血清miRNA-183与CA199联合检测在胃癌诊断和预后评估中的价值

何广思，魏 洁，张 健

(安徽医科大学附属滁州医院/滁州市第一人民医院肿瘤科，安徽 滁州 239001)

胃癌(gastic cancer，GC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居消化道恶性肿瘤之首[1]。大多数胃癌患者在确诊时已处于疾病晚期，治疗效果极差。目前临床中常用于胃癌诊断的肿瘤标记物有糖类抗原199(carbohydrate antigen 199，CA199)、CA724、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)等，但由于它们的特异度和灵敏度较低，导致其临床价值不高[2-4]。因此，寻找具有高灵敏度和高特异性的肿瘤标志物对胃癌的诊断及治疗有重要的意义。

miRNA是一种非编码单链RNA，通过与靶基因的非编码区结合来控制转录后的基因表达。相关研究[5]表明，由于不同肿瘤患者循环血中miRNAs 的表达存在差异，而且这种差异具有组织特异性和稳定性，因此呈现差异表达的miRNAs 有望成为新的生物标记物。但目前血清miRNA-183在胃癌中的诊断价值尚不明确。本研究采用逆转录实时荧光定量PCR(reverse transcription quantitative real ting-PCR，RT-qPCR)检测胃癌患者血清中miRNA-183 水平，探讨miRNA-183 联合CA199 检测在胃癌的诊断和预后评估中的价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1月—2021年12月在安徽医科大学附属滁州医院经由胃镜诊断的52 例胃癌患者纳入胃癌组，其中42例接受根治性手术，并经手术病理再次明确诊断。胃癌患者年龄36～79 岁，中位年龄为64 岁；男性29人，女性23人；肿瘤组织学分级为中-高分化20 例，低-未 分 化32 例；TNM 分 期I～II 期17 例，III～IV 期35 例；无淋巴转移8 例(N0)，有淋巴转移44例(N1～N3)；远处转移9例(M1)。选取同期本院胃镜诊断为胃部良性病变患者40例纳入对照组，其中萎缩性胃炎8 例，慢性浅表性胃炎21 例，胃息肉3 例，胃溃疡8 例。对照组人群年龄40～72 岁，中位年龄61 岁；男22 人，女18 人。纳入条件：所有胃癌患者均经病理学诊断，根据美国肿瘤联盟(AJCC)TNM(第7版)进行分期。所有病人在取血标本之前均未接受手术、放疗、化疗等其他治疗。排除合并有其他恶性肿瘤、肝肾功能异常等情况。本研究经安徽医科大学附属滁州医院的伦理学委员会审核通过(编号2021xkj205)，并经过全体受试者的知情同意和签字。

1.2 主要试剂与仪器

TRIzol LS 试剂和PCR 引物购自美国Invitrogen 公司，引物序列为：miRNA-183 上游，5'-CGGCAGTT CACAGTGGCTAA-3'，下游，5'-CAGAGCAGGGTCC GAGGTA-3'；内参U6 上游，5'-GTCGGGTCCAGAG CAGGG-3'，下游，5'-CACGTTCGCTCTGGACCCG-3'。RR047A 型反转录试剂盒和9753A 型miRNA 提取试剂盒均购自日本TaKaRa公司；CA199检测试剂盒购自上海透景生命科技股份有限公司。7900型PCR扩增仪购自美国ABI 公司，Architect ci8200SR 自动免疫分析仪购自美国雅培公司。

1.3 方 法

1.3.1 收集血清样本采集受试者外周静脉血5 mL于无RNA 试管中，以3 000 r/min 的速度离心10 min，然后静置凝固0.5～1 h。将1.5 mL 上清液储存在-80 ℃备用。所有样品必须在采集后2个月内使用。

1.3.2 RT-qPCR 检测miRNA-183 的表达利用RT-qPCR 进行miRNA-183 的表达检测。采用miRNA提取试剂盒提取血清miRNA，通过反转录试剂盒将提取的miRNA 反转录生成cDNA，利用qPCR 扩增进行miRNA-183的表达检测。反应体系共20 μL，其中包括TaqMan Micro RNA Assay 1.00 μL，cDNA 1.33 μL，TaqMan 2×Universal PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。扩增条件：93 ℃预变性10 min，93 ℃变性32 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸34 s，45 个循环。应用荧光定量PCR仪自带软件分析结果，采用2-ΔΔCT法对miRNA-183相对表达水平进行计算。

1.3.3 CA199 检测采用Architect ci8200SR 自动免疫分析仪及CA199检测试剂盒通过化学发光免疫分析检测CA199。根据仪器的操作指南，可以导出和分析所需的CA199浓度数据。

1.4 随访及生存分析

通过门诊电子病历结合电话进行随访，每3 个月随访1 次，截至2022 年12 月31 日。总生存期(overall survival，OS)定义为从手术之日到患者死亡或随访截止日期的时间。

1.5 统计学处理

利用SPSS 21.0 软件进行数据处理，满足正态分布，方差齐性的计量资料采用±s表示，两组间比较采用成组t检验，多组比较采用方差分析，非正态分布的计量资料比较采用Mann-WhitneyU检验；计数资料以率或例数表示，组间比较采用χ2检验；采用受试者工作特征(receiver operating characteristic curve，ROC)曲线，对miRNA-183、CA199 的诊断效能ROC曲线下面积(area under the curve，AUC)进行分析。采用Kaplan-Meier 法进行生存曲线分析，以对数秩检验(log-rank test)计算生存曲线间的差异。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 miRNA-183 在胃癌患者及健康人群血清中的表达水平

RT-qPCR 结果显示，对照组血清中miRNA-183的相对表达量为3.61±1.89，胃癌组为4.59±1.63，胃癌组的miRNA-183表达水平明显高于对照组(P＜0.01)。

2.2 miRNA-183与CA199的表达水平与胃癌患者临床病理指标的关系

根据患者性别、年龄、原发灶部位、组织学类型、T 分期、TNM 分期和淋巴结是否发生转移等进行分组统计分析。结果显示，组织病理分型为低-未分化、T3～T4 期以及TNM 分期为III～IV 期患者血清中miRNA-183 的表达水平分别显著高于中-高分化类型、T1～T2 和TNM 分期为I～II 期的患者，差异均具有统计学意义(均为P＜0.01)。而不同年龄、性别、原发灶部位、淋巴结转移的患者血清中miRNA-183表达水平的差异均无统计学意义(均为P＞0.05)。组织病理分型为低-未分化、TNM 分期为III～IV 期患者CA199 水平分别显著高于中-高分化、TNM 分期为I～II 期的患者，差异具有统计学意义(均为P＜0.01)。而不同年龄、性别、原发灶部位、T 分期、淋巴结转移的患者血清中CA199 表达水平的差异均无统计学意义(均为P＞0.05)，见表1。

表1 miRNA-183与CA199表达水平与胃癌患者临床病理指标的关系

2.3 miRNA-183 联合CA199 诊断胃癌的ROC 曲线分析

在约登指数最大值时miRNA-183 相对表达量为4.11，其诊断胃癌的敏感度及特异度分别为67.31%和80%，AUC 为0.771，95%置信区间为(0.672，0.853)，P＜0.05；在约登指数最大值时CA199 的相对表达量为46.17 U/mL，其诊断胃癌的敏感度及特异度分别为53.8%和87.5%，AUC 为0.724，95%置信区间为(0.621，0.812)，P＜0.05。联合检测血清miRNA-183与CA199诊断胃癌对应的敏感度及特异度分别为76.92%和87.5%，AUC 为0.882，95%置信区间为(0.798，0.940)，P＜0.05。miRNA-183 联合CA199 诊断胃癌的AUC大于miRNA-183、CA199独立诊断。见图1。

图1 血清miRNA-183、CA199诊断胃癌的ROC曲线

2.4 生存分析

根据胃癌患者血清中miRNA-183 的最佳临界值4.11，52例胃癌患者被分为miRNA-183高表达组和低表达组。Kaplan-Meier 分析显示，miRNA-183 高表达组患者的OS 为(34.504±2.897)个月，低表达组患者的OS为(47.408±3.057)个月，两组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。根据胃癌患者血清中CA199 水平的最佳临界值，选取miRNA-183和CA199均高表达的胃癌患者为双高表达组，其余患者为非双高表达组，Kaplan-Meier 分析显示，双高表达组患者的OS 为(31.344±3.377)个月，非双高表达组患者的OS 为(45.725±2.876) 个月，双高表达组患者的OS 明显降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见图2。

图2 血清中miRNA-183和CA199表达水平与胃癌患者总生存率的关系

3 讨 论

近年来，鉴于miRNAs的独特性，miRNAs作为恶性肿瘤生物标志物的研究不断深入。研究[6-8]表明，肿瘤发生发展过程中miRNAs 发挥着重要作用，有成为肿瘤筛查的生物学标记物及靶向治疗靶点的可能，尤其是与传统的肿瘤标记物联合检测已成为肿瘤诊断、疗效及预后预测的重要手段之一。miRNA-183家族是一组重要的调控基因，在肿瘤发生和发展过程中扮演着关键的角色。miRNA-183 家族由miRNA-183、miRNA-96 和miRNA-182 组成，它们的基因位于人类7 号染色体。研究发现：在宫颈癌、肾透明细胞癌等多种肿瘤中miRNA-183的表达水平被发现有不同程度的降低[9-10]。这一发现引发了对miRNA-183 在肿瘤抑制中潜在作用的关注。然而，近来的研究也发现，在某些肿瘤类型中，如舌癌、间皮瘤等，miRNA-183却显示出促癌效应[11-12]。这种矛盾的结果表明，miRNA-183 在不同肿瘤中可能具有不同的作用机制，这一差异主要取决于其所调控的下游基因的不同。miRNA-183 通过与特定的下游基因相互作用，可以对细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学过程进行调控。Lin等[13]研究表明miRNA-183作肿瘤相关的miRNA参与调节胃癌细胞的迁移和侵袭。王娅南等[14]研究结果提示胃癌患者肿瘤组织和胃癌细胞株中miRNA-183-5P 水平显著降低，说明了miRNA-183在胃癌的发生发展中发挥重要作用。

本研究发现，胃癌患者血清miRNA-183水平显著高于胃部良性疾病患者。进一步分析miRNA-183表达水平与胃癌患者临床病理指标之间的关系，结果显示：低-未分化组织学类型、T3～T4 期以及TNM 分期为III～IV期患者癌组织中miRNA-183的表达水平分别显著高于中-高分化类型、T1～T2和TNM分期为I～II期的患者(P＜0.01)。由此推测，miRNA-183 可能成为胃癌病情评估和诊断的重要分子标志物。同时，本研究中血清miRNA-183 水平与患者性别、年龄、肿瘤部位、淋巴结转移均无明显相关，因此，血清miRNA-183水平在反映原发性肿瘤病灶、淋巴结转移及其他疾病特征方面受到限制。原因可能与研究样本量小有关。目前，有研究表明，miR-183-5p通过干预基因表达促进肿瘤进展，与癌症患者的预后相关。例如，Li等[15]的研究表明，miR-183-5p在胃癌组织和细胞系中表达下调，其表达水平与TNM 分期、肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移相关，这与本研究结果相似。miR-183-5p在甲状腺癌中的高表达促进肿瘤细胞的转移和抗凋亡[16]；此外，Yan 等[l7]的研究认为miR-183-5p在肝癌细胞和组织中高表达，并与一些临床病理指标相关。但是，目前关于miRNA-183促进胃癌发生发展的具体机制仍在探索之中，仍需要进一步的研究来验证。

已知多种糖类抗原以及CEA均为诊断胃癌的生物标记物，但它们的敏感性和特异性不高。本研究中单独应用CA199 诊断胃癌的敏感度和特异度分别为53.8%和87.5%，与蔡晓娟等[18-19]研究结果相近。在临床诊断中ROC 曲线下面积＞0.9 表示诊断价值高，0.7～0.9 表示诊断价值较好，0.5～0.7 表示诊断价值较低[20]。本研究CA199 诊断胃癌的AUC 为0.724，诊断价值并不高，单独检测CA199 不足以预测胃癌。因此，CA199 指标联合其他分子标记物的检测已成为目前提升胃癌诊断准确性的新型研究方向。本研究另一结果表明miRNA-183 诊断胃癌敏感度和特异度为67.31%和80%，AUC 为0.771。虽然miRNA-183 单独诊断胃癌的特异度和敏感度并不令人满意，但是当miRNA-183 与CA199 联合检测后诊断胃癌的敏感度及特异度提升至76.92%和87.5%，AUC为0.882。因此，在胃癌诊断中将miRNA-183与CA199联合应用可能有助于胃癌的临床筛查和辅助诊断。

另外，本研究的生存分析结果显示，miRNA-183高表达组患者生存时间明显短于miRNA-183 低表达组，而且miRNA-183与CA199均高表达的患者预后更差，提示两者的高表达代表胃癌的进展程度和预后的恶化，预示着miRNA-183和CA199可以作为联合生物标志物，用于胃癌患者的预后预测。

综上所述，由于胃癌患者血清中miRNA-183的表达水平明显高于胃部良性病变患者，与CA199联合检测可提高诊断效率。此外，胃癌血清中miRNA-183的表达水平与肿瘤的T分期、TNM 分期、组织学分级以及患者的预后相关，因此miRNA-183 对于胃癌诊断、病情评估、预后有着较高的临床价值，但这一结果还需要大样本研究的证实。