黄芩苷调节let-7i-3p/PI3K/Akt/NF-κB信号轴减轻类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞NLRP3炎性小体活化

2023-12-12杨雨欣万巧凤

中国药理学通报 2023年12期

张炜,王莉,杨雨欣,马锐,王丽,黄菱,万巧凤

(1. 宁夏医科大学基础医学院病原生物学与医学免疫学系,宁夏银川 750004;2. 宁夏医科大学总医院风湿科,宁夏银川 750003;3. 宁夏医科大学临床医学院,宁夏银川 750004)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是自身免疫性疾病,严重时会引起全身关节肿胀疼痛及损坏,甚至残障[1]。在RA的病理进展中,涉及多种免疫细胞间的相互作用,其中人成纤维样滑膜细胞(human fibroblast like synoviocytes of rheumatoid arthritis,HFLS-RA)的NLRP3炎性小体异常激活发挥重要作用[2]。所以,研究NLRP3炎性小体异常活化的影响因素及开发治疗RA的新药意义重大。

NLRP3炎性小体属于固有免疫组分,由NLRP3、凋亡斑点样蛋白(ASC)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(caspase-1)组成。ASC通过与caspase-1前体结合而激活caspase-1,进而促进IL-1β、IL-18分泌,直接影响RA的炎症状态[3]。当前治疗RA主要策略是抑制NLRP3炎性小体的活化[4]。前期研究表明,黄芩苷具有良好的缓解HFLS-RA分泌炎性细胞因子[5]、减轻胶原诱导型关节炎大鼠关节病变的作用[6]。有关黄芩苷抗RA作用机制亟待深入阐明。本研究以HFLS-RA为研究对象,探究黄芩苷是否具有减轻NLRP3炎性小体活化的作用及其可能机制,为黄芩苷临床治疗RA提供更坚实的理论基础。

1 材料

1.1 细胞株HFLS-RA(货号:C1195),购自上海冠导生物工程有限公司;293T细胞(货号:CL0005),购自丰晖生物科技有限公司。

1.2 药物与试剂黄芩苷(纯度98%),购自兰州沃特莱斯生物科技有限公司。let-7i-3p NC、let-7i-3p mimics、let-7i-3p inhibitor、let-7i-3p inhibitor NC,由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成;TRIzol(货号:15596-026)、RT-qPCR扩增试剂盒(货号:AM1200),均购自Invitrogen公司;M-MLV反转录试剂盒(货号:RR036A),购自TaKaRa公司;一抗PI3K p110α(货号:AG2867)、p-Akt(Ser473,货号:AF5740)、NLRP3(货号:AF2155)、ASC/TMS1(货号:AF6234)、caspase-1(货号:AF1681),均购自上海碧云天生物技术有限公司;NF-κB p65抗体(货号:4764),购自美国Cell Signaling Technology公司;GAPDH一抗(货号:60004-1-Ig)、FITC标记山羊抗兔IgG(货号:SA00003-2),均购自武汉三鹰生物技术有限公司;HRP标记山羊抗兔IgG二抗(货号:ZB-2301),购自北京中杉金桥生物技术有限公司;人IL-1β(货号:RX106152H)、IL-18(货号:RX106154H)ELISA试剂盒,均购自睿信生物科技有限公司。

1.3 仪器PCR仪(qTOWER3G,德国耶拿分析仪器有限公司);Westen blot电泳仪(DYY-300B,北京东方瑞利电泳设备有限公司);Westen blot多功能成像系统(SH-523,杭州申花科技有限公司);荧光显微镜(DMI3000+DFC310FX,德国徕卡公司)。

2 方法

2.1 细胞培养采用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养HFLS-RA,传代3～4次后,进行后续实验。

2.2 黄芩苷对NLRP3炎性小体活化的影响

2.2.1免疫荧光检测各组细胞NLRP3的荧光强度本实验共设4组,分别为对照组、黄芩苷(25、50、100 mg·L-1)干预组,每组3个复孔。HFLS-RA以2×104个/孔接种于铺有细胞爬片的24孔板,培养24 h。黄芩苷干预48 h后取出爬片,采用4%多聚甲醛固定细胞15 min;采用0.25% Triton X-100处理10 min;滴加山羊血清37 ℃封闭30 min,滴加NLRP3抗体37 ℃孵育1 h;滴加FITC荧光二抗,避光孵育30 min;最后滴加DAPI封片,采用荧光显微镜观察并拍照。

2.2.2Western blot检测p-PI3K、p-Akt、NF-κB p65、NLRP3、ASC及caspase-1蛋白表达实验分组同“2.2.1”。将HFLS-RA以6×105个/皿接种至直径35 mm的培养皿,细胞贴壁后,加黄芩苷干预48 h,提取各组细胞总蛋白,BCA法蛋白定量。SDS-PAGE电泳及转膜,5%脱脂牛奶封闭后,分别加入对应一抗4 ℃孵育过夜;TBST漂洗液洗膜3次,每次10 min;加入HRP标记的二抗,37 ℃孵育1 h;加入ECL发光液,经X线曝光、显影、定影。最后采用Image-Pro Plus软件对目的条带进行灰度分析,各目的条带与GAPDH的灰度比值为目的蛋白的相对表达量。

2.2.3ELISA检测细胞上清中炎症因子的含量按照IL-1β、IL-18试剂盒说明书,测定各组细胞上清中IL-1β、IL-18的含量。

2.3 黄芩苷抑制NLRP3炎性小体活化的机制研究

2.3.1双荧光素酶报告实验验证let-7i-3p靶向作用PIK3CA 采用生物信息学TargetScan 7.0软件分析,发现PIK3CA是let-7i-3p的靶标之一。为了进一步验证PIK3CA与let-7i-3p的靶向对应关系,本实验构建了荧光素酶报告质粒野生型3’-UTR(GV272-WT-PIK3CA-3’-UTR)、突变型3’-UTR(GV272-MUT-PIK3CA-3’-UTR)和let-7i-3p表达质粒(GV251-let-7i-3p)。本实验共设6组:实验组1(let-7i-3p-NC+3’-UTR-NC)、实验组2(let-7i-3p+3’-UTR-NC)、实验组3(let-7i-3p-NC+3’-UTR-WT)、实验组4(let-7i-3p+3’-UTR-WT)、实验组5(let-7i-3p-NC+3’-UTR-MUT)、实验组6(let-7i-3p+3’-UTR-MUT)。使用X-tremegene HP转染剂共转染293T细胞,转染48 h后,检测萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶的活性,在转染目的质粒时,安排0.5 μg GFP质粒单独转染。质粒构建由上海吉凯基因科技有限公司完成。

2.3.2Western blot验证let-7i-3p靶向作用PIK3CA 本实验共设4组:let-7i-3p mimics组、let-7i-3p NC组、let-7i-3p inhibitor组、let-7i-3p inhibitor NC组。将HFLS-RA以2×105个/孔接种于直径35 mm皿中,每组3个复皿。用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养,待细胞长至80%～90%时,弃上清,PBS清洗2次,按LipofectamineTM3000转染说明书,将let-7i-3p mimics、let-7i-3p NC、let-7i-3p inhibitor及let-7i-3p inhibitor NC分别转染对应组,37 ℃、5% CO2培养箱中培养5 h后,更换新的含有10%胎牛血清的DMEM继续培养48 h。蛋白提取及Western blot同“2.2.2”。

2.3.3RT-qPCR检测黄芩苷干预前后let-7i-3p及PIK3CA mRNA表达本实验设对照组、100 mg·L-1黄芩苷干预组,每组3个复孔。将HFLS-RA以6×105个/孔接种6孔板。黄芩苷处理48 h后,提取总RNA,紫外分光光度计定量。以3 μg RNA为模板,反转录合成cDNA,再以2 μL cDNA为模板扩增。PCR总体积为20 μL,扩增条件:预变性94 ℃、15 min,变性95 ℃、20 s,退火60 ℃、35 s,延伸72 ℃、20 s,共35个循环,72 ℃延伸10 min后,4 ℃终止反应。采用2-ΔΔCT计算基因的相对表达量,GAPDH为PIK3CA内参、U6为miRNA内参。引物由上海生工生物工程有限公司合成,序列见Tab 1。

2.3.4miRNA干扰验证黄芩苷经调节let-7i-3p/PI3K抑制NLRP3炎性小体的活化本实验共设4组:对照组、100 mg·L-1黄芩苷干预组、let-7i-3p inhibitor组、let-7i-3p inhibitor+100 mg·L-1黄芩苷干预组,每组3个复孔。将HFLS-RA以2×104个/孔接种于铺有细胞爬片的24孔板,培养24 h后,进行miRNA干扰及黄芩苷干预。let-7i-3p inhibitor转染方式及黄芩苷干预方式分别同“2.3.2”及“2.3.3”。

3 结果

3.1 黄芩苷可抑制NLRP3炎性小体活化

3.1.1黄芩苷对NLRP3炎性小体活化的影响如Fig 1A所示,与对照组比较,50、100 mg·L-1黄芩苷干预组的NLRP3荧光强度明显减弱。说明黄芩苷可抑制NLRP3炎性小体的活化。

3.1.2黄芩苷对PI3K/Akt/NF-B/NLRP3信号轴关键蛋白表达的影响如Fig 1B所示,与对照组比较,50、100 mg·L-1黄芩苷处理组的p-PI3K、p-Akt、NF-κB p65、NLRP3、ASC及caspase-1蛋白表达水平明显降低。表明黄芩苷的抗炎作用与其下调PI3K/Akt/NF-κB/NLRP3信号轴关键蛋白的表达相关。

3.1.3黄芩苷对HFLS-RA分泌IL-1β及IL-18蛋白表达的影响如Fig 1C所示,与对照组比较,50、100 mg·L-1黄芩苷处理组IL-1β及IL-18的含量明显降低。说明黄芩苷抑制了IL-1β及IL-18的分泌。

3.2 黄芩苷抑制NLRP3炎性小体活化的机制

3.2.1let-7i-3p与PIK3CA存在靶向对应关系 TargetScan 7.0预测结果显示,let-7i-3p靶向PIK3CA基因的3’-UTR(Fig 2A)。如Fig 2B所示,质粒转染体系无异常。与对照组相比,let-7i-3p可以明显降低野生型质粒的活性,而不影响突变质粒的活性(Fig 2C)。如Fig 2D所示,分别转染let-7i-3p mimic、let-7i-3p NC、let-7i-3p inhibitor及let-7i-3p inhibitor NC 48 h后,与let-7i-3p NC组相比,let-7i-3p mimic组PIK3CA蛋白的表达明显降低(P<0.01);与let-7i-3p inhibitor NC组相比,let-7i-3p inhibitor组PIK3CA蛋白的表达明显升高(P<0.01)。该实验研究表明,let-7i-3p与PIK3CA存在靶向相对应关系。

3.2.2黄芩苷对HFLS-RA中let-7i-3p及PIK3CA mRNA表达的影响如Fig 3所示,与对照组比较,黄芩苷干预组let-7i-3p的表达明显上调(P<0.05),PIK3CA mRNA表达明显下调(P<0.01)。

3.2.3黄芩苷靶向调节let-7i-3p/PIK3CA轴减轻NLRP3炎性小体的活化如Fig 4所示,与对照组比较,黄芩苷干预后明显抑制了NLRP3炎性小体的活化;let-7i-3p inhibitor干扰let-7i-3p后,加强了NLRP3炎性小体的活化;黄芩苷明显抑制了let-7i-3p inhibitor干扰而增强的NLRP3炎性小体的活化。该实验进一步表明,黄芩苷经靶向作用let-7i-3p/PIK3CA轴,减轻了NLRP3炎性小体的活化。

4 讨论

RA的主要病理特征为病变关节滑膜的增殖及持续分泌高水平促炎细胞因子,导致软骨损伤和骨侵蚀[7]。HFLS-RA是介导RA关节破坏的主要效应细胞,其NLRP3炎性小体高度活化、分泌炎性介质与PI3K-Akt信号通路的持续激活相关[8]。

PI3K-Akt信号通路可调节炎症因子的释放、炎症相关酶的形成,参与RA的病理过程,在HFLS-RA中广泛存在,并异常激活[9]。根据结构和特定底物的不同,PI3K被分为Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类,其中研究最多的是Ⅰ类PI3K。哺乳动物表达4种Ⅰ类催化亚基(p110α、β、δ和γ),分别由PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD和PIK3CG基因编码。P13K被激活并催化细胞第二信使PIP3的形成。反之,PIP3也会招募Akt激酶,激活下游其他分子[10]。Akt是PI3K信号通路的主要介质,位于PI3K信号通路的下游,是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,分为Akt1、Akt2、Akt3三种类型,基中Akt1在人体各种组织中表达[11]。一旦被激活,Akt将磷酸化下游的其他分子,从而激活下游通路[12]。Akt磷酸化活化IκB激酶,导致NF-κB抑制剂IκB的降解,从而使NLRP3炎性小体上游的NF-κB核转位,促进多种炎症因子的表达,进而参与炎症性疾病的发生[13]。

Fig 3 Effect of baicalin on let-7i-3p (A) and

miRNA是在真核生物中一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,其长度为18～25个核苷酸的非编码的小分子RNA,可与靶基因的3’-UTR区结合,使靶基因翻译受到抑制或引起靶基因降解,从而发挥负向调节作用。miRNA的异常表达与许多疾病,如癌症及RA的发生发展密切相关[14]。有研究表明,miRNA在PI3K信号转导中发挥重要作用[15]。let-7是目前研究最为广泛的miRNA之一[16],在多种肿瘤中表达下调[17]。作为let-7家族的一员,let-7i-3p在癌症中异常表达[18]。

为了探究黄芩苷的抗炎机制,本研究首先采用免疫荧光实验,发现50、100 mg·L-1的黄芩苷可明显抑制HFLS-RA中NLRP3炎性小体的活化。机制研究表明,50、100 mg·L-1黄芩苷可明显抑制HFLS-RA中p-PI3K、p-Akt、NF-κB p65、NLRP3、ASC及caspase-1蛋白表达,表明黄芩苷的抗炎作用与其下调PI3K/AKT/NF-κB/NLRP3信号转导相关。为了深入探究黄芩苷减轻NLRP3炎性小体活化的分子调控机制,本研究通过miRNA靶向预测软件Targetscan预测了作用于PI3K的miRNA,发现let-7i-3p是调控PIK3CA亚基的miRNA之一;双荧光素酶实验进一步证实了let-7i-3p与PIK3CA存在靶向对应关系;黄芩苷干预实验表明,黄芩苷上调了HFLS-RA中let-7i-3p的表达、下调了PIK3CA的表达;为了探明黄芩苷与let-7i-3p及NLRP3炎性小体活化三者的关系,进行了let-7i-3p干扰实验,结果表明,黄芩苷明显减轻了因let-7i-3p干扰而增强的NLRP3炎性小体的活化。最终结果表明,黄芩苷通过促进let-7i-3p表达、靶向抑制PI3K的PIK3CA亚基的表达,从而减弱了PI3K/Akt/NF-κB信号转导,最终减轻了NLRP3炎性小体的活化。