Notch信号通路在卵巢癌中的研究进展

刘志彬，岳文涛

(首都医科大学附属北京妇产医院/北京妇幼保健院中心实验室，北京 100026)

近年来卵巢癌患者死亡率高达5%[1]。如此高的致死率是因为其隐蔽性强、早期诊断难度大，70%以上的患者在被确诊时已处于疾病晚期，错过了最佳治疗时机。虽然临床放疗、药物治疗等标准治疗方法对患者病情有所缓解，但是60%以上晚期患者对一线抗癌药物，如顺铂、紫杉醇等，容易产生耐药性，患者5年生存率不足40%[2]。因此，有必要针对卵巢癌发展进程及耐药分子机制进行深入、系统地研究，寻找有效诊断、治疗靶点。

Notch 信号通路是一种传递细胞之间信号的通路，同时也是一种在进化上高度保守的信号通路。Notch 通过相邻细胞之间的相互作用，广泛参与多种细胞的增殖、分化、衰老以及凋亡等过程。研究表明，Notch 信号通路不仅在正常细胞中发挥重要的信息传递作用，还参与几乎所有癌症的发展进程[3]。但Notch 信号通路在癌症生物学中的作用存在争议，因为它已经被证明在多种类型的癌症中发挥促癌和肿瘤抑制作用。这种不一致适用于甲状腺癌、肝癌等多种癌症，表明Notch 信号通路在癌症中的功能依赖于其所处的细胞类型和微环境。近年来，越来越多的科学研究将Notch 信号通路与卵巢癌联系起来。因此，阐明Notch 在卵巢癌发生发展中的重要作用，有助于了解卵巢癌的发病机制，并且为基于Notch 信号通路的肿瘤靶向治疗提供重要的证据。

在此，本综述简要总结了正常Notch 信号通路的关键步骤和调节因子，然后归纳Notch 在卵巢癌中的作用及分子机制。对卵巢癌中Notch 信号通路的功能和机制理解越清晰，越有助于了解卵巢癌发生机制，同时可以帮助开发新的肿瘤诊断、治疗策略，使患者获益。

1 经典Notch信号通路简介

Notch 信号通路最早是由美国学者Dexter 在黑腹果蝇中发现典型的缺口翅(notched-wing)突变表型[4]，3年后另一位美国学者Morgan 发现导致果蝇缺口翅突变表型的等位基因是Notch[5]。此后，越来越多的科学文献发现Notch 在多细胞生物的发育过程中发挥重要作用。

Notch 信号通路主要组分包括配体、受体、激酶和靶基因。配体与受体的结合标志着Notch 信号通路激活，其具体活化过程如图1所示，当Notch配体结合到受体的Notch胞外结构域(Notch extracellular domain，NECD)时，促进受体分解，经ADAM 金属蛋白酶切割跨膜结构域外部S2 位点和γ分泌酶切割跨膜结构域胞内段S3 位点，使得Notch 胞内结构域(Notch intracellular domain，NICD)释放到细胞质中，随后进入细胞核；入核后的NICD 与辅助激活因子MAML(mastermind-like)、DNA 结合因子RBPJ(也称为CSL)结合形成Notch 转录复合物，随即Notch转录复合物与Notch调控元件结合后，招募转录辅助调节因子，激活下游靶基因转录[6]。

2 Notch信号通路关键分子表达

人体中主要包含4 种Notch 受体，即NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4，和5 种配体，即δ样配体(delta-like ligand 1，DLL1)、DLL3、DLL4、Jagged1和Jagged2。诸多证据表明Notch 信号通路配体/受体失调与癌症相关。然而，关于Notch信号通路在卵巢癌中的报道较少。而且，Notch信号通路在卵巢癌中的作用似乎与Notch 受体/配体以及分析方法有关。已有研究人员针对Notch 信号通路中各配体和受体在卵巢癌中表达情况的分析，大多数是使用RT-PCR、免疫组织化学染色、Western blot 等技术，并且研究人员大多在卵巢癌患者的正常组织/卵巢癌组织，或者正常细胞系/卵巢癌细胞系中进行检测。Notch 信号通路中多种配体和受体在不同的卵巢癌细胞系、卵巢癌组织中表达水平各不相同，且各具特色，具体表达情况见表1。

表1 Notch信号通路中多种信号分子在卵巢癌中的表达情况

Hopfer等[7]于2005年发表了第一篇关于Notch信号通路在卵巢癌中表达的文献。文献通过RT-PCR 方法，对17 例卵巢腺癌、3 例交界肿瘤和12 例腺瘤检测发现Jagged2、DLL1、Manic Fringe、TSL 在卵巢腺癌中的表达频率更高，而Deltex、Mastermind 在腺瘤中表达频率更高。荧光定量PCR 检测到Notch1 mRNA 在卵巢腺癌中的表达低于腺瘤，利用Western blot检测Notch1、NECD在卵巢癌、交界肿瘤和腺瘤中的表达量相似，Notch1 下游靶蛋白HES1 在卵巢癌和交界肿瘤中表达量高于腺瘤，然而在卵巢腺癌和表面上皮细胞系中，HESl蛋白的表达水平相似，均较高。再者，Wang 等[17]利用免疫组织化学、Western blot和RT-PCR技术，在109例卵巢癌组织、65例对侧患者正常卵巢组织、48 例正常卵巢组织和卵巢癌细胞系检测Notch1表达。他们发现Notch1在卵巢癌组织的表达量明显高于匹配的正常卵巢组织，同时，Notch1 在卵巢癌细胞系A2780、HO-8910中高表达，而且Notch1的表达随着卵巢癌组织的分化不良和FIGO 分期的增加而逐渐增加。可见，对于同一因子，在不同的肿瘤组织中的表达水平是不同的。卵巢癌原发肿瘤中NICD的高表达是总生存率的一个独立不良预后因素[18]。除了以上的实验检测，研究人员也进行了大数据分析。Defreitas 等[13]利用生物信息学方法分析CSIOVDB、PRECOG、GENT和CCLE多种数据库，系统地揭示了NOTCH2、NOTCH3和MAML1在卵巢癌中高表达，且对患者整体生存期至关重要。此外，Choi等[8]发现Jagged1是卵巢肿瘤细胞以及与扩散的卵巢癌细胞直接接触的腹膜间皮细胞中表达最高的Notch 配体。免疫组化检测Jagged1、Notch3 在60 例高级别浆液性卵巢癌中高表达。综合以上的实验检测和生物信息学分析，我们发现有关Notch 信号通路中其他组分表达情况的文献不多，并且结论存在相互矛盾，因此需要更多实验数据才能得出结论。

综上，Notch1-3、Jagged1 和Hes1 等在恶性程度高的卵巢癌中表达更高，卵巢癌中Notch 信号通路组分蛋白的表达上调，伴随总生存期和无病生存期缩短，尤其是在晚期肿瘤患者中。因此，推测Notch 可以作为不良预后的标志。随着科学技术的不断发展，相信不久的将来，我们能在单细胞水平解析卵巢癌发展的多个进展时期各种细胞类型的变化情况，也能够解析癌症进展到不同时期Notch 信号通路在何种细胞有何等水平的表达，有望从分子水平、单细胞层面探究卵巢癌细胞发生发展的分子机制和耐药机制。

3 Notch在卵巢癌中作为促癌信号通路

3.1 Notch配体的促癌作用机制

卵巢癌中，针对Notch 信号通路配体的研究主要聚焦在Jagged1、Jagged2、DLL4，且对卵巢癌增殖、侵袭、迁移以及上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)等过程起促进作用。研究证实，过表达Jagged1 可以促进卵巢癌增殖、侵袭、迁移和肿瘤形成，同时增强卵巢癌细胞顺铂耐药性[8-9]；机制研究指出Gata1可以结合到Jagged1启动子区直接发挥作用，调控卵巢癌增殖、迁移等过程[9]。相反的，敲低Jagged1 抑制卵巢癌细胞增殖和顺铂耐药细胞的EMT 过程，以及对肿瘤临近细胞的黏附和生长作用[8，11]。并且，Jagged1除与Notch3互相作用影响卵巢癌增殖之外，Jagged1也可与STAT3直接结合，作用于卵巢癌侵袭和迁移等过程[11]。类似地，敲低Jagged2同样能够抑制顺铂耐药卵巢癌细胞的EMT过程[11]；在中性粒细胞中敲低Jagged2，则能干扰T细胞的免疫活性[19]。另有临床前研究指出，表达Jag和Delta的小血管附近的卵巢肿瘤细胞中优先发生Notch 激活现象，而且通过抗体阻断基质细胞中的DLL4能够有效抑制卵巢癌，尤其是通过抗体联合阻断DLL4和血管内皮生长因子VEGF，可明显增强靶向DLL4的抗肿瘤作用[20]。此外，研究者在人的卵巢癌组织中检测到DLL1、DLL3表达，但是DLL1、DLL3在卵巢癌中的具体作用尚待研究。

3.2 Notch受体的促癌作用机制

Notch 受体与配体的促癌功能表型一致。过表达Notch1 能够促进卵巢癌的增殖能力、EMT 和迁移，并且机制研究发现Notch 和TGFβ形成了一个相互的正向调控回路发挥功能[7，21]。可见，Notch 信号通路调控卵巢癌的增殖、迁移和EMT 过程不是独立的，需要其他信号通路的协助作用。此外，Park 等[22]通过单核苷酸多态阵列技术发现Notch3 在卵巢癌组织中DNA 拷贝数增多，Notch3功能敲低后，导致卵巢癌细胞增殖减少、凋亡增加。这预示着Notch3拷贝数增多，影响患者不良预后。通过机制研究发现，Notch3下游直接靶标为Pbx1，Notch3/CSL蛋白复合物能够直接结合到Pbx1 启动子区域，促进Pbx1 转录，而且过表达Pbx1 可以部分恢复因Notch 抑制剂GSI 引发的卵巢癌细胞增殖抑制现象[14]。由此，可以看出Notch 信号通路也可以独立调控卵巢癌的发展进程。随后，研究人员发现Notch3不仅影响卵巢癌细胞的发展，也影响肿瘤干细胞及其对药物的敏感性。McAuliffe 等[23]发现在肿瘤细胞中过表达Notch3，可以增强卵巢肿瘤干细胞的扩增和铂类耐药性，敲低Notch3能够降低肿瘤干细胞扩增能力、增强卵巢肿瘤细胞对铂类药物的敏感性。除此之外，Kang等[15]在紫杉醇耐药的卵巢癌细胞系(SKpac)中，利用siRNA 敲低Notch3，同样发现抑制Notch 信号通路能够增强紫杉醇耐药的卵巢癌细胞对紫杉醇药物的敏感性。另外，在经顺铂治疗的卵巢癌细胞系中过表达Notch 下游靶基因Hes1，将增强肿瘤干细胞的成瘤性、干性和顺铂耐药性[24]。这再次证明了Notch 信号通路影响卵巢肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性，进而影响卵巢癌患者的治疗效果。由此可见，Notch 受体在卵巢癌中起促癌作用，同时还影响肿瘤细胞对药物的耐药性。在肿瘤细胞中，不同的Notch 受体是同时对肿瘤细胞发挥作用还是独立影响，以及受体之间的网络调控关系，需要后续研究验证。

3.3 Notch信号通路抑制剂的临床前研究现状

目前Notch 抑制剂作为抗癌药物被广泛研究[25]，靶向Notch作为卵巢癌的新治疗策略尚处于临床前阶段，未转化为Notch抑制剂与常规疗法相结合的临床试验。DAPT能够抑制Notch信号通路活性，可以有效抑制卵巢癌细胞增殖，使细胞周期停滞在G1期，明显促进细胞凋亡[12]。同时，DAPT 也能抑制铂耐药卵巢癌细胞系的增殖、迁移、侵袭和EMT过程[11]。γ-分泌酶抑制剂(GSI)是另一种Notch 信号通路抑制剂，顺铂/GSI 联合疗法通过增强DNA 损伤反应、G2/M 细胞周期停滞和细胞凋亡，对Notch 依赖性肿瘤细胞具有协同细胞毒作用[23]。Notch 抑制剂作为新的诊断、治疗靶点，仍然需要探索。

3.4 Notch信号通路上游调控因子的研究现状

卵巢癌中Notch信号通路异常激活可以通过Notch抑制剂阻断，还可以考虑通过其上游因子调控。在卵巢癌中，关于Notch 信号通路上游因子的文章报道有限。上游因子作用于Notch 信号通路的分子机制尚不完全清楚。例如糖基转移酶GnT-III、LnRNA 类固醇受体激活物(steroid receptor activator，SRA)和黄腐酚。糖基转移酶GnT-III 在上皮性卵巢癌中缺陷能够抑制Notch1由溶酶体外转入溶酶体内，该研究说明了二等分糖基化可调控Notch信号通路转导[26]。而LnRNA SRA介导卵巢癌增殖、迁移、侵袭，并且体内和体外的实验证明其影响EMT和Notch 信号通路相关蛋白的表达[27]。此外，黄腐酚具有抑制芳香化酶(睾丸酮转化成雌激素)的活性，研究证实黄腐酚能够明显抑制Notch1表达，同时抑制卵巢癌细胞系增殖，促进细胞凋亡，并破坏细胞周期[28]。因此，通过控制上游因子干预Notch信号通路异常激活是一种很有吸引力的潜在策略，同时也需要基础研究不断探索。

总之，Notch 信号通路不仅参与卵巢癌的发生、发展，还参与卵巢癌的化学耐药。但是，Notch 信号通路与卵巢癌之间的细微关系仍未阐明，需要更多的基础和临床研究者进一步深入研究。

4 展 望

虽然，Notch 信号通路在卵巢癌中的作用还未被完全揭示，Notch 信号通路在卵巢癌中作用的因果关系仍不明朗，但是从目前的研究我们仍可以看出Notch 信号通路对卵巢癌发生发展、耐药性起到正向的调节作用，作用方式可以是细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡等，同时也需要其他信号通路的协助，如TGFβ信号、PI3K/AKT 等。鉴于Notch 信号通路在其他癌种、生物体正常发育过程中均发挥重要作用，而且在正常细胞和肿瘤细胞中作用不同，提示我们确定Notch 信号通路在卵巢癌中的作用，不能单纯通过其他细胞类型的研究进行推断，仍然需要研究者深入、细致地探究Notch 信号通路在卵巢癌中的具体分子作用机制和耐药机制。或许这将为卵巢癌的早期诊断开发新的生物标志物，指导Notch 信号通路抑制剂进行临床试验。结合日趋完善的生物学技术，如时空特异性、单细胞测序、大数据分析等，即使Notch 信号通路由于其自身作用的复杂性，不能直接作为用药或者治疗的分子靶标，由其引申的下游效应因子、靶向抑制剂等，或有望个性化地诊断和治疗卵巢癌。