真空衰减法测定劳拉西泮注射液的包装密封性*

高梓真，毛文星，周 琪，金 鑫，王佳瑜，许向阳△

（1.江苏恩华药业股份有限公司药物研究院·江苏省中枢神经药物研究重点实验室，江苏 徐州 221000； 2.重庆市食品药品检验检测研究院·国家药品监督管理局麻醉精神药品质量监测重点实验室，重庆 401121）

1 仪器与试药

1.1 仪器

VeriPac455 - M5 型真空衰减检漏仪（美国PTI 公司）；FCO210型流量计（英国Furness公司）；HVA 110型高压灭菌锅（日本Hirayama 公司）；ESCO AC2 - 4S1 型生物安全柜（新加坡ESCO公司）；Memmert INB500型恒温培养箱（德国Memmert公司）；BX51-32型显微镜（日本Olympus 公司）；MFY - HS 型智能密封仪（济南三泉中石实验仪器有限公司）。

1.2 试药

中硼硅玻璃管制注射剂瓶（批号为220092001），抗生素瓶用铝塑组合盖（批号为S2009001），注射液用卤化丁基橡胶塞（溴化，批号为S200811501），均购自山东力诺特种玻璃股份有限公司；铜绿假单胞菌［中国食品药品检定研究院，编号为CMCC（B）10104，代数为3］；胰酪大豆胨液体培养基（批号为20200903），绿脓菌素测定培养基（批号为20201012），均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；劳拉西泮注射液（江苏恩华药业股份有限公司，规格为每支1 mL∶2 mg，批号分别为SLZ220901，SLZ220902，SLZ220903）。

2 方法与结果

2.1 样品制备

阳性样品：参照ASTM F2338 - 09，采用激光打孔法制备名义孔径为3，5，10 μm的阳性样品，并通过流量计校准孔径大小，结果见表1和图1。向空阳性瓶中分别加入1 mL 劳拉西泮注射液，轧盖，密封，即得真空衰减法阳性样品。在无菌环境下，向空阳性瓶中加入1 mL无菌胰酪大豆胨液体培养基，轧盖，密封，即得微生物挑战法阳性样品。

A - C.阳性样品（名义孔径分别为3，5，10 μm） D - E.漏孔照片图1 不同孔径激光打孔阳性样品A - C.Positive samples（with nominal pore sizes of 3，5，and 10 μm，respectively） D - E.Photos of laser perforation leakageFig.1 Positive samples with different pore sizes by laser drilling

表1 不同孔径阳性样品校验结果（μm）Tab.1 Results of positive samples with different pore sizes（μm）

阴性对照样品：选用流量计模拟孔径进行样品线性研究，流量计流量与漏孔孔径对应关系见表2。以泄露量（X，cc/min）为横坐标、差压平均值（Y，Pa）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=474.72X+17.82，结果表明线性良好（R2=0.999 6，n=6）。取生产线上生产的完好产品，经流量计检测，取泄漏量为0 cc/min 的样品，即得真空衰减法阴性对照样品。在无菌环境下，向药品包装中加入1 mL 无菌胰酪大豆胨液体培养基，轧盖，密封，经流量计检测，取泄漏量为0 cc/min 的样品，即得微生物挑战法阴性对照样品。

表2 流量计流量与漏孔孔径对照表（cc/min）Tab.2 Correspondence between the flow rate of the flow meter and the diameter of the leakage hole（cc / min）

2.2 真空衰减法参数选择

对测试压力（真空度）、平衡时间（保压时间）、测试时间、泄压时间进行优化，参数见表3。

表3 劳拉西泮注射液真空衰减法检测参数Tab.3 Detection parameters of Lorazepam Injection by the vacuum decay method

2.3 方法学验证

泄漏阈值（P/ F 值）确定：以绝压值和差压值为依据，以劳拉西泮注射液为阴性样品进行测试，共测试3 d，每天测试30 支，总共不少于90 次。结果阴性对照样品的平均绝压值为433.8 mbar，平均差压值为14.0 Pa，标准偏差（σ）分别为0.5 和0.6。按“平均值+ 6σ”进行计算，绝 压P/ F 阈 值 为436.8 mbar，差 压P/ F 阈值 为17.6 Pa。详见表4。后续检测样品时，若绝压检测值大于绝压P/F 阈值或差压检测值大于差压P/F 阈值时，则判定为“泄漏”；反之，则判定为“不泄漏”（大漏样品通过绝压P/F阈值来判断）。

表4 阴性样品压力检测结果（n=30）Tab.4 Results of the pressure test of negative samples（n = 30）

准确度试验：将5支阴性对照样品和不同孔径的阳性样品各4 支随机混合，分3 个时间段（T1，T2，T3）进行检测，记录泄露情况。阴性对照样品的检测结果为不泄漏（-）时为准确，阳性样品为泄漏（+）时为准确。结果阴性对照样品的检测结果均为不泄漏，名义孔径为3，5，10 μm 的阳性样品的检测结果均为泄漏，表明方法准确度为100.00%。详见表5。

表5 准确度试验结果Tab.5 Results of the accuracy verification test

重复性试验：将5支阴性对照样品和不同孔径的阳性样品各4 支随机混合，分3 个时间段（T1，T2，T3）进行检测，记录差压值和绝压值。结果重复性试验的RSD均小于10%，表明方法重复性良好，能满足样品的密封完整性检测。详见表6。

表6 重复性试验结果Tab.6 Results of the repeatability test

中间精密度试验：将5支阴性对照样品和不同孔径的阳性样品各4支随机混合，由不同试验人员连续检测2 d（D1，D2），记录差压值和绝压值。结果中间精密度试验的RSD均小于10%，表明方法中间精密度良好，能满足样品的密封完整性检测。详见表7。

表7 中间精密度试验结果Tab.Results of the intermediate precision test

检测限确定：由准确度和精密度试验结果可知，本研究中建立的方法检测限为3 μm。

大漏样品测定：以装有1 mL 劳拉西泮注射液但不轧盖、密封的中硼硅玻璃管制注射剂瓶作为大漏样品（孔径为9 mm），对大漏样品进行检测，记录泄露情况，泄漏记作“+”，未泄漏记作“-”。共测试5支大漏样品，结果均泄漏，检出率为100.00%，表明方法的检测范围较宽，即不小于3 μm。详见表8。

表8 大漏样品测定结果Tab.8 Detection results of large leakage samples

耐用性试验：对表3 确定的检测参数进行微调，测试阳性样品和阴性对照样品，记录泄漏情况，泄漏记作“+”，未泄漏记作“-”。通过对测试压力（真空度）、平衡时间（保压时间）、测试时间进行微调，阴性对照样品和不同孔径阳性样品检出率均为100.00%，表明方法耐用性良好。详见表9。

表9 耐用性试验结果Tab.9 Results of the durability test

2.4 真空衰减法与微生物挑战法比较

菌悬浮液制备：药品包装系统内外均为有氧环境，应选择需氧菌作为微生物挑战法测试的目标菌株［12-13］。铜绿假单胞菌是一种革兰阴性需氧杆菌，菌长为1.5～3.0 μm、宽为0.5～0.8 μm，体积和尺寸均较小，易从漏孔侵入，故选择铜绿假单胞菌作为目标菌株［14-15］。取铜绿假单胞菌ATCC 27853 适量，接种于10 mL无菌胰酪大豆胨液体培养基，35 ℃、180 r/min振荡培养6 h，取少量菌液，用无菌生理盐水进行梯度稀释，采用菌落计数法进行计数，菌悬液浓度应不低于105cfu/mL［16］。

微生物侵入试验：将阳性样品（名义孔径分别为3，5，10 μm）和阴性对照样品完全浸泡在铜绿假单胞菌菌悬液中，置智能密封仪的压力仓内，于负压压力-60 kPa、负压时间5 min、正压压力+80 kPa、正压时间10 min 的条件下进行微生物侵入试验。侵菌试验结束后，将阴性对照样品和阳性样品置35 ℃培养箱中培养14 d，逐日观察并记录。结果当阳性样品名义孔径分别为3，5，10 μm 时，微生物侵入率分别为70.00%，90.00%，100.00%；阴性对照样品微生物侵入率为0。详见表10。

表10 微生物挑战法检测结果Tab.10 Results of the microbiological challenge method

检出率比较：真空衰减法和微生物挑战法对劳拉西泮注射液包装密封性检出结果见图2。结果表明，真空衰减法灵敏度较微生物挑战法更高，更有利于确保劳拉西泮注射液的包装密封性。

图2 真空衰减法与微生物挑战法检出率比较Fig.2 Comparison of detection rates between the vacuum decay method and the microbial challenge method

2.5 加速试验

采用劳拉西泮注射液（规格为每支1 mL∶2 mg，批号分别为SLZ220901，SLZ220902，SLZ220903）模拟市售包装，进行3 个月的加速试验，温度为（40 ± 2）℃，相对湿度为（75±5）%。采用本研究中建立的真空衰减法检测劳拉西泮注射液的包装密封性，泄漏记作“+”，未泄漏记作“ -”。结果3 批样品均未泄漏，表明市售劳拉西泮注射液（规格为每支1 mL∶2 mg）具有良好的密封完整性。详见表11。

表11 加速试验结果Tab.11 Results of the accelerated test

3 讨论

本研究中参照USP 1207 和ASTM F2338 - 09 建立了测定劳拉西泮注射液包装密封性的真空衰减法的检测参数，即真空度5 mbar、保压时间4.0 s（Cycle 1），真空度1.4 mbar、保压时间3.0 s、测试时间16.0 s、泄压时间4.0 s（Cycle 2）。采用该方法对阴性对照样品进行多次检测，确认泄漏阈值为绝压P/F阈值436.8 mbar、差压P/F阈值17.6 Pa。经测试，当阳性样品名义孔径为3 μm及以上时，真空衰减法检出率均为100.0%。采用铜绿假单胞菌ATCC 27853 进行微生物挑战试验，经测试，当阳性样品名义孔径为3，5，10 μm 时，侵入率分别为70.00%，90.00%，100.00%。本研究中针对劳拉西泮注射液建立的真空衰减法灵敏度为3 μm，较微生物挑战法的灵敏度更高，该方法可在不破坏产品及其包装的基础上有效保障劳拉西泮注射液的密封完整性，确保劳拉西泮注射液的质量符合要求，保障其在有效期内安全、可控，并为其他类似包装的药品检测提供参考。