非小细胞肺癌患者血清miR-146a与TNF-α、Treg的相关性及其对预后判断的价值

许金花，李静静，吴国峰，任亚俊，王 雪，张骞云，*

(1.沧州市中心医院呼吸与危重症医学二科，河北 沧州 061014；2.沧州市中心医院麻醉二科，河北 沧州 061014)

肺癌死亡率在所有肿瘤中居第1 位，据GLOBOCAN 估计，2020 年全球新发的肺癌病例约220万，占全部恶性肿瘤的11.4%[1-2]。非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)约占肺癌总数的85%[3]。以顺铂联合多西他赛为主的化疗方案能够有效抑制肿瘤，但会产生严重毒副作用[4]。目前NSCLC的5年生存率低于20%[5]。近年来，肺癌患者的个体化治疗研究越来越深入，识别预测NSCLC患者预后的因素将很大程度上有助于评估预后分层及制定个体化治疗方案，从而提高生存率。因此，需要找到能预测NSCLC 预后的指标。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)属于多肽超家族，能够影响细胞增殖，与炎症反应相关[6]。调节性T 细胞(regulatory T cells，Treg)是新发现的T 细胞亚群，能够维持机体免疫功能稳定[7]。TNF-α和Treg 与NSCLC 的病情严重程度密切相关，但是二者对患者预后判断的价值尚未深入研究。近年来发现，miR-146a参与炎症反应，对肺炎、脓毒症等疾病有较好的预测价值[8-9]，但其与NSCLC 的预后报道较少。本研究拟探讨血清中miR-146a 水平对NSCLC 患者预后判断的价值，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 患者资料

选择2020年6月—2021年11月在沧州市中心医院住院治疗的晚期NSCLC 患者162例，所有患者均签署知情同意书。本研究已通过医院伦理委员会批准[2020-204-02(Z)]。病例纳入标准：①符合NSCLC 的诊断标准，经病理确诊；②临床分期为IIIa、IIIb或IV期；③估计生存时间大于6个月；④卡氏评分(KPS)大于60 分。病例排除标准：①具有严重的心、肺、肝、肾等功能障碍；②肿瘤脑转移；③有艾滋病、活动性肺结核等传染病；④存在严重感染性疾病；⑤存在精神类疾病；⑥存在其他恶性肿瘤。

1.2 试剂和仪器

1.2.1 试剂miRNA提取分离试剂盒购自凯杰生物工程(深圳)有限公司，miRNA的cDNA反转录试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司，miRNA荧光定量检测试剂盒购自上海泽叶生物科技有限公司，miR-146a引物购自上海生物工程公司，TNF-α酶联免疫试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司

1.2.2 仪器实时荧光定量PCR 仪购自Applied Biosystems 公司，FACB Canto II 流式细胞仪购自BD公司。

1.3 实验方法

1.3.1 miR-146a 相对表达水平检测所有受试者化疗前和2 周期化疗结束后均抽取空腹静脉血3 mL，3 000 g 离心10 min，取上层血清。采用miRNA 提取分离试剂盒提取血清中miRNA，采用miRNA 的cDNA反转录试剂盒将miRNA 反转录为cDNA。根据miRNA荧光定量检测试剂盒说明书配制反转录体系，将配置好的体系放入实时荧光定量PCR仪进行扩增。反应程序为：95 ℃加热1 min，进行40个循环，每个循环包括95 ℃变性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s；最后72 ℃加热5 min 充分反应。miR-146a 的引物序列如下：miR-146a 正向5'-ATCGCCTCTAGAAGTCG TCAGG-3'，反向5'-TCAGGCTACTGAAGGCTAG-3'；内参采用U6基因，正向5'-GACTGATGCTCTGGCC GA-3'，反向5'-GTCGGGTCGAAGCATGG-3'。采用2-ΔΔCT法计算miR-146a的相对表达水平。

1.3.2 TNF-α浓度检测血清收集同1.3.1。采用酶联免疫试剂盒进行检测。准备酶标板，每孔分别滴加25 μL患者血清和标准品，37 ℃孵育15 min，再滴加100 μL 酶底物，反应20 min，加入显色液，避光15 min，最后滴加终止液。将酶标板放入酶标仪中，采用450 nm波长检测溶液吸光度，计算TNF-α浓度。

1.3.3 Treg细胞比例检测采集患者化疗前和2周期化疗结束后静脉血3 mL于EDTA抗凝管中，摇匀，加入流式试管中，与单克隆抗体充分混匀，孵育10 min，滴加红细胞裂解液500 μL，混匀，再滴加5 mL的PBS 缓冲液，3 000 g 离心5 min，小心倒掉上清，滴加300 μL 的PBS 重悬细胞，采用流式细胞仪检测Treg细胞，使用FACS DIVA软件分析Treg细胞比例。

1.3.4 随访治疗结束后每3 个月随访1 次，采用门诊、电话、网络通信等方式进行随访，共随访1 年，记录患者生存情况，包括是否死亡及具体死亡时间。

1.4 统计学分析

采用SPSS 26.0 软件进行数据分析，计量资料若符合正态分布，用±s表示。组间比较，采用t检验。若不符合正态分布，用中位数和四分位间距表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料用例数(%)表示，采用χ2检验。采用Pearson 方法分析相关性，并计算相关系数r。采用多因素logistic 回归进行预后分析，应用逐步回归法筛选独立危险因素，并计算比值比(odds ratio，OR)及95%置信区间(confidence interval，CI)。采用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线计算曲线下面积(area under curve，AUC)，根据约登指数找出最佳临界值。检验水准取双侧α=0.05。

2 结 果

2.1 miR-146a、TNF-α水平和Treg细胞比例的检测结果

采用实时荧光定量PCR法检测NSCLC患者血清中的miR-146a 相对表达水平为(1.48±0.18)，采用酶联免疫法检测NSCLC患者血清中TNF-α浓度为(29.46±4.19)μg/L，采用流式细胞术检测NSCLC患者的Treg细胞比例为(4.03±0.85)%。

2.2 miR-146a 相对表达水平与TNF-α浓度、Treg细胞比例的相关性

经Pearson 相 关 分 析， 得 出NSCLC 患 者 的miR-146a 相对表达水平与TNF-α浓度呈正相关(r=0.651；P＜0.01，图1A)，与Treg 细胞比例呈负相关(r=-0.676；P＜0.01，图1B)。

图1 miR-146a相对表达水平与TNF-α浓度、Treg细胞比例的相关性

2.3 miR-146a、TNF-α水平及Treg细胞比例对患者死亡的多因素logistic回归分析结果

随访1 年后统计，miR-146a 低表达组在随访1 年内死亡17人，miR-146a高表达组在随访1年内死亡35人。TNF-α低浓度组在随访1 年内死亡22 人，TNF-α高浓度组在随访1年内死亡30人。Treg 细胞低比例组在随访1 年内死亡33 人，Treg 细胞高比例组在随访1年内死亡19人。我们采用多因素logistic回归分析，纳入miR-146a相对表达水平、TNF-α浓度和Treg细胞比例3 个变量进入logistic 模型，结果如图2 所示，miR-146a相对表达水平和TNF-α浓度为NSCLC患者死亡的危险因素(OR=1.95、1.39；P＜0.01)。Treg 细胞比例为NSCLC患者死亡的保护因素(OR=0.53；P＜0.01)。

图2 NSCLC患者死亡的多因素logistic回归分析

2.4 miR-146a、TNF-α 水 平 及Treg 细 胞 比 例 的ROC曲线分析

如图3 所示，我们通过ROC 曲线分析得出，miR-146a 相对表达水平的最佳阈值为1.239，此时敏感度为95.7%，特异度为92.6%，约登指数为0.883，AUC 为0.959， 95%CI为(0.934， 0.985)，P＜0.01。TNF-α浓度的最佳阈值为27.734 μg/L，此时敏感度为55.4%，特异度为87.0%，约登指数为0.424，AUC 为0.761，95%CI为(0.694，0.828)，P＜0.01。Treg 细胞比例的最佳阈值为5.159%，此时敏感度为65.7%，特异度为80.4%，约登指数为0.461，AUC为0.778，95%CI为(0.713，0.844)，P＜0.01。

图3 miR-146a 相对表达水平、TNF-α 浓度和Treg 细胞比例对NSCLC患者预后的ROC曲线分析

3 讨 论

肺癌病死率位于所有恶性肿瘤之首，NSCLC是肺癌最常见的一种类型[10]。导致NSCLC 发病的因素较多，如大气污染、遗传因素、肺部慢性炎症、电离辐射、环境接触、职业暴露、吸烟等，会导致细胞恶变，最终引发肺癌[11]。以顺铂联合多西他赛为主的化学疗法仍是当下的主要治疗手段[10]。但是化疗药物存在剂量限制性，有毒副作用，肿瘤细胞易产生耐药性，这些因素均限制了化疗的疗效[12]。目前，NSCLC的5年生存率仍只有19.7%[5]。因此需要找到能提示预后的指标，从而及早优化治疗方案，提高生存率。

TNF-α属于一种蛋白超家族成员，其通过聚集成受体复合物发挥作用，通过丝裂原活化蛋白激酶进行信号转导，通常情况下TNF-α的活性受抑制，当体内有活性氧、整合素等物质产生时就会激活并释放[13]。此时TNF-α被细胞膜表面受体识别并结合，将信号转导到细胞内，影响细胞增殖、分化和迁移，诱导产生多种炎症因子，如白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)和多种趋化因子等，同时活化中性粒细胞，促进血管生成，还可上调血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶的表达，促进炎症发生[14]。本研究结果表明，TNF-α浓度为NSCLC患者死亡的危险因素，当TNF-α浓度升高时，会促进炎症反应发生，从而加快肿瘤的进展，提高NSCLC患者的死亡率。

Treg 细胞是T 细胞亚群的一种，具有负向调控免疫功能的作用，可以介导辅助性T 细胞的漂移，同时能够分泌白介素4(IL-4)、白介素10(IL-10)和TNF-α等因子，维持机体免疫功能的稳定，Treg 异常是导致促炎-抗炎失调的重要原因，当Th17 正常时，TNF-α会诱导辅助性T0细胞分化为Treg细胞，通过自身免疫耐受机制，维持机体的免疫稳定，但是当Treg异常减少时，会引起免疫功能紊乱，使得促炎-抗炎平衡被打破，加速IL-17 的释放，信号经由免疫级联效应放大，促进炎症的产生和发展[15]。本研究结果表明，Treg 细胞比例为NSCLC 患者死亡的保护因素，当Treg细胞比例升高时，会增强机体免疫功能，从而抑制肿瘤进展，降低NSCLC患者的死亡率。

近年来发现，许多miRNA 均广泛参与炎症反应，其表达水平与感染的严重程度和预后有关，其中miR-146a在肺炎、脓毒症等炎症性疾病都有很好的预后价值[8-9]，但是对于NSCLC的预后作用报道较少。本研究结果表明，多因素logistic 回归分析显示，miR-146a 相对表达水平是NSCLC 患者死亡的危险因素，miR-146a水平升高会促进肿瘤发生发展，提高死亡率，且miR-146a 相对表达水平与TNF-α呈正相关，与Treg 呈负相关；ROC 曲线分析显示，当miR-146a 相对表达水平≥1.239 时，预示NSCLC 患者有较高的死亡风险。以上结果提示，miR-146a水平越高，患者的预后越差，水平越低则患者预后越好，其预测准确率明显高于TNF-α和Treg，表明miR-146a对于NSCLC 具有很好的预后价值。蒙振发等[16]发现，miR-146a 通过上调TLR4/NF-κB 信号通路，促进炎性细胞增殖，提高TNF-α等炎症因子水平，引起胰腺组织的炎症损伤。谢平安等[17]发现，miR-146a通过抑制Treg细胞的增殖，导致Th17/Treg细胞比例失衡，引发促炎-抗炎机制紊乱，从而加重炎症反应。这与我们的研究结果一致。除了与TNF-α、Treg 细胞相互作用，miR-146a也存在其他促炎机制。周燕[18]的研究表明，miR-146a 能够增加细胞间黏附分子-1 的表达，导致急性呼吸窘迫综合征患者炎症加重，预后不良。王宏伟等[19]发现，miR-146a通过上调TNF-α水平，激活炎症通路，促进了铜绿假单胞菌等革兰阴性菌感染，导致呼吸机相关肺炎加重。然而，也有少数研究认为miR-146a 可能抑制炎症。樊丰夷等[20]的研究表明，miR-146a水平上升可降低抑制急性痛风性关节炎大鼠踝关节滑膜组织NALP3 的激活，从而抑制炎症，与我们的结果存在争议，原因可能是由于采用的agomiR-146a 和antagomiR-146a 未做激活和抑制效率验证，使得miRNA水平可能存在过表达或抑制不充分的情况；另一种可能是由于痛风和NSCLC疾病间分子机制的差异导致。

本研究通过相关分析表明了miR-146a与多种炎症和免疫指标的相关性强度，采用多因素logistic回归分析得出miR-146a 对NSCLC 患者的预后判断价值，通过ROC 曲线得到miR-146a 的预测效能。本研究的局限在于仅研究了患者是否死亡这一个预后因素，在以后的研究中，可以考虑对患者进行长期随访，采用生存分析研究miR-146a的远期预后价值。

综上所述，miR-146a 在NSCLC 中的相对表达水平与TNF-α浓度呈正相关，与Treg 细胞比例呈负相关，是NSCLC患者死亡的危险因素，对NSCLC预后有很好的预测价值。