高效液相色谱法测定蒲公英中菊苣酸含量的不确定度评定

赵贵琴，冷崇姣，赵 悦，徐 洋

（重庆市永川食品药品检验所，重庆 402160）

蒲公英为菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicumHand-Mazz.、碱地蒲公英Taraxacum borealisinenseKitam.或同属数种植物的干燥全草，2020 年版《中国药典（一部）》含量测定项下将指标性成分由咖啡酸更改为菊苣酸［1］。为此，本研究中基于《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1 - 2012）［2］、《化学分析中不确定度的评估指南》（CNAS - GL006：2019）［3］及《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196-2006）［4］，并参考文献［5-10］，采用高效液相色谱（HPLC）法测定蒲公英的含量，进行不确定度分析，找出试验过程中的影响因素，提高测定数据的准确性，为检验检测报告的合理评价提供可靠依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UltiMate 3000型高效液相色谱仪（美国Thermo Scientfic 仪器有限公司）；XP205 型电子天平（梅特勒-托利多仪器<上海>有限公司，精度为十万分之一）；Milli-QDirect8 型超纯水机（美国Millipore 公司）；IDH20 型超声波提取器（爱安姆科技北京有限公司，功率为400 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

蒲公英饮片（某药业有限公司，批号为220701）；菊苣酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号为111752-202105，含量为98.3%）；甲醇、甲酸均为色谱纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters XBridge Shield RP18 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（程序见表1）；流速：1 mL/ min；柱温：30 ℃；检测波长：327 nm；进样量：10 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序（%）Tab.1 Gradient elution program of the mobile phase（%）

2.2 溶液制备

取菊苣酸对照品适量，精密称定，加80%甲醇制成每1 mL 含菊苣酸0.2 mg 的溶液，即得对照品溶液。取样品粉末（过4 号筛）0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇20 mL，称定质量，超声处理（功率为400 W，频率为40 kHz）20 min，放冷，再称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 测定方法

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算含量。

2.4 方法学考察

以菊苣酸对照品溶液质量浓度（X）为横坐标、峰面积积分值（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=4 195.2X-159.94，r= 0.999 6，表明菊苣酸质量浓度在0.224～2.243 mg/ mL 范围内与峰面积积分值线性关系良好。按2.1项下色谱条件对同一对照品溶液重复进样测定6 次，结果的RSD为0.71%（n= 6），表明仪器精密度良好。依法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件分别于0，2，4，6，12，24 h 时进样测定，结果的RSD为1.93%（n=6），表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。制备供试品溶液6 份，按2.1 项下色谱条件进样测定，结果的RSD为0.48%（n=6），表明方法重复性良好。加样回收试验的回收率为101.08%，RSD为1.12%（n= 6），表明方法准确度好。

2.5 含量测定的不确定度评估

2.5.1 数学模型建立

根据高效液相色谱外标法以峰面积为指标计算含量的基本原理，按公式（1）计量蒲公英中菊苣酸含量。

式中，X为蒲公英中菊苣酸的含量（%）；A供为供试品峰面积；W对为对照品称样量；p为对照品纯度；V供为供试品溶液稀释体积；A对为对照品峰面积；W供为供试品称样量；V对为对照品溶液稀释体积。

2.5.2 不确定度来源识别

由含量测定过程和数学模型可知，供试品溶液中菊苣酸的含量测定不确定度来源包括对照品纯度，对照品、供试品称样量，对照品溶液、供试品溶液制备过程中稀释体积，对照品、供试品峰面积，液相色谱仪器性能稳定性。

2.5.3 标准不确定度分析与计算［11-18］

1）对照品纯度引入的相对标准不确定度［u（rp）］

菊苣酸对照品说明书中未提供相关不确定度的参考数值，假定其分散区间的半宽度α= 0.25%，按矩形分布，包含因子（k）为，则u（rp）= 0.25%/（×98.3%）=1.47×10-3。

2）对照品称样量引入的相对标准不确定度［u（rW对）］

所用电子天平（d=0.01 mg）示值的最大允许误差为±0.05 mg，天平重复性的最大允许误差为0.02 mg，服从矩形分布k=。称取菊苣酸对照品2份，称量值分别为11.35 mg和10.94 mg，故天平称量的相对标准不确定度为u1= 0.05/= 2.89 × 10-2，u2= 0.02/=1.15×10-2。

3）对照品溶液制备过程中稀释体积引入的相对标准不确定度［u（rV对）］

示值误差：根据《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196-2006）规定，50 mL A级容量瓶容量允许误差为±0.05 mL，校准标准不确定度按三角分布k=，则标准不确定度为u校准（V对）=0.05/=2.04×10-3。

温度：容量瓶校准温度为20 ℃，而本研究中温度在（20±5）℃范围内，甲醇体积膨胀系数为1.2×10-3℃，水体积膨胀系数为2.07×10-3℃，则80%甲醇体积膨胀系数为1.37×10-3℃，温度变化服从矩形分布k=，则u温度（V对）=5×1.37×10-3×50/?=1.40×10-1。

由2种 分 量 合 成 得ur（V对）=［u校准(V对)2+u校准(V对)2］0.5/50=2.83×10-3。

4）对照品峰面积引入的相对标准不确定度［u（rA对）］

取对照品溶液，平行2 份，按2.1 项下色谱条件分别进样测定3 次，记录峰面积X（A对1）为8 421.52，8 438.86，8 421.54，平均值为8 427.31，极差（R）为17.34，用极差法计算，取n= 3 时的极差系数（C）为1.69，其标准不确定度为S（A对1）=R/C= 10.26，相对标准不确定度为u（rA对1）= 1.22 × 10-3。X（A对2）为7 886.14，7 878.45，7 884.91，平均值为7 883.17，R为7.69，S（A对2）=4.55，u（rA对2）=5.77×10-4，合成对照品色谱峰面积不确定度u（rA对）=1.35×10-3。

5）供试品称样量引入的相对标准不确定度［u（rW供）］

所用电子天平（d=0.01 mg）示值的最大允许误差为±0.05 mg，天平重复性的最大允许误差为0.02 mg，服从矩形分布k=。称取供试品2 份，称量值分别为470.3 mg 和503.7 mg，故天平称量的相对标准不确定度为u1= 0.05/= 2.89 × 10-2，u2= 0.02/=1.15×10-2。

ur（W供）=［(3.11× 10-2/470.3)2+（3.11 × 10-2/503.7）2］0.5=9.05×10-5

6）供试品溶液制备过程中稀释体积引入的相对标准不确定度［ur（V供）］

示值误差：根据《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196-2006）规定，20 mL A 级单标移液管允许误差为±0.030 mL，校准标准不确定度按三角分布k=，则标准不确定度为u校准（V供）=0.030/=1.22×10-2。

温度：移液管校准温度为20 ℃，而本研究中温度控制在（20 ± 5）℃范围内，甲醇体积膨胀系数为1.2 ×10-3℃，水体积膨胀系数为2.07 × 10-3℃，则80%甲醇体积膨胀系数为1.37 × 10-3℃，温度变化服从矩形分布k=，则u温度（V供）=5×1.37×10-3×20/=7.91×10-2。

由2 种 分 量 合 成 得 到ur（V供）=［u校准(V供)2+u校准(V供)2］0.5/50=8.00×10-2。

7）供试品峰面积引入的相对标准不确定度［ur（A供）］

取供试品溶液，平行2 份，按2.1 项下色谱条件分别进样测定2 次，记录峰面积X（A供1）为997.57 和999.54，平均值为998.56，R为1.97，用极差法计算，取n= 2 时的C为1.13，其标准不确定度为S（A供1）=R/C=1.74，相对标准不确定度为ur（A供1）=1.74×10-3。X（A供2）为1 087.33 和1 090.15，平均值为1 088.74，R为2.82，S（A供2）=2.50，ur（A供2）=2.29×10-3，合成供试品色谱峰面积不确定度ur（A供）=2.88×10-3。

8）仪器性能稳定性引入的相对标准不确定度［ur（E）］

根据仪器检定证书提供的整机性能定量重复性为0.54%，按矩形分布k=，则u（rE）= 0.54%/=3.12×10-3。

2.5.4 相对标准不确定度汇总

将8个分量的数值、相对标准不确定度及其所占百分比进行归纳，详见表2。

表2 各分量的相对标准不确定度分布Tab.2 Distribution of relative standard uncertainty of each component

2.5.5 合成标准不确定度评定

ur（X）2=ur（A供）2+ur（W对）2+ur（A对）2+ur（W供）2+ur（p）2+ur（V对）2+ur（V供）2+ur（E）2=0.006 4

ur（X）=0.08

供试品中菊苣酸的含量为0.14%，合成标准不确定度为u（X）=C×ur（X）=0.14%×0.08=0.01%。

2.5.6 扩展不确定度评定

假定蒲公英中菊苣酸含量的测定结果符合正态分布k=2，置信概率为95%时，扩展不确定度为u=k×u（X）=2×0.01%=0.02%。

2.5.7 检验结果

以测定值± 扩展不确定度表示，蒲公英中菊苣酸含量最终测定结果为（0.14±0.02）%，k=2。

3 讨论

本研究中不确定度影响因素除对照品和供试品的称量、制备及稀释过程中的温度、玻璃容器的校准外，还将高效液相色谱仪的性能纳入评定范围。由表2 可知，检验过程中供试品溶液稀释体积的影响占比最大。在药品分析与检测过程中，应定期对玻璃仪器进行校准，并严格控制实验室环境条件，并进行规范化操作。对照品的称样量对含量测定过程有较大影响，在日常工作中要尽量减少因称量带来的误差影响，更好地控制药物分析的结果。仪器性能在一定程度上会对检测结果产生影响，定期对仪器进行期间核查和检定校准，加强仪器的维护保养，确保仪器始终处于良好的工作状态，有助于提高检验的准确性［19-20］。

综上所述，为提高试验数据的可靠性，降低试验报告的风险，在检验工作中的数据边缘临界值或低于标准限值时引入不确定度分析更具有说服力，通过不确定度评定提高日常检验工作质量。本研究结果可为高效液相色谱法测定其他中药饮片含量的不确定度评定提供参考。