敲低膜联蛋白A2对食管鳞癌细胞恶性表型的抑制作用

王意浓，刘国政，谢观超，冯 丹，李 赛，蔡 岩，张 钰，王明荣，郝佳洁

(国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院，分子肿瘤学全国重点实验室，北京 100021)

食管癌位居全球癌症死因第6位[1]；中国作为全球食管癌发病风险最高的地区之一，每年食管癌新发病例数约占全球的53.7%。其中，食管鳞癌病例数占食管癌病例总数的90.4%[2]。肿瘤复发和转移是食管鳞癌相关死亡的主要原因，我国食管鳞癌早期诊断率低，总体预后比较差[3]。因此，寻找食管鳞癌新的诊断标志物和潜在治疗靶点，对食管鳞癌患者的治疗以及预后十分重要。

膜联蛋白家族(annexins，ANXs)在动物细胞和植物细胞中广泛表达，目前已鉴定出超过160 个成员。ANXA2作为该家族蛋白中最主要的成员之一，已被证明在多种恶性肿瘤中高表达，并与肿瘤的分期及预后相关[4]。本课题组之前的研究发现，ANXA2 在食管鳞癌细胞系中高表达，使用siRNA瞬时敲降ANXA2后显著减弱食管鳞癌细胞的侵袭迁移和肺转移能力；机制研究表明，ANXA2 可以通过上调MYC 蛋白表达进而促进食管鳞癌细胞的侵袭迁移[5]。

CRISPR/Cas9 系统包含规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)和具有切割DNA双链作用的CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9，Cas9)组成，是由RNA 指导Cas9 核酸酶编辑靶向基因的技术[6]。CRISPR/Cas9 系统由向导RNA(guide RNA，gRNA)和Cas9 蛋白形成复合体，gRNA 与目标基因的靶序列通过碱基互补配对原则进行配对，Cas9蛋白在目标DNA序列的特异性识别位点进行定点切割，从而导致双链断裂[7]。CRISPR 编辑技术已在临床前和临床研究中使用，用于有害突变基因的敲除和错误编码序列的修复[8-9]，使用该技术还可对肿瘤细胞中高表达的基因进行敲除[9]，为肿瘤治疗的基础研究和临床转化奠定基础。与传统的RNA干扰技术相比，该系统可产生稳定的基因敲除，并且脱靶效应也明显减少[10]。

本研究使用CRISPR/Cas9 基因编辑技术，借助慢病毒载体敲低食管鳞癌KYSE30 和KYSE150 细胞中的ANXA2基因，并初步探索了敲低ANXA2后食管鳞癌细胞表型的变化，为深入研究ANXA2 的生物学功能及其高表达促进食管鳞癌细胞侵袭迁移的作用机制提供了技术基础。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

食管鳞癌细胞KYSE30 和KYSE150 均由日本东京大学Shimada 教授惠赠，分别使用含有10%胎牛血清(Newzerum)的RPMI-1640 培养基(北京细工生物公司)，置于CO2体积分数为5%的培养箱(美国Thermo Fisher Scientific 公司)中培养。人胚肾细胞HEK293FT(美国Invitrogen 公司)使用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基(北京细工生物公司)，添加1% L-型谷氨酰胺、1%非必需氨基酸以及1% G418(美国Gibco 公司)，置于培养箱中培养。

1.2 质粒构建

1.2.1 gRNA 靶点及寡核苷酸链序列在Addgene网站中查询及下载文献[11-12]中报道的ANXA2基因及对照CRISPR gRNA(https://www.addgene.org/pooled-library/zhang-human-gecko-v2/)，在正义链模板的5'端添加CACCG，反义链模板的5'端添加AAAC，与BsmBI 酶切后形成的黏性末端互补。选取了ANXA2 gRNA 共6对寡核苷酸，序列见表1。

表1 对照及ANXA2 gRNA寡核苷酸单链名称及序列

1.2.2 gRNA 表达质粒的构建将合成的gRNA 正义链和反义链粉末(北京天一辉远生物科技有限公司)稀释至100 μmol/L。退火体系：10×T4 DNA Ligase Buffer(NEB) 1 μL，正义链1 μL，反义链1 μL，T4 PNK(NEB) 0.5 μL， ddH2O 6.5 μL。 退 火 条 件：37 ℃、30 s；95 ℃、5 min；5 ℃/min 梯度降温至25 ℃，-20 ℃保存。然后用BsmBI 酶切载体：10×NEB Buffer 5 μL、pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFPPuro&Zeocin 载体(简称pLenti-U6-gRNA-Cas9 载体；上海碧云天生物技术有限公司) 3 μg、BsmBI-v2(NEB)1 μL、加ddH2O 至50 μL。酶切条件：55 ℃、14 min；80 ℃、20 min。接着使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技有限公司)回收酶切片段。

下一步进行酶切载体与双链gRNA 连接：酶切载体50 ng，2×Quick Ligase Buffer(NEB) 5 μL，双链gRNA 1 μL，加ddH2O 至10 μL，最后加入1 μL Quick Ligase，25 ℃、15 min。最后进行连接产物转化及鉴定：将连接产物转化至Stbl3感受态细胞(北京全式金生物技术股份有限公司)，均匀涂布至含100 μg/mL 氨苄青霉素的固体LB 培养基，37 ℃过夜培养，每个靶点挑取3 个单菌落，加入含100 μg/mL 氨苄青霉素的液体LB 培养基，200 r/min，37 ℃震荡培养过夜。菌液经PCR、琼脂糖凝胶电泳及Sanger 测序验证(测序引物5'-CAAGGCTGTTAGAGAGATAA-3'，由北京天一辉远生物科技有限公司完成)。测序完成后，使用质粒提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)提取质粒。

1.3 慢病毒制备

将HEK293FT细胞接种至6 cm平皿中，待细胞密度长至50%～70%。将CRISPR质粒6 μg、慢病毒包装辅 助 载 体psPAX2 和pMD2G 各3 μg 混 合，按 照JetPRIME 转 染 试 剂 说 明 书(PolyPlus 公 司) 转 染HEK293FT 细胞，48 h 后收集细胞培养上清，0.22 μm 过滤器过滤除菌，使用病毒滴度检测卡(北京博奥龙免疫技术有限公司)检测病毒滴度，保存于-80 ℃冰箱备用。

1.4 慢病毒感染细胞

分别将KYSE30 和KYSE150 细胞接种至96 孔板，待细胞密度长至30%～50%，根据病毒滴度加入含70%病毒培养上清的培养基。慢病毒、25×感染增强试剂P(上海吉凯基因医学科技股份有限公司)进行感染，感染20 h 后更换为RPMI-1640 培养基继续培养。培养48 h后，使用含2 μg/mL嘌呤霉素(上海碧云天生物技术有限公司)的RPMI-1640培养基筛选3～4 d。

1.5 Western blot实验

分别收集KYSE30 和KYSE150 细胞加入胰蛋白酶(美国Thermo Fisher Scientific 公司)进行消化，1 000 r/min离心5 min，弃上清获得细胞沉淀，使用RIPA裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)提取细胞蛋白，使用BCA 蛋白定量试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)进行定量，取15 μg蛋白样品，加入5×上样缓冲液(上海碧云天公司)，98 ℃金属浴变性10 min。聚丙烯酰胺凝胶电泳90 min，使用湿转电转仪将蛋白从分离胶转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗后4 ℃孵育过夜，一抗包含：ANXA2 抗 体(Abcam 公 司，ab189473)、MYC 抗 体(Abcam 公 司，ab32072)、GAPDH 抗 体(Cell Signaling Technology 公司，2118)；使用洗涤缓冲液TBST 洗膜4次，每次6 min，加入山羊抗兔二抗(北京中杉金桥，ZB-2301)，室温孵育1 h，使用洗涤缓冲液TBST洗膜4 次，每次6 min，使用ECL 化学发光液(美国Thermo Fisher Scientific公司)进行显影、曝光。

1.6 总RNA提取和实时定量PCR检测

使用RNA 提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)提取KYSE30细胞总RNA，将得到的RNA作为模板，使用HiFi Script cDNA 合成试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)逆转录合成cDNA。使用TB Green®Premix ExTaqTM试剂盒(日本TaKaRa 公司)进行逆转录实时荧光定量PCR(reverse transcription quantitative real-time PCR，RT-qPCR)实验，mRNA相对表达量以2-ΔΔCT表示，具体操作步骤参照试剂说明书进行。ANXA2 及内参GAPDH 引物分别为：ANXA2，上游5'-GAGCGGGATGCTTTGAACATT-3'，下游5'-TAGGCGAAGGCAATATCCTGT-3'；GAPDH，上游5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。

1.7 细胞迁移与侵袭实验

1.7.1 迁移实验从24 孔板取出Transwell 小室(美国Corning 公司)，向孔内加入700 μL 含20%血清的RPMI-1640培养基，向小室内加入200 μL不含血清的培养基，室温放置10 min后弃去液体。细胞消化离心后使用PBS 清洗细胞，重悬并计数。向小室内分别加入KYSE30和KYSE150细胞5×104个(体积200 μL)，置于培养箱内培养12～24 h。取出上室，用无菌棉球擦拭上室，使用PBS清洗两次，晾干后加入固定液(甲醇和丙酮体积比1∶1)固定20 min，弃去固定液，加入甲醇稀释的0.5%结晶紫染色30 min，流水清洗。晾干，滴加树脂后用盖玻片封片，镜下拍照，计数。

1.7.2 侵袭实验将基质胶(美国Corning公司)用无血清无抗生素RPMI-1640 培养基按照1∶33 的比例稀释，取50 μL 加至Transwell 小室中，室温静置1 h，其余操作同细胞迁移实验。

1.8 细胞集落形成实验

收集KYSE30 细胞消化后计数，将1 000 个细胞均匀接种于6 孔板中，使用RPMI-1640 培养基于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养1周后，弃掉培养基，使用甲醇固定30 min，结晶紫染色10 min，拍照并计数集落数量。

1.9 统计学处理

以上所有实验均独立重复3 次，采用GraphPad Prism 8.0软件进行数据统计分析。两组间数据比较采用独立样本t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 ANXA2基因敲低gRNA表达质粒的构建

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Puro&Zeocin质粒具有2 个BsmBI 内切酶的识别位点，位点之间为相距1 885 bp的填充序列(图1A)。将ANXA2的6对经退火处理的gRNA 寡核苷酸双链与酶切后的载体连接，转化Stbl3感受态细菌，筛选出阳性克隆。对照及各靶点单克隆菌液Sanger 测序结果显示，对照及6 个靶点序列均正确插入pLenti-U6-gRNA-Cas9 载体，插入序列的位置、方向及序列与理论一致(图1B)，表明对照及ANXA2基因敲低gRNA表达质粒构建成功。

图1 对照及ANXA2基因敲低gRNA表达质粒的构建

2.2 稳定敲低细胞中ANXA2的表达显著降低

鉴于ANXA2 在食管鳞癌KYSE30 中表达水平较高，我们使用该细胞进行病毒感染及嘌呤霉素筛选，以获得敲低ANXA2 的KYSE30 细胞。利用Western blot 检测了细胞中ANXA2 蛋白表达情况，结果见图2，显示具有gRNA 靶点4～6 的细胞中ANXA2 的蛋白水平较对照显著降低，而在具有gRNA 靶点1～3 的细胞中未见明显改变。Western blot 结果还显示，具有ANXA2 敲低gRNA 靶 点5 和6 的KYSE30 细 胞中MYC蛋白的表达显著降低，与此前使用siRNA 敲降[5]的结果一致，而靶点1～4 gRNA中MYC蛋白水平未见明显变化。具有gRNA 靶点5 和6 的稳定敲低细胞中ANXA2的mRNA水平显著降低。以上结果表明，稳定敲低ANXA2基因的KYSE30细胞系构建成功，且gRNA靶点5 和6 的细胞中ANXA2 和MYC 均显著下调。因此，后续实验均使用这两个靶点进行。

图2 ANXA2敲低gRNA靶点的筛选

2.3 敲低ANXA2 显著降低食管鳞癌细胞的迁移侵袭和集落形成能力

我们进一步增加构建了食管鳞癌细胞KYSE150的ANXA2 稳定敲低细胞(图3 和图4)，并检测了敲低ANXA2 对 食 管 鳞 癌KYSE30 和KYSE150 细 胞 的ANXA2 蛋白和mRNA 表达水平以及对细胞表型的影响。结果显示，与对照组相比，敲低ANXA2 后，食管鳞癌KYSE30 和KYSE150 细胞的ANXA2 蛋白和mRNA 表达水平均显著降低(P＜0.05 或P＜0.01)，而且两种细胞的迁移、侵袭能力均显著下降(均为P＜0.01，图5)，KYSE30 细胞的集落形成能力显著减弱(P＜0.01，图6)，提示食管癌细胞的恶性表型受到了明显抑制。

图3 Western blot检测ANXA2敲低细胞中ANXA2蛋白表达情况

图4 qPCR检测ANXA2敲低细胞中ANXA2 mRNA表达情况

图5 Transwell实验检测ANXA2敲低对细胞迁移和侵袭能力的影响

图6 KYSE30细胞集落形成图

3 讨 论

ANXA2蛋白在人体细胞内广泛存在，具有多种生物学功能。ANXA2 异常表达参与恶性肿瘤细胞的侵袭、转移、耐药等多种过程，其在调控恶性肿瘤进展的关键信号通路中发挥重要作用[4]。越来越多的研究表明，ANXA2可能成为新的预后判断标志物和治疗靶点[13]。近年来，基于ANXA2的小分子抑制剂、靶向疗法和免疫疗法陆续被报道[14-16]，其在临床治疗中的应用价值尚待进一步深入探索。

研究表明，ANXA2高表达可以作为食管鳞癌的不良预后标志物[5]，其表达升高与食管鳞癌细胞的恶性表型相关，可以通过多种信号通路促进食管鳞癌细胞的侵袭运动[5，17]。这提示ANXA2的异常变化在肿瘤临床中具有潜在应用价值。

CRISPR/Cas9 是一种高效、简单、廉价的实现细胞内基因编辑方法。该技术使基因功能和蛋白质功能研究变得更加便捷，基于CRISPR/Cas9 基因编辑技术的疾病治疗方法也取得了飞速进展[18]。近些年，研究者们从Cas9蛋白、向导RNA、转染方法等方面进行了改进，并降低了脱靶效应[19]。以往关于ANXA2基因在肿瘤中的作用研究绝大多数是使用RNA 干扰技术(包括siRNA 和shRNA)进行的。关于ANXA2 敲除的研究目前尚少，有学者使用同源重组技术在人结直肠癌细胞中敲除ANXA2 后，发现细胞的生长和运动均减缓[20]；利用CRISPR/Cas9 技术敲除中国仓鼠卵巢细胞中的ANXA2，可以减少重组治疗蛋白生产过程中宿主细胞蛋白的污染[21]。然而，目前尚无使用CRISPR/Cas9 技术敲除食管鳞癌细胞中ANXA2基因的研究报道。因此，针对ANXA2 的基因编辑和潜在治疗应用有待探索。

本研究使用CRISPR/Cas9 基因编辑技术快速高效地构建了ANXA2 稳定敲低的慢病毒包装载体，并感染细胞获得ANXA2基因稳定敲低的食管鳞癌细胞。我们筛选了6 个基因敲低靶点，利用Western blot 和RT-qPCR 实验检测基因敲低后细胞内ANXA2 的蛋白和mRNA 水平的变化，最终确定两个敲除效果较好的靶点进行后续实验，结果发现ANXA2 敲除细胞中癌基因MYC蛋白表达降低，且细胞的迁移、侵袭以及集落形成能力均明显减弱。以上结果与本课题组之前报道的使用siRNA 瞬时敲降处理对细胞表型和下游分子表达的影响均一致[5]。我们还观察到，在ANXA2表达降低最显著的细胞中，仍能检测到少量ANXA2 的表达。推测可能的原因为：在病毒感染细胞的过程中，并非所有细胞的感染效率均一致，且整合于基因组的效率也可能不同，从而导致不同细胞中ANXA2 表达量的差异。后续研究将进一步对上述细胞分离单克隆，以获得敲低效果更好的细胞，同时还将构建敲低ANXA2的其他食管鳞癌细胞模型。

综上所述，本研究使用CRISPR/Cas9 构建了稳定敲低ANXA2基因的食管鳞癌KYSE30 和KYSE150 细胞，显著抑制了细胞的恶性表型，为进一步阐明ANXA2 促进食管鳞癌细胞恶性的作用机制以及基于ANXA2通路新靶点的研究奠定了实验基础。