角鲨烯环氧酶对宫颈鳞癌细胞增殖、凋亡及迁移侵袭的影响

夏娜娜,陈思颖,杨京蕊,康 敏,余敏敏

(南京中医药大学附属南京医院/南京市第二医院,江苏 南京 210003)

宫颈癌是困扰女性的常见恶性肿瘤之一,其发病率位居我国妇科恶性肿瘤前列[1]。宫颈癌的病理分型包括鳞癌、腺癌和腺鳞癌,其中鳞癌占比达到了75%～80%[2]。当前针对宫颈鳞癌的治疗手段仍是以早期手术及中晚期放化疗为主,然而对于晚期、复发或转移的患者而言,虽经放化疗,预后仍较差。随着现代分子生物学和基因组学的发展,肿瘤的靶向治疗、免疫治疗进行的如火如荼,但目前已有的靶向药物针对宫颈鳞癌的治疗疗效有限。因此,对于宫颈鳞癌的治疗有待于发现新的更可靠的治疗靶点。

近年来,人们通过对肿瘤生物学和肿瘤代谢的深入探究,了解到胆固醇代谢重编程在肿瘤进展中的作用,主要表现为胆固醇合成的上调和相关代谢产物的异常聚集[3]。角鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SQLE)主要存在于内质网上,是胆固醇生物合成中的第二种限速酶,能够催化角鲨烯转化为2,3-环氧角鲨烯。研究表明,SQLE的表达与多种肿瘤如胰腺癌[4]、前列腺癌[5]和乳腺癌[6]等进展、侵袭和转移紧密相关。然而,SQLE在宫颈鳞癌中的调控作用还未见报道。本研究首先通过生物信息学方法分析了SQLE在宫颈鳞癌和正常宫颈组织的mRNA及蛋白表达量差异,探讨了SQLE与宫颈鳞癌临床病理学特点之间的关系,然后评估了高表达SQLE mRNA宫颈鳞癌患者的总生存期(overall survival,OS)和无病生存期(disease free survival,DFS),最后以宫颈鳞癌细胞Siha为对象,用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制SQLE的表达及转染重组质粒促进SQLE的表达,观察SQLE基因对Siha细胞增殖、凋亡和迁移侵袭的影响及作用机制,为宫颈鳞癌的临床治疗提供新的思路与理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1生物信息学资料 GEPIA数据库(gene expression profiling interactive analysis,http://gepia.cancer-pku.cn/)是一个基于癌症基因组图谱(TCGA)和基因型-组织表达数据库的基因表达分析的网络工具。SQLE在宫颈鳞癌与正常宫颈组织中的基因差异表达使用GEPIA数据库筛选条件:Gene:SQLE, |Log2FC|≥1,P<0.05,Cancer name:CESC,同时使用此筛选条件分析SQLE的表达对宫颈鳞癌患者生存预后的影响;人类蛋白图谱(HPA)数据库(the human protein atlas,https://www.proteinatlas.org/) 可以在单细胞水平上实现下调蛋白的空间定位,并提供基因的组织学表达信息。使用HPA数据库检索条件:Gene:SQLE,Cancer Type:CESC,下载SQLE在宫颈鳞癌与正常宫颈组织的免疫组化染色图片;使用UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu/)检索条件:Gene:SQLE, Cancer Type:CESC,分析SQLE的表达与临床病理资料的相关性。

1.1.2细胞株 人脐静脉内皮细胞HUVEC-12和人宫颈鳞癌细胞Siha购自中国科学院上海细胞研究所。

1.1.3主要试剂 DMEM培养基(Gibco,C11995500BT);胎牛血清(Gibco,10099141);CCK-8试剂盒(美国MCE,HY-K0301);RIPA裂解液(上海碧云天,P0013B);BCA试剂盒(上海碧云天,P0010S);结晶紫染液(上海碧云天,C0121)、凋亡检测试剂盒(南京诺唯赞生物,A211-01)、GAPDH抗体(10494-1-AP)、SQLE抗体(12544-1-AP)、Bax抗体(50599-2-IG)、Bcl-2抗体(12789-1-AP)、E-cadherin抗体(10494-1-AP)、Vimentin抗体(10494-1-AP),购自武汉三鹰生物;PI3K(A0265)、p-PI3K(AP0854)、Akt(A11016)、p-Akt抗体(AP0140)购自武汉爱博泰克;LipofectamineTM2000转染试剂盒(美国Invitrogen,11668019)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养及转染 采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基,置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育,取对数生长期的细胞进行实验。在转染前1天消化收集Siha细胞,接种细胞至6孔板中,使转染细胞密度达到40%～60%,根据siRNA ∶DEPC水=1OD ∶125 μL配制储存液,以脂质体 ∶siRNA储存液为1 ∶1(V/V)的最优比,按照说明书进行基因干扰处理。同样细胞传代3次达稳定状态后取细胞密度达到40%～60%时进行质粒转染,转染空载体质粒的Siha细胞为Vector组,转染SQLE重组质粒的Siha细胞为SQLE组,依照试剂盒说明进行转染操作。转染48 h后收集细胞,显微镜观察细胞形态并判断转染效率,Western blot法验证转染效果。

1.2.2CCK-8法检测细胞增殖 将转染后的细胞接种于浓度为5×103/孔的96孔培养板中,设置干扰对照组(si-NC组)、干扰处理组(si-SQLE组),过表达对照组(Vector组)及过表达处理组(SQLE组)。每组处理5个复孔,置于37 ℃、5%CO2培养箱,分别培养24、48和72 h。每孔加入90 μL完全培养液及10 μL CCK-8,将培养板放入培养箱避光孵育2 h,用酶标仪检测A450nm值。

1.2.3流式细胞仪检测凋亡率 细胞传代铺至6孔板,设置si-NC组、si-SQLE组、Vector组和SQLE组并转染相关片段,6 h后换液,48 h后弃培养液,用PBS洗2次,用不含EDTA的0.25%胰酶消化,1 200 r·min-1离心5 min,得到细胞沉淀。用预冷的PBS洗涤细胞,加入100 μL Binding Buffer混匀细胞,然后每组细胞加Annexin V-FITC和PI各5 μL,室温避光放置10 min,加入400 μL 1× Binding Buffer,混匀,在1 h内用流式细胞仪检测。

1.2.4划痕实验检测细胞迁移 取经处理过的各组对数生长期Siha细胞铺至6孔板,待细胞贴壁且密度达到90%时,用200 μL吸头划直线痕,每孔横竖各划3条,用PBS轻洗3次去除漂浮细胞,加入无血清培养基,每孔随机选取5个视野并标记,分别在0和24 h用显微镜拍照。

1.2.5Transwell检测细胞侵袭 将50 μL基质胶稀释液加入小室上层中,放入恒温培养箱至基质胶凝固。取经处理过的对数生长期Siha细胞,以每孔数为2×105个重悬200 μL不含胎牛血清的培养液中,置于上层小室。同时,将含有20%胎牛血清的600 μL培养液放入下室。培养24 h后,去除上室细胞,用4%多聚甲醛固定下室细胞,0.1%结晶紫染色,晾干后拍照并计数。

1.2.6Western blot检测细胞蛋白表达 向各组细胞中加RIPA裂解液提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,加热使蛋白变性。SDS-PAGE蛋白电泳,蛋白分离后,电转至PVDF膜上。先用含5%脱脂奶粉封闭1 h,再以一抗工作液(1 ∶1 000)在4 ℃孵育过夜,最后以二抗(1 ∶5 000)室温孵育1.5 h。洗膜,加入ECL化学发光剂,暗室显影曝光。结果采用ImageJ软件进行分析,实验重复3次。

1.2.7qRT-PCR法检测SQLE mRNA表达水平 收集细胞,用TRIzol试剂提取细胞总RNA,用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板,GAPDH为内参,进行PCR扩增,引物序列:SQLE上游引物5′-CTCCAAGTTCAGGAAAAGCCTGG-3′,下游引物5′-GAGAACTGGACTCGGGTTAGCT-3′;GAPDH上游引物5′-CTGCCAACGTGTCAGTGGTG-3′,下游引物5′-TCAGTGTAGCCCAGGATGCC-3′。

2 结果

2.1 宫颈鳞癌及正常宫颈组织SQLE mRNA的表达GEPIA数据库分析结果表明,SQLE在宫颈鳞癌组织中表达量明显高于正常宫颈组织,差异具有统计学意义(P<0.05),见Fig 1A。

2.2 HPA数据库免疫组化结果通过HPA数据库检索免疫组织化学检测标本,获得宫颈正常组织标本2例,宫颈鳞癌标本17例,宫颈腺癌标本5例;免疫组织化学检测结果(Fig 1B)显示,宫颈正常组织样本中均未检测到SQLE蛋白的表达,宫颈鳞癌组织中13例SQLE蛋白表达呈阳性,宫颈腺癌组织中4例SQLE蛋白表达呈阳性。

Fig 1 Different expression and immunohistochemical staining

2.3 SQLE与宫颈鳞癌临床病理特征相关性分析通过UALCAN数据库进行SQLE基因表达与临床病理资料相关性分析,纳入306例肿瘤样本、3例正常组织样本。分析结果显示在Stage分期、年龄、淋巴结转移等亚组中,SQLE在宫颈鳞癌中的表达均高于正常组织,差异有统计学意义(P<0.01),见Fig 2A-F。其中在宫颈鳞癌中不同年龄、Stage分期和淋巴结转移等组间差异有统计学意义(P<0.01),见Fig 2A-E。在宫颈鳞癌的不同Stage分期中,SQLE在Ⅳ期的表达高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期;在宫颈鳞癌的不同淋巴结转移中,SQLE在N0组的表达低于N1组。而在宫颈鳞癌肿瘤分级中组间差异无统计学意义(P>0.05),见Fig 2F。

Fig 2 Correlation analysis between SQLE gene expression and clinical pathological data

2.4 高表达SQLE mRNA的宫颈鳞癌患者的OS和DFS评估通过GEPIA数据库OS和DFS结果显示,SQLE mRNA低表达组宫颈鳞癌患者的OS较高表达组明显延长,差异有统计学意义(HR=1.80,P<0.05);SQLE mRNA低表达组宫颈鳞癌患者的DFS较高表达组,差异无统计学意义(HR=1.60,P>0.05),见Fig 3。

Fig 3 Relationship between expression of SQLE and OS, DFS in patients with cervical squamous cell carcinoma

2.5 SQLE在宫颈鳞癌Siha和人脐静脉内皮HUVEC-12细胞中的表达以人脐静脉内皮HUVEC-12细胞作为对照,通过qRT-PCR和Western blot法检测SQLE在人宫颈鳞癌Siha细胞中mRNA和蛋白表达水平,见Fig 4。结果显示,Siha细胞SQLE mRNA和蛋白相对表达量分别为(2.35±0.55,1.33±0.15),明显高于HUVEC-12细胞(1.00±0.04,1.00±0.09),差异具有统计学意义(P均<0.05)。

Fig 4 Differential expression of SQLE in Siha and HUVEC-12

2.6 SQLE对Siha细胞SQLE蛋白表达和细胞增殖影响转染SQLE siRNA和过表达质粒48 h后,用qRT-PCR及Western blot法检测人宫颈鳞癌Siha细胞中SQLE mRNA及蛋白表达,见Fig 5A-F。与si-NC组相比,si-SQLE转染组SQLE mRNA及蛋白表达水平明显降低(1.00±0.13vs0.19±0.06,1.00±0.05vs0.45±0.07)(P<0.01,P<0.05),见Fig 5A-C;与Vector组相比,SQLE转染组SQLE mRNA及蛋白表达量增加(1.00±0.20vs3.22±0.54,1.38±0.12vs1.00±0.08)(P均<0.05),见Fig 5D-F。CCK-8结果显示,与si-NC组细胞生长相比,作用24 h、48 h及72 h si-SQLE组Siha细胞增殖明显抑制(0.52±0.08vs0.39±0.05,0.75±0.12vs0.56±0.10,1.13±0.10vs0.82±0.12),差异具有统计学意义(P均<0.05),见Fig 5G;与Vector组相比,作用24 h、48 h及72 h SQLE组Siha细胞增殖率增加(0.51±0.06vs0.72±0.08,0.65±0.09vs0.90±0.12,1.10±0.12vs1.46±0.16),差异具有统计学意义(P均<0.05),见Fig 5H。

2.7 SQLE对Siha细胞凋亡率的影响癌症的发病机制可能与磷脂酰丝氨酸外化和DNA断裂在内的凋亡过程有关,在药物研发中靶向细胞凋亡可能是化疗治疗癌症的最终过程。结果显示,si-NC组和si-SQLE组Siha细胞的凋亡率分别为(6.10±1.10)%和(11.74±3.31)%。与si-NC组相比,干扰SQLE可促进Siha细胞凋亡(P<0.01),见Fig 6A-B。Vector组和SQLE组Siha细胞的凋亡率分别为(7.78±1.32)%和(2.70±0.54)%。与Vector组相比,过表达SQLE可明显抑制Siha细胞凋亡(P<0.01),见Fig 6C-D。

Fig 6 Effect of SQLE on Siha cell apoptosis

2.8 SQLE对Siha细胞迁移能力的影响细胞迁移实验结果显示,si-NC组和si-SQLE组Siha细胞的迁移率分别为(47.37±4.98)%和(21.05±3.24)%,与si-NC组相比,si-SQLE组细胞迁移率明显降低(P<0.01),见Fig 7A-B。Vector组和SQLE组Siha细胞的迁移率分别为(42.86±5.90)%和(72.73±8.15)%,与Vector组相比,过表达SQLE组细胞迁移率明显增加(P<0.01),见Fig 7C-D。

Fig 7 Effect of SQLE on migration ability of Siha

2.9 SQLE对Siha细胞侵袭能力的影响Transwell实验结果显示,si-NC组和si-SQLE组Siha细胞的侵袭数目分别为(102±11)个和(67±6)个,与si-NC组相比,si-SQLE组细胞侵袭数目明显降低(P<0.01),见Fig 8A-B。Vector组和SQLE组Siha细胞的侵袭数目分别为(105±8)个和(133±12)个,与Vector组相比,过表达SQLE组细胞侵袭数目增加(P<0.05),见Fig 8C-D。

Fig 8 Effect of SQLE on invasion ability of Siha

2.10 SQLE对Siha细胞凋亡及侵袭迁移相关蛋白的影响结果显示,si-NC组和si-SQLE组Siha细胞中E-cadherin、Vimentin、Bcl-2和Bax蛋白相对表达量分别为(1.20±0.14vs2.10±0.27)、(1.88±0.17vs1.02±0.08)、(1.72±0.15vs1.00±0.12)和(1.29±0.12vs2.02±0.16)。可知与si-NC组相比,si-SQLE组Vimentin和Bcl-2蛋白水平明显降低(P均<0.01),E-cadherin和Bax蛋白水平升高(P<0.01,P<0.05),见Fig 9A-B。Vector组和SQLE组Siha细胞中E-cadherin、Vimentin、Bcl-2和Bax蛋白相对表达量分别为(1.51±0.16vs1.00±0.06)、(1.05±0.14vs1.56±0.25)、(1.03±0.18vs1.59±0.19)和(1.44±0.15vs1.05±0.10)。与Vector组相比,过表达SQLE组Vimentin和Bcl-2蛋白水平明显升高(P均<0.05),E-cadherin和Bax蛋白水平明显降低(P均<0.05),见Fig 9C-D。

Fig 9 Effect of SQLE on expression of E-cadherin, Vimentin, Bcl-2 and Bax proteins in Siha

2.11 SQLE对PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达影响PI3K/Akt信号途径广泛存在于各种血管细胞中,在细胞增殖、迁移和抗凋亡中起着重要作用。结果显示,si-NC组和si-SQLE组Siha细胞p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt相对表达量分别为(1.85±0.19vs1.00±0.12)和(2.76±0.24vs1.86±0.16)(P均<0.05)。与si-NC组相比,si-SQLE组总PI3K蛋白及总Akt蛋白水平均无明显影响,但p-PI3K和p-Akt蛋白水平降低(1.90±0.16vs1.00±0.12,1.92±0.18vs1.38±0.15)(P<0.01,P<0.05),见Fig 10A-B。Vector组和SQLE组p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt相对表达量分别为(1.72±0.15vs2.36±0.22)和(1.00±0.10vs2.65±0.29)(P<0.05,P<0.01)。同样,两组相比,其总PI3K蛋白及总Akt蛋白水平均无明显变化,但与Vector组相比,SQLE组p-PI3K和p-Akt蛋白水平明显升高(1.77±0.19vs2.69±0.24,1.00±0.06vs2.69±0.20)(P<0.05,P<0.01),见Fig 10C-D。

3 讨论

目前全球范围内宫颈癌占女性所有恶性肿瘤的第二位,仅次于乳腺癌[1]。宫颈鳞癌的病因至今尚未完全明确,该病的发生与基因、病毒感染、过早性生活等有关[2]。由于缺乏有效的辅助治疗,宫颈鳞癌患者的预后较差,因此,迫切需要开发有效的靶标生物标志物或有前途的药物来改善患者的预后。

SQLE位于人类染色体8q24.13上,是一种致癌基因,能够影响胆固醇生物合成[4]。有研究显示,胆固醇会减弱某些物质对细胞膜的破坏作用,从而保护线粒体内质网及细胞膜的功能完整性[7]。研究表明[8],SQLE通过调节胆固醇代谢促进多种人类癌症的肿瘤发生和转移。SQLE mRNA的表达与高危ER+乳腺癌明显相关,SQLE可以通过增强胆固醇的合成,参与维持乳腺癌干细胞的干细胞性和乳腺肿瘤的进展[9]。胆固醇积累引起的SQLE减少通过激活β-catenin致癌途径和p53肿瘤抑制通路失活,加重结直肠癌的进展[10]。SQLE在肝癌组织中表达上调,可以通过正向调控ERK信号通路促进肝癌细胞的增殖和迁移,与肝癌的发生发展密切相关[11]。在胰腺癌中,SQLE与胰腺癌细胞的放射抗性相关,改变细胞周期进展特征,诱导癌细胞迁移和侵袭,从而影响患者的预后[4]。以上可知,SQLE可作为许多肿瘤预后不良的主要标志物。然而,目前SQLE基因在宫颈鳞癌中的作用还未见报道。

本研究利用GEPIA数据库和免疫组化证实,SQLE mRNA和蛋白在宫颈鳞癌组织中高表达,且SQLE mRNA高表达组宫颈鳞癌患者的OS明显缩短,表明SQLE低表达的宫颈鳞癌患者预后可能会更好。通过UALCAN数据库发现,在宫颈鳞癌的不同Stage分期中,SQLE在Ⅳ期的表达明显高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期(P<0.01);在宫颈鳞癌的不同淋巴结转移中,SQLE在N0组的表达低于N1组(P<0.01),这表明SQLE可能抑制宫颈肿瘤细胞凋亡并促进其增殖及侵袭迁移。CCK-8实验证实,干扰SQLE可抑制宫颈鳞癌Siha细胞增殖,过表达SQLE可促进Siha细胞增殖(P均<0.05),说明SQLE基因可促进宫颈鳞癌细胞增殖,但与胆固醇的合成变化有无直接关系还需要进一步研究。位于17pl3染色体上的TP53参与细胞增殖、细胞周期调控、DNA修复及促进细胞凋亡等过程,从而防止细胞转移[12]。p53蛋白能够调控Bcl-2和Bax的表达,从而在细胞凋亡中发挥作用。Bax主要参与细胞的内在凋亡信号通路,激活后从细胞质聚集于线粒体外膜,导致线粒体释放细胞色素C,激活下游的caspase等蛋白,从而启动细胞凋亡的过程。促凋亡蛋白Bax触发内在通路的激活,这是开发治疗药物的绝佳靶点,目前正在进行临床试验。流式细胞术结果显示,敲减si-SQLE组Siha细胞凋亡率明显高于si-NC组,过表达SQLE组细胞凋亡率明显低于Vector组(P均<0.01)。Western blot结果显示,si-SQLE组Bcl-2/Bax比值为si-NC组的0.37倍,即两者比值减小,可知干扰SQLE可以有效促进Siha细胞凋亡,过表达SQLE基因结果与之相反。上皮间质转化EMT是宫颈癌转移的重要机制之一,极化的上皮细胞通过重编程获得间充质细胞的特征,促使细胞的运动性和迁移能力增强[13]。宫颈癌组织中上皮化分子标志物E-cadherin低表达和间质化分子标志物Vimentin高表达在肿瘤的侵袭和转移过程中起到了重要的调控作用,是细胞恶性转化的一个特征。本实验结果显示,干扰SQLE可以抑制Siha细胞迁移和侵袭,过表达SQLE能够促进Siha细胞迁移和侵袭。类似报道是SQLE对肝癌细胞、胰腺癌细胞等侵袭迁移具有促进作用。

PI3K/Akt作为一种重要细胞内信号转导通路,其已被证实在多种恶性肿瘤中激活,参与肿瘤细胞增殖、侵袭及凋亡。PI3K是一种磷脂酰肌醇激酶,可使下游的Akt蛋白活化,活化的Akt通过抑制线粒体途径上调Bcl-2及下调Bax蛋白的表达,发挥抗凋亡作用[14]。恢复癌细胞凋亡的信号通路,诱导癌细胞凋亡,可从根本上解决宫颈鳞癌的问题。宫颈癌患者的不良预后与肿瘤是否浸润、转移密切相关,其中上皮间质转化的作用尤为重要。研究显示[15],PI3K/Akt通路激活后可降低细胞中E-cadherin的水平,并诱导Vimentin的表达,从而诱导EMT转化并促进肿瘤转移。本研究表明,干扰SQLE可以抑制p-PI3K、p-Akt的表达水平,阻断PI3K/Akt信号通路;过表达SQLE可以增加p-PI3K、p-Akt的表达水平。提示SQLE可能通过促进PI3K/Akt信号途径调控Siha细胞的增殖、凋亡及侵袭转移过程。这与之前的研究相比,其结果具有较好的一致性。

综上所述,本研究初步探索了SQLE在宫颈鳞癌进展中的作用。临床研究显示,与正常组织的mRNA和蛋白水平相比,宫颈鳞癌组织中SQLE的表达明显上调,且SQLE高表达的患者预后较差。细胞实验表明,干扰SQLE抑制Siha细胞增殖、侵袭、迁移及促进其凋亡,过表达SQLE促进Siha细胞增殖、侵袭、迁移及抑制其凋亡。机制研究表明,SQLE可能通过促进PI3K/Akt信号通路在宫颈鳞癌中发挥调控作用。所以SQLE有望成为治疗宫颈鳞癌的潜在靶点。但本研究还未考察SQLE对宫颈鳞癌相关动物实验的作用,这也将是下一步需要研究的内容。