6 和TNF-α的含量明显升高(P＜0.01),而用3 种浓度的大蒜素及JAK2抑制剂处理后含量明显降低(P＜0.01)。其中34 mmol/L D-葡萄糖+高剂量大蒜素诱导组的IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平与对照组更接近。 HG 诱导后MCP-1 和p-p65 蛋白的表达明显上调,经不同浓度的大蒜素及JAK2 抑制剂处理后MCP-1 蛋白表达明显下调(P＜0.01),34 mmol/L D-葡萄糖+低剂量大蒜素诱导组p-p65 蛋白的表达显著下调(P＜0.05),34 mmol/L D-葡萄糖+中剂量大蒜素诱导组、34 mmol/L D-葡萄糖+高剂量大蒜素诱导组和34 mmol/L D-葡萄糖+JAK2 抑制剂诱导组p-p65 蛋白的表达明显下调(P＜0.01)。 p65 蛋白的表达在不同组间均无统计学意义(P＞0.05)。 34 mmol/L D-葡萄糖+高剂量大蒜素诱导组的炎性信号蛋白的水平与对照组更接近。

注:与对照组比较, **P＜0.01;与HG 组比较, #P＜0.05, ##P＜0.01。图8 大蒜素处理对炎性因子含量及炎性信号蛋白表达的影响Note.Compared with control group, **P＜0.01.Compared with HG group, #P＜0.05, ##P＜0.01.Figure 8 Effects of allicin treatment on the content of inflammatory factors and expression of inflammatory signaling proteins

3 讨论

上皮间质转分化是一种有助于伤口愈合的现象,但其会造成一些纤维化的疾病,比如腹膜纤维化[10]。 在PD 患者中,防止EMT 的发生可以改善腹膜纤维化,保护腹膜的功能[11]。 人腹膜间皮细胞是导致腹膜纤维化的主动参与者,其通过EMT 转变为成纤维细胞,对腹膜纤维化起到了重要作用[12]。 发生EMT 时,腹膜间皮细胞丧失黏附性及细胞间的紧密连接,获得侵袭及迁移的能力,进而侵入腹膜间皮下紧密带,并合成致炎因子、致血管生成因子和细胞外基质[3,13]。 本研究中用D-葡萄糖诱导后明显抑制了HPMCs 的增殖,并使其细胞形态呈现异常的梭形,同时,与EMT 的发生相关的上皮细胞标志E-cadherin 表达下调,间充质细胞标志α-SMA、N-cadherin 和 Vimentin 表达上调,这与Liu 等[14]和赵星旭等[15]研究结果一致,揭示此时HPMCs 发生了上皮间质转分化;而经大蒜素处理后,HPMCs 增殖明显提高,异常形态细胞比例减少,促进EMT 发生的间充质细胞蛋白表达显著降低,抑制EMT 发生的上皮细胞蛋白表达显著升高,揭示大蒜素能通过影响HPMCs 的增殖及形态和调节EMT 发生蛋白的平衡可以显著改善EMT。

JAK/STAT 信号通路是介导细胞因子信号转导的关键通路,其通过参与调节上皮细胞间的黏附影响上皮细胞癌恶性病变中细胞EMT 的发生[16]。 阻断JAK2/STAT3 信号通路时腹膜间皮细胞EMT 的发生被抑制[17]。 磷酸化的STAT3 形成二聚体后进入细胞核,促进纤维化和与促炎症因子相关的靶基因的表达[18]。 本研究中经D-葡萄糖诱导后,磷酸化的JAK2 和STAT3 的表达明显上调,揭示高糖诱导激活了JAK2/STAT3 信号通路促进了HPMCs 的上皮间质转分化。

炎症是腹膜纤维化的关键因素,其与纤维化相互诱导、相互促进[19-20]。 研究表明由免疫性细胞分泌的IL-1、IL-6、TNF-α 等促炎因子和IL-4、IFN-β、TGF-β 等抗炎因子在免疫反应和慢性炎症中发挥着关键的作用[21]。 细胞核因子-κB(NF-κB)信号通路被激活后会使IL-1β、IL-6 和TNF-α 等细胞炎症因子表达上调从而加剧炎症反应[22]。 而NF-κB 是由p50 和p65 亚基组成的异源性二聚体,是一种重要的胞浆内表达的多功能核转录因子,其激活后参与机体的慢性炎症、免疫反应等过程[23]。 MCP1 是机体内炎症级联的起始细胞因子,其分泌受到IL-1、TNF-α 等信号分子的诱导[24]。 本研究中用高糖诱导后HPMCs 的促炎症因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 明显升高,磷酸化的p50 比例升高,MCP1 表达明显上调,揭示此时HPMCs 的炎症加重,而大蒜素明显缓解了HPMCs 的炎症反应。

综上所述,高糖能使EMT 发生蛋白、炎症相关蛋白及细胞因子的表达异常,激活JAK2/STAT3 信号通路从而促进EMT 的发生,而大蒜素能通过恢复HPMCs 形态及增殖异常、调节与EMT 发生及炎症相关的蛋白及因子的水平使其逐渐恢复正常从而改善HPMCs 的上皮间质转分化及炎症。