DNAJB4与非小细胞肺癌免疫细胞浸润和患者预后的相关性分析

杨上英，黄明翔，许德新，刘加夫，陈新富

(1.福建省福州肺科医院检验科，福建 福州 350008；2.福建省福州肺科医院胸外科，福建福州 350008；3.福建省福州肺科医院病理科，福建 福州 350008；4.福建医科大学临床教学医院检验科，福建 福州 350008)

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是临床上肺癌最常见的病理类型，约占85%左右。尽管手术是早期NSCLC 的首选治疗方法，但是Ⅰ～ⅢA期患者5年生存率仅为14%～49%，ⅢB～Ⅳ期患者的生存率不到5%[1]。随着免疫治疗在晚期NSCLC治疗中的应用，肿瘤生存的微环境是目前研究的方向。微环境中的免疫细胞与NSCLC的发生发展关系密切，在免疫调节中发挥重要作用[2]，相关免疫细胞的浸润程度对NSCLC患者的诊治及预后评估价值显著[3]。

DnaJ 热休克蛋白家族(Hsp40)成员B4[DnaJ heat shock protein family (Hsp40) member B4，DNAJB4]是DNAJ/Hsp40 家族的成员，也称人肝脏DnaJ-like 蛋白(human liver DnaJ-like protein，HLJ1)，在调节蛋白质折叠和活性方面起着重要作用。DNAJB4 是一种新发现的肿瘤抑制因子，与肿瘤发生和转移有关。研究证实，DNAJB4在肝癌[4]、结肠癌[5]、乳腺癌[6]等多种肿瘤组织中低表达。然而DNAJB4 在NSCLC 发生发展中的作用以及潜在生物学机制尚不清楚，并且DNAJB4 与免疫细胞浸润及患者预后的关系未见报道。人类基因组数据库的建立给NSCLC的发生、发展及潜在的分子机制研究指明了方向。本研究通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)、免疫组织化学及多个生物学信息数据库分析DNAJB4基因在NSCLC 中的表达及其与免疫细胞浸润和患者预后的关系，为NSCLC进展机制、治疗及预后的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 病例标本本研究经福建省福州肺科医院伦理委员会审核批准后(2018-006-01)，收集2017年8月—2017年12月胸外科术前未接受放、化疗及生物治疗并经手术切除的45例NSCLC患者，手术获取肿瘤组织及癌旁正常肺组织标本，分别进行qPCR和免疫组织化学检测。

1.1.2 主要试剂EASYspin 组织/细胞RNA 快速提取试剂盒、HiScript Q RT SuperMix for qPCR、ChamQ SYBR color qPCR Master Mix 均购自Vazyme 公司。DAB 染色液试剂盒、山羊抗兔IgG 均购自福州迈新生物科技开发有限公司。兔抗DNAJB4 单克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司。本研究采用美国Applied Biosystems 9700 PCR System进行qPCR反应。

1.2 方 法

1.2.1 GEPIA 数据库分析基因表达谱交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA)(http://gepia.cancer-pku.cn)是用于癌症和正常基因表达谱和交互式分析的数据库，提供交互和自定义功能，包括差异表达分析、图谱绘制、相关分析、相似基因检测、降维分析等[7]。本研究运用GEPIA 数据库分析NSCLC 患者癌组织和癌旁正常组织中DNAJB4基因的表达差异。

1.2.2 RNA 提取和qPCR 检测根据EASYspin 组织/细胞RNA快速提取试剂盒操作说明提取RNA。以提取的RNA 为模板，按逆转录试剂盒说明书反转录得到cDNA， 在实时定量PCR 仪上进行PCR 扩增。DNAJB4 mRNA 的引物序列：正向5'-GACGAATGGG TGGTGGTAGAG-3'，反向5'-GGAGGATCTTGTTTGA GGCG-3'。内参GAPDH 引物序列：正向5'-TGCACC ACCAACTGCTTAGC-3'，反向5'-GGCATGGACTGTG GTCATGAG-3'。PCR 反应体系包括AceQ qPCR SYBR Green 混合物10 μL，PCR 上游引物(10 μmol/L) 0.5 μL，PCR 下游引物(10 μmol/L) 0.5 μL，Rox 参比染料Ⅱ(50×) 0.4 μL，cDNA 模板1.0 μL，ddH2O(灭菌蒸馏水)加至20 μL。反应条件：94 ℃、30 s；94 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40 个循环。采用SYBR 染料法测定DNAJB4的CT值，以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCT计算癌组织及癌旁正常肺组织中DNAJB4 mRNA 的相对表达水平，实验重复3次，并取平均值进行统计。

1.2.3 免疫组化SP 两步法检测DNAJB4 蛋白的表达参照DAB染色液试剂盒说明书进行，切取4 μm的石蜡切片，60 ℃烤片2 h，二甲苯脱蜡和乙醇梯度水化后，用微波炉进行抗原修复。PBS冲洗，3%过氧化氢溶液室温孵育封闭10 min。PBS 冲洗，加入1∶50 稀释的抗DNAJB4蛋白抗体100 μL，于4 ℃冰箱内过夜孵育。PBS 冲洗，滴加二抗100 μL 室温孵育30 min。PBS 冲洗，DAB 显色5 min。自来水冲洗，苏木素复染10～30 s，PBS 冲洗返蓝。乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。显微镜下阅片，拍照。

1.2.4 染色结果判定采用双人盲法阅片，即由2位资深病理医师，均在不知具体临床资料的前提下，独自判断所得。在400 倍显微镜下随机选取5 个视野，每个视野计数200 个肿瘤细胞，记录阳性细胞百分比，DNAJB4 阳性细胞表现为细胞浆出现弥漫性棕黄色或棕褐色颗粒。DNAJB4 蛋白表达判定标准：①按染色强度评分。未着色0 分，浅黄色1 分，棕黄色2分，棕褐色3 分。②按染色细胞百分率评分。阳性细胞＜5%记0 分，[5%，25%)记1 分，[25%，50%)记2分，[50%，75%)记3分，阳性细胞≥75%记为4分；将两项评分结果相乘，＜2 分为DNAJB4 蛋白表达阴性，≥2分为DNAJB4蛋白表达阳性。

1.2.5 TIMER 数据库分析TIMER 数据库(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)通过TIMER算法估计6种免疫浸润(B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞)的丰度，为用户提供可靠的免疫浸润水平[8]，具有全面分析和可视化功能。采用TIMER 的GENE 模块分析DNAJB4基因表达与免疫细胞类型以及肿瘤纯度的相关性，SURVIVAL 模块探讨免疫细胞浸润对NSCLC 患者预后的影响，SCNA 模块进行DNAJB4 不同体细胞拷贝数变异的免疫细胞丰度比较。

1.2.6 评估DNAJB 在NSCLC 中的预后价值通过Kaplan-Meier plotter 数据库(http://www.kmplot.com/analysis/)分析DNAJB4与NSCLC患者预后生存的关系。

1.3 统计学分析

采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，配对t检验比较DNAJB4基因在NSCLC 组织与正常组织中的表达差异，Graphpad Prism 5.0 绘图；χ2检验比较DNAJB4蛋白在NSCLC 组织与正常组织中的表达差异。采用Wilcoxon 秩和检验分析DNAJB4 表达、拷贝数变异与免疫细胞浸润水平的相关性，采用Kaplan-Meier 生存曲线分析DNAJB4 和免疫细胞浸润对NSCLC 患者预后的影响。以α=0.05为检验水准。

2 结 果

2.1 DNAJB4基因在NSCLC组织中的表达水平

采用GEPIA 数据库分析DNAJB4基因的表达水平，结果见图1。在肺腺癌(肿瘤组织483 例，正常组织347 例)中，DNAJB4基因的表达水平低于正常组织，差异具有统计学意义(P＜0.05)；在肺鳞癌(肿瘤组织486例，正常组织338例)中，DNAJB4基因的表达水平亦低于正常肺组织(P＜0.05)。

图1 GEPIA数据库分析DNAJB4基因在NSCLC组织中的表达水平

qPCR 检测结果见图2。DNAJB4 mRNA 在NSCLC组织中的相对表达水平(0.51±0.35)显著低于癌旁正常组织(1.14±0.68，P＜0.01)。免疫组织化学检测结果见图3，可见DNAJB4 蛋白在NSCLC 组织中的阳性率(26.67%，12/45)显著低于癌旁正常组织(82.22%，37/45)，差异有统计学意义(χ2=27.998，P＜0.01)。

图2 qPCR检测DNAJB4 mRNA在NSCLC组织及癌旁正常组织中的表达

图3 不同肺组织中DNAJB4蛋白的表达

2.2 NSCLC 中DNAJB4 的表达与6 种免疫细胞浸润的相关分析

TIMER分析结果见图4。DNAJB4的表达与癌组织中B 细胞、CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞的数量均明显相关(均为P＜0.01)。可见，DNAJB4 在NSCLC 的免疫细胞浸润中起重要作用。

图4 DNAJB4的表达与免疫细胞浸润水平的相关性

免疫细胞对NSCLC患者预后影响的分析发现，在肺腺癌中，B细胞高浸润水平的肺腺癌患者存活时间较长(Log-rankP＜0.01)，预后较好。树突状细胞不同浸润水平的两组患者比较P值接近于0.05(Log-rankP=0.048)，差异无统计学意义，见图5。其中低浸润水平B 细胞是肺腺癌不良预后的独立危险因素(P＜0.05)，如表1。在肺鳞癌中，免疫细胞浸润对肺鳞癌患者预后无明显影响，见图5和表1。

表1 肺腺癌和肺鳞癌患者预后的多因素Cox回归分析结果

图5 免疫细胞浸润对NSCLC患者临床预后的影响

本实验又发现，在肺腺癌中不同细胞的DNAJB4基因拷贝数变异对免疫细胞的浸润水平均有影响，肺鳞癌中DNAJB4基因拷贝数变异对除CD8+T 细胞外的免疫细胞浸润水平均有影响(图6)，表明DNAJB4 在NSCLC 免疫细胞浸润过程中发生一系列的生物学变化。

图6 不同体细胞的DNAJB4基因拷贝数变异对免疫细胞浸润水平的影响

2.3 DNAJB4基因在NSCLC中的预后价值

生存分析结果见图7，显示DNAJB4基因的表达水平与NSCLC 患者的总生存率[HR=0.76，95%CI(0.64，0.90)，P=0.001 7]显著相关，而与NSCLC 患者的无病生存率[HR=1.02，95%CI(0.86，1.21)，P=0.78]、后期生存率[HR=0.95，95%CI(0.84，1.07)，P=0.39]无明显相关关系。

图7 DNAJB4基因不同表达水平NSCLC患者的生存曲线分析

3 讨 论

DNAJB4基因的异常表达在细胞增殖、运动、侵袭、肿瘤发生和转移过程中发挥着重要作用[9-10]。DNAJB4 作为热休克蛋白家族成员，其表达和活性在细胞应激期间增加，可抑制多种癌症类型的转移和进展[11]。由于E-钙黏蛋白是抑制肿瘤侵袭的重要元素，DNAJB4 专门从突变的E-钙黏蛋白中识别野生型，因此DNAJB4 的作用是抑制肿瘤侵袭，但其抑癌机制尚不完全清楚。据报道，DNAJB4参与了STAT/p21WAF1信号过程，通过上调STAT/p21WAF1 的表达以及下调CyclinD1 的表达减缓细胞分裂和肿瘤细胞的生长，还有研究显示CircRNA 0009043 可通过靶向miR-148a-3p/DNAJB4 轴抑制NSCLC 的发展[12]。这些研究发现，DNAJB4 通过某系列的信号通路发挥其特定的抑癌机制，调控NSCLC的进展。

最新发现，DNAJB4通过激活Hippo信号通路促进三阴性乳腺癌细胞凋亡，在乳腺癌细胞和组织中均低表达，且与预后不良相关[13]。DNAJB4通过减少基质金属蛋白酶2 和9(MMP-2 和MMP-9)的表达和活性来抑制黑色素瘤细胞的侵袭，且低水平DNAJB4 的患者预后较差[14]。在本研究中，我们发现DNAJB4 在NSCLC组织中低表达，提示DNAJB4 影响NSCLC 的增殖和转移等生物学现象，在NSCLC 发生发展过程中发挥其作用。

目前，肿瘤微环境及免疫靶向治疗是NSCLC的研究热点。微环境中的免疫状态对肿瘤的发生发展及预后判断有着十分重要的意义[15]。研究表明，肿瘤微环境中的免疫细胞是肿瘤免疫治疗的决定性因素，而且免疫细胞浸润水平对患者预后判断具有重要的参考价值。本研究进一步分析了DNAJB4 表达与NSCLC 组织免疫微环境的关系，结果发现DNAJB4基因与多种免疫细胞(B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞)浸润水平相关，表明DNAJB4 参与NSCLC 细胞的免疫浸润过程，在免疫浸润中起重要作用。再者我们又发现DNAJB4基因拷贝数变异影响了免疫细胞的浸润水平，表明了DNAJB4基因的多态性与免疫细胞发生发展密切相关，DNAJB4 参与NSCLC 中肿瘤细胞和免疫细胞之间的作用机制，调控NSCLC的进展。

有证据表明，B 细胞是各种实体瘤中浸润性免疫细胞的关键成分，几乎占浸润性淋巴细胞总数的一半[16-17]。然而B 淋巴细胞在肿瘤免疫中既发挥促癌作用，又发挥抗癌作用。我们的研究发现，在LUAD中，B 细胞的浸润水平与DNAJB4基因表达及患者生存显著相关，而且多因素Cox 回归分析显示低浸润水平B细胞与LUAD 患者更短的OS期相关。这说明B细胞浸润影响LUAD 患者的生存，而DNAJB4基因参与了LUAD免疫细胞浸润的调控，B细胞可作为LUAD不良预后的独立因素。

本研究进一步探讨了DNAJB4基因的表达与NSCLC 患者的预后，结果显示DNAJB4基因的低表达只与NSCLC 患者的总生存期(OS)显著相关。从图7 可以看出高表达水平DNAJB4 的NSCLC 患者生存时间长于低表达水平DNAJB4的患者，提示如果上调DNAJB4基因表达将延长NSCLC患者的生存时间，这将为我们后续的DNAJB4 在NSCLC 中相关调控机制提供了新的思路和方向。

综上所述，本研究发现DNAJB4 在NSCLC 组织中表达下调，参与NSCLC 免疫细胞浸润的过程，且与NSCLC 患者的不良预后相关。特别是，DNAJB4基因的表达与B 淋巴细胞浸润水平相关，B 细胞浸润水平是LUAD 患者的预后判断因素。DNAJB4 在NSCLC 免疫细胞浸润中发挥重要作用，可作为一种潜在的免疫细胞浸润及预后的生物学标志物，也可为后续NSCLC免疫治疗和靶向治疗提供参考。