红景天苷对MCAO大鼠脑血管内皮细胞的作用

余正双,郑雪蕊,谢志扬,周彬彬,吴青青,吴慧玲,赖文芳,洪桂祝

(福建中医药大学药学院,福建 福州 350122)

脑缺血/再灌注损伤后的脑损伤长期影响脑卒中患者的神经功能缺损和运动障碍。血管生成是缺血性脑卒中恢复脑血流的基本过程,可促进缺血后神经功能的恢复[1]。新血管的形成或血管新生是一个复杂的过程,在生长发育、组织和器官再生以及许多病理条件中起着重要作用[2]。

血管生成过程是排卵和胚胎发育等生理过程中组织修复、扩张和重塑的标志,也是伤口愈合、癌症、动脉粥样硬化等各种病理的标志[3-5]。细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecules-1,ICAM-1)是一种免疫球蛋白(Ig)样细胞黏附分子,由白细胞和内皮细胞在内的多种细胞类型表达[6]。ICAM-1还是炎症性血管疾病发展中的关键黏附分子,在血管生成中[7]发挥重要作用,其促进白细胞与内皮细胞之间的黏附可能影响血管生成。血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecules,VCAM-1)是一种蛋白质,在炎症期间规范地参与白细胞向间质的黏附和迁移[8]。Garmy-Susini等[9]实验表明,α4β1(VLA-4)和VCAM-1促进EC和周细胞之间的紧密细胞间黏附,并且这种相互作用是血管形成所必需的。E选择素(E-selectin)即CD62E,它是一种细胞黏附分子,P-选择素(P-selectin)是一种糖蛋白,主要介导粒细胞和单核细胞在内皮细胞表面的滚动以及粒细胞和单核细胞对血小板的黏附,它们对伤口愈合和缺血区域的炎症和新生血管至关重要[10]。

我们课题组长期致力于红景天苷(salidroside,SAL)对缺血性脑卒中的研究,前期研究结果发现,SAL能够降低脑梗死体积、改善神经功能损伤,具有神经保护作用[11-12]。且经预实验发现,SAL也具有调节血管生成的作用,因此,本研究重点探讨SAL对缺血性脑损伤大鼠脑血管内皮细胞作用及其调节血管生成作用,为SAL治疗缺血性脑卒中的药物研发提供理论和实验依据。

1 材料

1.1 实验动物和细胞实验选用SPF级健康♂SD大鼠24只,体质量为(260-280) g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,许可证号:SCXK(沪)2014-0002,合格证号:2015000518015,饲养于福建中医药大学实验动物中心(合格证:SYXK(闽)2014-0005);SV40T转化人脐静脉内皮细胞(HUVECs),购买武汉普诺赛生命科技有限公司(货号:CL-0675)。

1.2 实验药物和主要试剂SAL(福建中医药大学提供,纯度≥98%);ICAM-1抗体(Abcam公司,货号:ab282575);VCAM-1抗体(Abcam公司,货号:ab174279);E-selectin抗体(Abcam公司,货号:ab18981);P-selectin抗体(CST公司,货号:84298);DMEM高糖培养基(Thermo Fisher公司,货号:11965084);Matrigel(Corning公司,货号:354234);LPS(Sigma公司,货号:L2880)。

1.3 实验仪器垂直电泳槽(Bio Rad公司,Mini PROTEAT Tetra);大鼠脑模具(瑞沃德公司,型号:68709);尼龙线栓(广州佳灵,货号:3600/3800AAA);CO2培养箱(美国THermo-Scientific公司,型号:Forma371);光学显微镜(Leica公司,型号:DMi8)。

2 方法

2.1 动物分组与处理实验选用SPF级健康♂SD大鼠24只,随机分为Sham组、MCAO组和MCAO+SAL组,每组8只。线栓法制备MCAO模型后以2%戊巴比妥钠麻醉大鼠后,将线栓插入已分离并剪好开口的颈总动脉处,阻塞2 h后拔出线栓至线栓上黑点暴露,将其剪掉,完成再灌注。假手术组不插入线栓但进行同样手术操作。待大鼠清醒并能进行正常活动时,则可开始神经功能评分,2-3分视为造模成功。MCAO+SAL组腹腔注射SAL(50 mg·kg-1),其余大鼠腹腔注射同体积生理盐水。

2.2 取材给药治疗6 d后,2 %的戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠,腹主动脉放血,断颈取脑,随后将分离好的左右脑放入已做好标记的冻存管中,迅速将其放入准备好的液氮中保存。

2.3 Western blot检测蛋白表达体内动物实验,取0.1 g损伤侧脑组织提取总蛋白,用BCA试剂盒测定其浓度,经电泳,转膜,封闭,4 ℃冰箱一抗孵育过夜,ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、P-selectin抗体稀释浓度比均为1 ∶1 000,TBST洗3次,10 min/次,二抗室温孵育2 h,同一抗清洗时间和次数,最后检测目的条带并分析结果。

体外细胞实验,将HUVECs接种在75 cm2培养皿中,待其密度生长至约80%时,将完全培养基依次更换为Control(DMEM)、LPS(100 μg·L-1)、LPS(100 μg·L-1)+SAL(10 μmol·L-1)。24 h后弃培养基加细胞裂解液静置10 min,离心后取上清后,同体内动物Western blot实验过程。

2.4 细胞培养HUVECs用含有胎牛血清 (HyClone公司,货号:SV 30087.02)和1%青霉素-链霉素溶液(碧云天公司,货号:040221210504)的DMEM培养基(Hyclome公司,货号:SH300022.01)培养,置于含5% CO2的37 ℃细胞培养箱。

2.5 CCK-8法检测SAL对HUVECs存活的影响HUVECs接种于96孔培养板,5 000个/孔。细胞贴壁后随机设置Control组(DMEM)、LPS组(100 μg·L-1)、SAL组(0.1、1 、10 μmol·L-1)。每组设5个复孔,100 μL/孔。24 h后,将CCK-8试剂加入96孔板,10 μL/孔,继续孵育1 h后使用酶标仪检测450 nm处A值。

2.6 HUVECs体外血管形成实验HUVECs接种于12孔培养板,1.5×105个/孔。细胞贴壁后将培养基更换为Control(DMEM)、LPS(100 μg·L-1)、LPS(100 μg·L-1)+SAL(0.1、1、10 μmol·L-1),培养24 h后制成细胞悬液备用。将Matrigel均匀铺满24孔培养板底部且无气泡,150 μL/孔,将铺好的Matrigel放入细胞培养箱中,待30 min后凝固取出,将备用的各组细胞悬液分别加至Matrigel胶上,再次放入细胞培养箱中培养。3 h后使用倒置显微镜,在随机抽选的几处区域下观察HUVECs成管情况并拍照记录。

3 结果

3.1 SAL对MCAO大鼠损伤侧脑组织中VCAM-1、ICAM-1、P-selectin、E-selectin表达的影响MCAO模型大鼠再灌注1 h后,连续给药6 d,Western blot结果显示,与Sham组相比,MCAO组大鼠损伤侧脑组织VCAM-1、ICAM-1、P-selectin、E-selectin的蛋白表达均升高,且差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。与MCAO组相比较,MCAO+SAL组大鼠损伤侧脑组织VCAM-1、ICAM-1、P-selectin、E-selectin的蛋白表达均下降,且差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)(Fig 1)。

Fig 1 Effects of salidroside on VCAM-1,ICAM-1,P-selectin,

3.2 SAL对HUVECs存活的影响为了探究SAL和LPS是否对HUVECs的存活有影响,故与Control组(DMEM)对比,LPS(100 μg·L-1)和SAL(0.1、1、10 μmol·L-1)干预24 h对HUVECs的存活率均无影响(Fig 2)。

Fig 2 Effects of salidroside on HUVECs

3.3 SAL对HUVECs血管形成的影响血管形成能够促进缺血后神经功能的恢复,在体外血管形成实验中LPS组(100 μg·L-1)和SAL给药组(LPS+SAL)干预HUVECs 24 h,SAL给药浓度为0.1、1、10 μmol·L-1,分别观察LPS组、SAL给药组干预对其血管形成的影响。结果显示,LPS(100 μg·L-1)干预组的HUVECs形成的血管总长度比Control组短(P<0.01),SAL给药组(1、10 μmol·L-1)的HUVECs形成的血管总长度比LPS(100 μg·L-1)干预组长(P<0.01)(Fig 3)。

3.4 SAL对LPS诱导的HUVECs中VCAM-1、ICAM-1、P-selectin、E-selectin表达的影响LPS组(100 μg·L-1)和SAL给药组(LPS+SAL)干预HUVECs细胞24 h,SAL给药浓度为10 μmol·L-1,Western blot结果显示,与Control组(DMEM)相比,LPS组HUVECs中VCAM-1、ICAM-1、P-selectin、E-selectin的蛋白表达均升高,且差异具有统计学意义(P<0.01)。与LPS组相比较,LPS+SAL组HUVECs中VCAM-1、ICAM-1、P-selectin、E-selectin的蛋白表达均下降,且差异具有统计学意义(P<0.01)(Fig 4)。

4 讨论

本研究采用MCAO模型是一种经典的模拟脑缺血疾病的模型。缺血性脑卒中是一种极易使人衰弱的心脑血管疾病,发生的频率越来越高[13]。多项研究已经确定,促进血管重塑是恢复血液供应的有效手段,有利于脑卒中后的神经功能恢复[14]。很多研究证明VCAM-1、ICAM-1、P-selectin、E-selectin等在体内血管重塑和血管形成中发挥重要作用[6-9]。

课题组前期研究结果发现,SAL能够降低脑梗死体积并改善神经功能损伤,具有神经保护作用[11-12]。为了研究SAL对MCAO大鼠脑血管内皮细胞的作用,我们检测MCAO大鼠损伤侧脑组织中VCAM-1、ICAM-1、P-selectin、E-selectin表达,结果显示,MCAO模型后大鼠损伤侧脑组织中其表达量明显升高,经SAL连续作用6 d后,该作用被逆转,表明SAL改善MCAO大鼠脑血管内皮细胞再生功能。

Fig 3 Effects of salidroside on blood vessel formation

Fig 4 Effects of salidroside on VCAM-1,ICAM-1,P-selectin,

为了进一步探究SAL对于血管内皮细胞的作用,本研究基于HUVECs采用CCK-8法检测SAL和LPS分别对HUVECs存活的影响;体外血管形成实验中观察LPS组、SAL给药组(LPS+SAL)干预对其血管形成的影响。Western blot检测HUVECs中ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、P-selectin的蛋白表达。结果显示,SAL和LPS对HUVECs的存活率均无影响,LPS干预抑制了HUVECs的血管形成,而SAL逆转其作用,促进其血管形成。Western blot结果显示,SAL也能够抑制HUVECs中VCAM-1、ICAM-1、P-selectin、E-selectin的蛋白表达,这结果与本研究中体内SAL对MCAO大鼠损伤侧脑组织中抑制相关蛋白表达的作用相似,再次表明了SAL能够影响体内血管重塑和血管形成的有关蛋白的表达,进而促进其血管形成作用。

综上,SAL调控VCAM-1、ICAM-1、P-selectin、E-selectin的表达,改善缺血性脑损伤大鼠内皮细胞再生能力,进而发挥促进血管形成作用。