基于网络药理学探讨“运脾法”治疗儿童腺样体肥大的机制及实验验证

张奕星,林 燕,杨 铭,姜之炎

(1.丽水市中医院儿科,浙江 丽水 323000;上海中医药大学附属龙华医院 2.儿科、3.GCP中心,上海 200030)

腺样体是儿童时期重要的免疫器官之一,也是儿童呼吸道第一道防线。生理性腺样体肥大常于2～6 岁时出现,5～8岁达峰值,后逐渐自然萎缩[1]。若外界病原体入侵人体,引起腺样体淋巴组织增生,即腺样体肥大(adenoidal hypertrophy,AH),可诱发鼻塞、张口呼吸、夜眠打鼾等临床症状,长期易导致阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)及腺样体面容,甚至影响肺、心、脑等组织器官的正常功能活动[2]。有研究[3]表明,在随机代表性样本中儿童和青少年AH的临床患病率达34.46%,故AH受到越来越多临床医生及家长的关注。对AH的治疗,西医以局部应用鼻用激素进行抗炎或手术切除治疗为主,有一定副作用及手术风险,中医则基于儿童生理病理特点及疾病发展规律进行辨证论治。本病属于呼吸道疾病,在五脏中属肺,但病位在鼻,鼻居土位而属脾,且脾肺为母子之脏,在气的生成运行及水液代谢方面相辅相依。上海中医药大学附属龙华医院姜之炎教授认为痰是儿童AH的主要致病因素,而痰的产生、凝聚和消散均与脾的功能息息相关,脾病湿胜为“痰”之本源,故治痰多从治脾入手,提出“运脾治鼻”新观念,创“运脾化痰通窍方”治疗儿童AH,方中以苍术燥湿运脾,薏苡仁健脾渗湿,共为君药,在临床上取得满意疗效[4],但对“运脾治鼻”的作用机制还未进行系统的研究。

网络药理学是研究中药复方多成分、多靶点作用机制的有效方法之一,其整体性、系统性、联系性的特点与中医整体观念、辨证论治及动态观思维相一致[5],借助医学、生物信息学、计算机科学等多学科为研究手段,通过整合多种生物数据库,构建“成分-疾病-靶点-通路”网络,能系统综合地反映中药或中药复方的可能作用机制,是探索中药药理的有效的方法。因此,本项研究借助网络药理学方法,分析运脾化痰通络方中君药“苍术-薏苡仁”的有效成分及治疗靶点,以探讨“运脾法”治疗儿童AH的可能机制,同时通过实验对核心靶点进行验证,以期为中医药治疗儿童AH提供新的科学依据。

1 材料

1.1 数据库及软件Database name URL:1.TCMSP https://tcmspw.com/tcmspsearch.php;2.TCMID http://www.megabionet.org/tcmid/;3.BATMAN-TCM http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/;4.PubChem https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/;5.UniProt https://www.uniprot.org/;6.OMIM https://www.omim.org/;7.GeneCards https://www.genecards.org/;8.DurgBank https://go.drugbank.com/;9.DisGeNET https://www.disgenet.org/;10.Venny https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/;11.STRING https://string-db.org/;12.Metascape https://metascape.org/;13.Bioinformatics http://www.bioinformatics.com.cn/。

1.2 实验动物SPF级雄性BALB/c小鼠30 只,体质量(20～25) g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,SCXK(沪)2017-0005,适应性喂养1周,饲养于SPF级层流实验室,饲养环境温度保持在(22±1)℃,湿度保持在65%～70%,12 h明/暗光照周期,可自由饮水。实验动物饲养及观察于上海中医药大学附属龙华医院进行,操作符合上海中医药大学附属龙华医院动物伦理委员会的相关审批(No 2018082306A),所有的外科手术过程都是在麻醉下进行的,并尽一切努力尽量减少痛苦。

1.3 药物与试剂中药苍术由上海中医药大学附属龙华医院中药房提供并进行苍术酮的分离与提取;HIF-1α多克隆抗体(英国Abcam,ab16066);VEGF多克隆抗体(英国Abcam,ab11934);VEGF-R多克隆抗体(美国Proteintech,13687-1-AP);SUMO-1多克隆抗体(美国Proteintech,10329-1-AP);封闭液(英国Abcam,ab216327);羊抗兔HRP标记二抗(碧云天,A0208);羊抗鼠HRP标记二抗(碧云天,A0216);RIPA组织细胞快速裂解液(上海基尔顿生物,BYL40825);BCA蛋白定量试剂盒(美国Thermo,PICPI23223);30%丙烯酰胺(29 ∶1,上海基尔顿生物,BYL40857);1.0 mol·L-1Tris-HCl,pH 8.8电泳缓冲液(上海基尔顿生物,BYL40910);1.0 mol·L-1Tris-HCl,pH 6.8电泳缓冲液(上海基尔顿生物,BYL40908);TEMED(上海基尔顿生物,BYL40728);4×蛋白上样缓冲液(上海基尔顿生物,BYL40828)蛋白预染Marker(加拿大Fermentas,SM1811);丽春红S(上海基尔顿生物,BYL40635);Tween-20(美国Amresco,BYL40713);NC膜(德国millipore,HATF00010);发光液(德国Millipore,WBKLS0100);10%SDS(上海基尔顿生物,BYL40944);10%过硫酸铵(上海基尔顿生物,BYL40856);其余试剂如PBS缓冲液、脱脂奶粉等由上海中医药大学附属龙华医院中心实验室提供。

1.4 仪器超临界液体萃取仪(沃特世科技(上海)有限公司,型号SFE),小型垂直电泳仪(美国BIO-RAD公司,型号mini protean 3 cell);多功能酶标仪(美国Bio Tek公司,Synergy2型);电转仪(大连竞迈科技有限公司,型号PS-9);恒温水浴锅(瑞士莱卡公司,型号HI1210);全自动化学发光成像系统凝胶成像仪(天能,型号Tanon-5200)。

2 方法

2.1 网络药理学

2.1.1“苍术-薏苡仁”活性成分筛选及相关靶点预测 以“苍术”、“薏苡仁”为关键词,通过中药系统药理学数据库(TCMSP)、中医综合数据库(TCMID)及中医药分子机制生物信息学分析平台(BATAMAN-TCM)等进行检索,得到药物的主要化学成分,根据药代动力学(ADME)参数,以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、类药性(drug-likeness,DL)≥0.18、P<0.05、Scorecutoff>20 为标准进行筛选[6],并参考相关文献补充未收录于数据库的相关有效成分,利用有机小分子生物活性数据库(PubChem)[7]根据其3D分子结构,在DTPS靶点预测系统中查找可能靶点,最终获得“苍术-薏苡仁”中具有较高活性的有效化学成分及其作用靶点。筛选结束后,通过全球蛋白资源数据库(Uniprot)对上述靶蛋白基因名进行标准化,去除重复数据后得到最终的靶点信息。

2.1.2构建运脾化痰通窍方“药物-成分-靶点”可视化网络图 运用Cytoscape 3.9.1软件构建运脾化痰通窍方“药物-成分-靶点”网络,其中“节点(node)”为中药、活性成分及作用靶点,“边(edge)”表示各节点间相互作用的关系,“度(degree)”代表与之连接边的数目,节点度值越大说明节点在网络中越重要。利用Cytoscape软件中“Network Analysis”功能进行网络拓扑属性分析,探索药物活性成分与靶点之间的关系。

2.1.3儿童AH相关靶点检索 通过人类孟德尔遗传病数据库(OMIM)、基因数据库(Gene Cards)、药物数据库(Drug Bank)及疾病相关的基因及突变位点数据库(DisGeNET),以“adenoid hypertrophy”、“adenoid vegetation”作为关键词分别进行检索,在Genecards 数据库中,根据经验设定Score大于中位数的目标靶点为AH的潜在靶点,合并几个数据库筛选结果后剔除相同靶点,获得与AH相关靶点信息,同样使用Uniprot数据库进行规范。最运将AH疾病相关靶点和“苍术-薏苡仁”药对相关靶点取交集,绘制韦恩图,得到“疾病-药物”交集靶点。

2.1.4“苍术-薏苡仁”药对治疗儿童AH的PPI网络构建 为明确运脾化痰通窍方中君药“苍术-薏苡仁”相关靶点与AH疾病靶点之间的相互作用,将绘制韦恩图后得到的交集靶点蛋白提交入STRING数据库进行蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)分析,并将结果导入Cytoscape 3.9.1软件进行进一步分析。

2.1.5“苍术-薏苡仁”药对治疗儿童AH核心靶点的富集分析 将“苍术-薏苡仁”治疗儿童AH的核心靶点录入Metascape数据平台[8],物种选择“H. sapiens”,设置P<0.01后进行基因本体(gene ontology,GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析,其中GO分析包括生物过程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和细胞组成(cellular component,CC),以了解核心靶点主要的生物学过程与相关信号通路。并通过“微生信”在线平台对分析结果进行可视化。

2.1.6构建“苍术-薏苡仁”药对治疗儿童AH的“靶点-通路”可视化网络图 将富集到的通路信息导入Cytoscape 3.9.1软件进行“靶点-通路”网络的构建,并利用软件中“Network Analysis”功能进行网络拓扑属性分析,最终构建靶点与通路之间的关系图。

2.2 动物实验

2.2.1分组及给药 适应性喂养1周后,采用随机数字表将30 只BALB/c小鼠分为对照组、模型组、治疗组(低、中、高剂量组),共5 组,每组各6 只。除对照组外其余各组予LPS处理后低氧环境下培养28 d,即使用Hycon系统调节空气/氮气输送,90 s 6.1%的O2与N2与90 s 21% O2(室内空气)在照明阶段交替12 h,夜间氧浓度维持在21%。造模结束后,治疗组予苍术酮干预,低、中、高剂量组分别给予苍术酮10、20、40 mg·kg-1,采用灌胃给药,每天1 次,连续28 d,对照组与模型组予等体积纯水灌胃处理。

2.2.2标本采集 疗程结束后以戊巴比妥钠30 mg·kg-1腹腔注射麻醉小鼠,取脾组织,剪成细小的碎片,按每20 mg组织加入150～250 μL裂解液的比例加入裂解液,匀浆器匀浆直至完全裂解,4 ℃ 12 000g离心15 min,取上清,使用BCA试剂盒进行蛋白质定量后贮存于-80 ℃冰箱备用。

2.2.3Western blot法检测脾组织中相关蛋白表达 根据目的蛋白的分子量(SUMO-1 12 ku、HIF-1α 120 ku、VEGFA 43 ku、VEGF-R 151 ku)选择不同的凝胶浓度以配制分离胶,不同组的蛋白质提取物经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,然后转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,用5%脱脂牛奶封闭后,与相应的一抗在4 ℃下孵育过夜。样品与一抗孵育后,与二抗孵育,随后,使用电化学发光系统清洗可视化膜,使用凝胶软件分析蛋白带密度。以β-actin作为加载对照。

3 结果

3.1 “苍术-薏苡仁”成分及靶点获取经查找筛选,最终得到苍术有效化学成分4 种,分别为汉黄芩素、柱头甾醇、苍术酮、β-胡萝卜苷,薏苡仁有效化学成分5 种,分别为2-油酸甘油单酯、胆固醇、亚油酸乙酯、谷甾醇及豆甾醇。将有效成分进行编号,具体见Tab 1。有效成分根据ADME参数预测靶点,苍术作用靶点57 个,薏苡仁作用靶点30 个,将靶点经Uniprot统一校正并去重后,共获得“苍术-薏苡仁”药对相关靶点71个。

Tab 1 Basic information on effective chemical composition of “Cangzhu-Yiyiren”

3.2 “苍术-薏苡仁”药对“药物-成分-靶点”网络构建和分析通过 Cytoscape 3.9.1软件构建“药物-成分-靶点”的网络关系图,共有82节点,包含苍术、薏苡仁2 种中药(以圆形表示),9 种活性成分(以六边形表示)和筛选得到的71 个靶点(以方形表示)与118 条关系,见Fig 1。

Fig 1 The “Drug-component-target” network map

3.3 儿童AH相关靶点检索从Genecards数据库以“adenoid hypertrophy”作为关键词检索到疾病靶点851 个,以“adenoid vegetation”作为关键词检索到疾病靶点518 个。根据经验设定Score大于中位数的目标靶点为AH的潜在靶点,故分别设Score>6.56和Score>3.82的靶点作为儿童AH的潜在靶点,进一步结合OMIM、DurgBank等数据库结果,合并并删除重复靶点,最终得到AH相关靶点337 个,绘制韦恩图,见Fig 2,可得出“药物-疾病”交集靶点30 个。

Fig 2 Venny of “Drug-disease” targets

3.4 “苍术-薏苡仁”药对治疗儿童AH的PPI网络构建将“药物-疾病”交集靶点导入STRING库,得到30 个核心蛋白的 PPI网络图,如Fig 3。并将 PPI 结果导入 Cytoscape 软件中进行拓扑分析,共得到30 个节点,298 条边,并根据各基因靶点度值(Degree)评估最核心靶点,面积越大、颜色越深说明该节点度值越高,见Fig 4。

Fig 3 PPI network of “Cangzhu-Yiyiren” for pediatric AH

Fig 4 The core genes of “Cangzhu-Yiyiren”

Fig 5 The bar diagram of GO enrichment analysis of treatment in AH by “Cangzhu-Yiyiren”

3.5 “苍术-薏苡仁”治疗儿童AH靶点功能与通路的富集分析应用Metascape平台对核心靶点进行富集分析,并借助微生信在线作图工具进行可视化输出。将GO富集分析(BP、CC、MF)绘制条状图,横坐标代表富集的名称、纵坐标以-Log10(P)的值体现富集的大小,值越大代表本条信号通路越富集,如Fig 5所示,“苍术-薏苡仁”药对主要参与的生物学过程有管形态形成(tube morphogenesis)、对激素的反映(response to hormone)、对含氧水平下降的反映(response to decreased oxygen levels)等,运脾药对治疗AH主要涉及的细胞成分有膜筏(membrane raft)、转录调节因子复合物(transcription regulator complex)、转录抑制因子复合物(transcription repressor complex)等,相关靶点调治AH的功能主要富集于转录因子结合(transcription factor binding)、蛋白质结构域特异性结合(protein domain specific binding)、蛋白激酶结合(protein kinase binding)等。

KEGG通路富集分析绘制气泡图,其中横坐标代表富集的大小,纵坐标代表富集的通路,气泡大小提示该通路的基因数,气泡颜色由绿至红代表-Log10P由小至大,和P值呈负相关,见Fig 6,由结果可见多个靶点的功能与儿童AH的产生密不可分,参与的通路主要与炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等相关,如多种细胞凋亡、VEGF信号通路、HIF-1信号通路等。

Fig 6 The bubble analysis of KEGG enrichment analysis

3.6 “苍术-薏苡仁”药对治疗儿童AH“靶点-通路”可视化网络图将在Metascape平台富集到的18条通路信息导入 Cytoscape 3.9.1软件,绘制“靶点-通路”网络图,红色圆形为通路,按富集到此通路的基因靶点数量的多少进行排列,绿色长方形代表基因靶点,颜色越深则说明此基因靶点参与的通路越多,见Fig 7。

Fig 7 The bubble analysis of “Targets-pathways”

3.7 验证苍术酮通过HIF-1α-SUMOylation 调节炎症因子的表达采用Western blot法检测脾组织中相关蛋白表达,结果显示,模型组SUMO-1、HIF-1α、VEGF及VEGF-R蛋白表达量均较对照组上调,差异有统计学意义(P<0.01),各治疗组目标蛋白表达均有不同程度下调,其下调程度与苍术酮浓度相关,高剂量治疗组SUMO-1、HIF-1α、VEGF及VEGF-R蛋白表达量下调程度均更加明显(P<0.01),见Fig 8,9。

Fig 8 Expression of SUMO-1,HIF-1 α,VEGF and its receptor protein in spleen tissues of mice in each group

Fig 9 Target protein gray levels in spleen tissue of mice in each

4 讨论

在古代中医典籍中并无“腺样体肥大”病名,但根据其临床表现或常见并发症可归属于“鼻窒”、“鼾眠”、“乳蛾”等疾病中。元代朱丹溪《丹溪心法·卷二·痰十三》[9]书中云:“凡人身结核不红、不痛、不做脓,皆痰注也……痰挟瘀血,遂成囊窠”,故AH可归属于“痰核”、“囊窠”范畴,而喻嘉言《寓意草》中也描述:“窠囊之来,始于痰聚胃口,……痰入既久,则阻碍气道,而气之奔入者,复结一囊也”,说明本病的发生、发展和转归与“痰”密切相关,治疗上应以“化痰散结”为主。儿童AH属肺系疾病,小儿肺脏尤娇,感染外邪首先犯肺,肺主治节又为水之上源,肺气失宣则津液不得正常输布,凝而为痰,但肺为“贮痰之器”,脾才是“生痰之源”,加之肺脾为母子之脏,在生理、病理及经络循行上均密切相关,小儿又“脾常虚”,脾运失健,枢机不利,水湿停聚,聚而成痰,痰浊蕴结肺道,痰气交阻,停聚于上气道,终致腺样体肥大[10],故在治疗上重视“运脾化痰”。《景岳全书》有言:“善治痰者,惟能使之不生,方是补天之手”,加之脾胃本为后天之本,“四季脾旺则不受邪”,故从治脾入手治疗儿童AH,一方面截断生痰之源,一方面脾健则人体气血旺盛,能护卫机体、祛邪抗病。本课题组在前期的临床试验中也证实以“运脾”为理论基础的“运脾化痰通络方”治疗儿童AH具有良好的临床疗效[4,11],同时对细胞免疫具有调节作用[4]。方中未将通窍、化痰或是散结药物作为君药,而是以苍术燥湿运脾、薏苡仁健脾渗湿共为君药,全方将化痰、通窍寓于健脾之中,使脾健则痰化,痰化则络通,络通则结散,结散则气行。

对于“运脾法”治疗儿童AH,本课题组前期侧重于临床研究,对其作用机制研究尚缺乏,网络药理学通过网络数据库,结合生物学、基因蛋白组学等理论,构建“药物-成分-靶点-疾病”互作的网络,可以整体预测复方的作用机制,是研究中药复方药理的重要方法。故课题组将“运脾治鼻”的代表方剂运脾化痰通窍方中作用“运脾”的君药“苍术-薏苡仁”进行网络药理学分析,结果显示其主要活性成分为豆甾醇、谷甾醇、苍术酮等。谷甾醇和豆甾醇都属于植物甾醇,是多种植物类中药的重要化学成分,有抗炎、抗氧化、抗菌等生物活性[12],有研究[13]发现,谷甾醇可通过抑制炎症小体NLRP3的激活,来抑制CAS1的产生及MAPK信号通路的活化,从而下调细胞中IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平而起到抗炎作用,且谷甾醇免疫调节功能较强,研究表明[14]其与维生素D3 联用可增强巨噬细胞的免疫作用。豆甾醇则在实验中被证实能减轻IgE介导的龋齿动物的皮肤过敏反应[15],说明其有一定抗过敏作用。苍术酮是苍术的特征成分,本课题组前期研究发现苍术酮通过激活SIRT3诱导巨噬细胞向M2型转换,从而减轻细胞损伤[16],部分揭示了运脾化痰通窍方治疗AH的分子作用机制。通过对有效成分及其生物活性作用的分析显示,“苍术-薏苡仁”药对AH主要作用与抗炎、抗氧化,抗过敏等作用相关。

通过“药物-疾病”靶点交集可得出核心靶点30 个,其中度值较高的有HIF-1、VEGFA、IL-6、TP53等,富集分析结果也显示“运脾法”治疗AH参与的通路主要与炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等相关,如多种细胞凋亡、VEGF信号通路、HIF-1信号通路等。因此,我们对“运脾法”治疗AH可能的部分通路作验证性实验,选择特征性成分苍术酮及富集分析结果提示的较为富集的与氧化应激密切相关的HIF-1信号通路,以期证实“健脾法”对AH缺氧状况的改善作用。结果表明,苍术酮能有效下调缺氧模型小鼠SUMO-1、HIF-1α、VEGF及VEGF-R的蛋白表达。AH患儿由于上呼吸道阻塞可导致机体间歇性缺氧,人体氧感受器通过一系列的信号转导,激发低氧诱导适应性基因的高表达,才能维持组织氧供,并增强细胞在缺氧情况下的生存能力。缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是维持人体氧平衡的重要转录因子,有HIF-1α和 HIF-1β两个亚基,其中 HIF-1α是调节亚基,在血管重塑、细胞增殖、葡萄糖和能量代谢等方面发挥着重要作用[17],HIF信号通路通过激活大量缺氧适应性基因来保护细胞免受缺氧诱导的损伤,而HIF-1就是此类适应性基因表达的主要调控者。小泛素类蛋白(small ubiquitin-related modifier,SUMO)能共价修饰HIF-1蛋白,特别是SUMO-1在缺氧应激反应中有着重要的作用,在低氧环境下,反应性蛋白表达应激性增高,可促进SUMO-1的表达,以及HIF-1α的SUMO修饰,同时血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)启动子被激活,与HIF-1α结合,增强VEGF基因的转录活性。有研究表明低氧微环境下HIF-1α通过SUMO化修饰增强其蛋白转录活性,导致相关下游基因表达升高,从而影响宿主细胞的分化及生物学功能[18]。另一方面,HIF-1α还广泛参与机体的炎症反应和免疫应答,如炎症过程中,细胞分泌的炎性因子可调节HIF-1α的稳定性,上调其下游因子VEGF等的表达,IL-1β、TNF-α、PGE2及LPS等致炎性细胞因子均能激活HIF-1α的转录活性,在炎症细胞中聚集并影响细胞的生物学功能。总之,炎症及缺氧改变可能通过HIF-1α-SUMOylation通路调节其蛋白转录活性,从而影响相关下游基因的表达及宿主细胞的生物学功能,结合本次网络药理学研究及动物实验验证结果,可以认为,“运脾”药物能抑制 HIF-1α-SUMOylation逆转缺氧及炎症反应,干预AH的发病与发展。

儿童AH治疗重点在于“运脾”、“化痰”、“通窍”,脾为后天之本,为人体气血之源,脾健不在补而贵在运,“运”即运化之意,运脾即恢复脾胃生理功能,以运化水谷营养全身,运化水液使之不至于蓄集成痰,达到“化痰”目的,脾健则气血生化有源,气通血行,孔窍通利,络脉流畅而“通窍”。另外,“痰”在中医学中是致病因素也是病理产物,现代研究所理解的“痰”是各种异物、病原微生物,炎症细胞及坏死脱落的粘膜上皮细胞所组成的,故“化痰”包括现代医学的“抗炎”作用。我们应用“苍术-薏苡仁”药对治疗儿童AH进行网络药理学研究,其主要成分、核心靶点、重要通路均与抗炎、免疫调节、抗氧化等相关,也通过动物实验进行了验证,说明通过“运脾”可以达到以上所述疗效,也从分子层面一定程度上体现了其作用机制。