微生物预处理餐厨垃圾对黑水虻生长发育的影响

张 敏,孔祥平,叶 牧,韩晓坦,杜 静,王 聪,奚永兰,叶小梅,3

(1.南京农业大学 资源与环境科学学院,江苏 南京 210095;2.江苏省农业科学院 畜牧研究所,江苏 南京 210014;3.农业农村部种养结合重点实验室,江苏 南京 210014)

据联合国粮食和农业组织(FAO)公布的数据,全球每年产生近13亿t餐厨垃圾,占全球粮食的三分之一[1]。我国每年餐厨垃圾产生量超过1亿t[2],占城市固体有机废物总量的20%～45%[3]。由于餐厨垃圾富含蛋白质、淀粉和油脂等成分[4],若处理不及时,易在环境中腐败变质,危害环境卫生,滋生病原微生物,对人体健康造成严重威胁[5],同时,高昂的处理费用也给城市财政带来了沉重的负担,因此餐厨垃圾的妥善处理也是社会面临的一个重要问题。

堆肥是一种可靠的餐厨垃圾处理技术,堆肥过程不仅可减少30%～70%餐厨垃圾的体积[6],灭活大多数病原微生物,还可将其转化为富含稳定营养物质的生物有机肥[7],但是堆肥过程会产生温室气体(CH4、CO2和N2O)和排放过量的NH3亦会降低堆肥产品的实际价值,并给环境造成二次污染[8]。厌氧发酵是厌氧微生物在缺氧条件下降解畜禽粪便中有机物产生CH4和CO2的生物处理技术,厌氧发酵产生清洁能源CH4和沼液[9],但此过程也易造成二次污染,且一次性投入成本高,设备管理操作复杂,难以广泛应用[10]。黑水虻属于双翅目水虻科腐生性昆虫,具有摄食能力强和生长周期短等特点[11],可将餐厨垃圾转化成高价值的昆虫蛋白和油脂[12],以此来处理餐厨垃圾是一种更加经济可行、环境友好型的处理方式。黑水虻能高效减少餐厨垃圾的体积,Lalander等[13]和Zheng等[14]利用黑水虻处理餐厨垃圾后发现,餐厨垃圾的减少率分别达到55.30%和61.80%。可见,利用黑水虻转化餐厨垃圾不仅能降低餐厨垃圾危害环境的风险,还能实现餐厨垃圾的资源化和高值化。

近年来,黑水虻生物转化技术已成为餐厨垃圾资源化处理的重要途径。在黑水虻生物转化系统中,微生物和黑水虻依靠互利共生机制高效地完成底物的转化[15]。将微生物接种到物料中进行发酵后会显著影响黑水虻的生长,因为发酵过程涉及微生物催化大部分有机物的分解,并在厌氧条件下将其转化为有价值的次级代谢产物,不过发酵产物很大程度上受微生物菌株种类和发酵环境的控制[16]。昆虫的多样性很大程度上取决于它们与有益微生物的共生关系,微生物可能是参与宿主生活的关键媒介[17]。微生物随物料进入黑水虻幼虫体内,并在肠道内形成独特的虫菌生态系统[18]。如,喻国辉等[19]在鸡粪中接种纳豆芽孢杆菌,使黑水虻幼虫质量提高了9.22%、化蛹率提高了4.68%、转化周期缩短了2.33 d。Somroo等[20]在豆腐渣中接种乳酸杆菌,增加了黑水虻虫产率和虫体油脂含量。Wong等[16]在椰子胚乳残渣中接种酿酒酵母菌,可增加黑水虻的产率。因此,向餐厨垃圾中接种外源微生物来提高黑水虻处理垃圾的性能值得深入研究。

在实际生产中,黑水虻转化餐厨垃圾的周期一般为10 d左右。为提高黑水虻处理垃圾的效率,本研究先采用芽孢杆菌、戊糖片球菌、毕赤酵母、酿酒酵母、拜尔接合酵母和复合菌剂发酵预处理餐厨垃圾,再考察不同微生物预处理方式对黑水虻生长发育和物料转化效率的影响,优选出促进效果最佳的微生物菌剂,以期为黑水虻生物转化餐厨垃圾的工厂化和高效化运行提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 实验材料

枯草芽孢杆菌BacillusstercorisXP、戊糖片球菌PediococcuspentosaccharidesM7、毕赤酵母菌PichiaoccidentalisH1、酿酒酵母菌SaccharomycescerevisiaeZ4、拜耳接合酵母菌ZygosaccharomycesJ7Y1、黑水虻虫卵(属武汉品系),江苏省农业科学院畜牧研究所保藏。麦麸和玉米粉,南京响海生物科技有限公司;4日龄黑水虻幼虫,自培养。

餐厨垃圾,江苏省农业科学院教职工食堂(从获得的新鲜餐厨垃圾中分拣出杂物,直接用磨浆机粉碎成颗粒形态均匀的浆料,粒径小于2 mm。餐厨垃圾的具体参数为pH 5.1、干物质(DM)质量分数20.65%、总氮(TN)质量分数3.68%、总有机碳(TOC)质量分数48.50%、碳氮比(C/N)是13.76、粗蛋白质(CP)质量分数23.00%、粗脂肪(CEE)质量分数25.86%、溶解性化学需氧量(SCOD)112.68 g/L。

细菌基础培养基(LB,1 L):蛋白胨10 g、酵母粉10 g、NaCl 5 g。用于芽孢杆菌的活化培养。

乳酸细菌培养基(MRS,1 L):蛋白胨10 g、牛肉浸粉5 g、吐温80 mL、K2HPO42 g、酵母浸粉4 g、MgSO40.2 g、柠檬酸三铵2 g、葡萄糖20 g、MnSO40.05 g、乙酸钠5 g。用于活化培养戊糖片球菌。

酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD,1 L):酵母粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g。用于毕赤酵母菌、酿酒酵母菌和拜耳接合酵母菌的活化培养。

当用于固体琼脂培养基时,在以上液体培养基中均加入15 g/L的琼脂粉灭菌待用。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化

用无菌微量吸管从已溶解的低温保存管中吸取少量的菌液,滴在培养基的边缘,再用无菌接种环蘸取菌液以划线法接种在对应的固体培养基上,并在恒温培养箱中培养。

1.2.2 菌株种子培养

将活化的菌种从相应的固体培养基中挑选单菌落接种到装有50 mL对应液体培养基的250 mL摇瓶中,芽孢杆菌和戊糖片球菌在35 ℃培养,毕赤酵母菌、酿酒酵母菌和拜尔接合酵母在30 ℃培养,150 r/min培养24 h后,获得的菌液(OD600为6.70左右)作为微生物预处理的菌种源。

1.2.3 4日龄黑水虻幼虫的饲养

虫卵在恒温恒湿箱(30 ℃,湿度80%)中孵化3 d形成虫苗,将麦麸和玉米粉(体积比为3∶7)混合后孵化物料,将含水率调成65%,取400 g配制的混合物料和0.2 g虫苗放入长方体养殖盒(17 cm×11 cm×7 cm)中,取一层纱布覆盖在养殖盒上并用破孔的盒盖盖紧。在恒温恒湿箱中(30 ℃,湿度80%)饲养到4日龄(15 mg左右)。

1.3 实验设计

取300 g的餐厨垃圾于500 mL的锥形瓶中,按50 g/L的接种量接入不同微生物菌种并置于30 ℃、150 r/min的恒温培养箱中预处理4 d(表1)。用麦麸调节预处理后的餐厨垃圾含水率为70%,再取100只4日龄的黑水虻幼虫加入130 g用麦麸调节的饲料于240 mL一次性塑料杯中,饲养周期为7 d,比较不同微生物预处理的餐厨垃圾对黑水虻生长发育和黑水虻营养组成的影响。

表1 餐厨垃圾的不同处理方式

1.4 参数测定

1.4.1 pH测定

称取10 g物料,置于250 mL锥形瓶中,加入100 mL水,在摇床中摇30 min后用pH计测定。

1.4.2 含水率

精确称取适量餐厨垃圾置于105 ℃烘箱中烘干至恒质量,并计算含水率。

1.4.3 总糖测定

总糖采用DNS法参照文献[21]的方法测定。

1.4.4 溶解性化学需氧量(SCOD)测定

SCOD参照HJ 828—2017的测定方法测定。

1.4.5 挥发性脂肪酸(VFAs)采用气相色谱法测定

取1 mL一定稀释倍数的样品,加入50 μL 34%的磷酸于2 mL离心管中酸化,直至pH<2,以确保各种有机酸以酸式形态存在,摇匀后静置几分钟,待泡沫不再产生为止后,12 000 r/min离心10 min。离心后的样品经0.22 μm滤膜过滤,再将样品转移到气相色谱(GC)瓶中,待测。

1.4.6 粗蛋白质测定

粗蛋白质的含量参照GB/T 6432—2018,采用凯氏定氮法测定。取0.100 0 g烘干后的黑水虻虫体,加入10 mL硫酸于Foss消解管,再加入消解催化剂在420 ℃消解1.5 h,待其冷却后,用全自动凯氏定氮仪测定。

1.4.7 粗脂肪测定

粗脂肪的测定参照GB 5009.6—2016,采用索氏提取法测定。取1.500 0 g研磨的黑水虻虫体用滤纸包好,放入铝杯中,再用脂肪测定仪浸提,测定浸提前后铝杯质量差。按式(1)计算粗脂肪含量。

粗脂肪含量=

(1)

2 结果与讨论

2.1 微生物预处理方式对餐厨垃圾物料理化性质的影响

2.1.1 餐厨垃圾pH的变化

pH是反映餐厨垃圾发酵酸化阶段相对直观的参数。因此考察不同预处理方式对餐厨垃圾物料pH的影响,结果见图1。由图1可知:在餐厨垃圾的预处理过程中,经不同预处理方式处理后物料的pH下降幅度和趋势基本一致。在前20 h内,pH急剧下降至4.2左右,其中接种微生物菌剂处理组的pH降得最快,因为在这阶段,糖由糖酵解途径氧化为丙酮酸,丙酮酸进一步转化为乙酰辅酶A,乙酰辅酶A再被转化为乙酸和丁酸等有机酸[22],最终导致物料的pH降低;在20 h后,物料的pH缓慢降低,最终稳定在3.5左右,说明在餐厨垃圾发酵的前期有机酸含量不断积累,直到发酵体系的酸性环境不利于微生物生长,最终迫使pH稳定在3.5左右,同时也表明过度酸化会抑制发酵进程[23]。

图1 不同预处理方式对物料pH的影响

2.1.2 餐厨垃圾总糖浓度的变化

总糖包括还原糖和多糖,糖类是微生物生长的重要能源物质,在发酵过程中易被微生物转化为还原糖[24]。因此,考察不同预处理方式对餐厨垃圾物料的总糖浓度的影响,结果见图2。由图2可知:与原餐厨垃圾相比,接种微生物菌剂均使物料中总糖浓度显著降低(p<0.05),其中复合菌剂处理组(F)的总糖降得最多,比对照组(CK1)的降低了56.93%,而芽孢杆菌预处理组(A)、毕赤酵母菌预处理组(C)和拜尔接合酵母菌处理组(E)总糖降低幅度依次降低。一般来说,总糖浓度会随着微生物发酵时间的延长先升高再降低,这是因为微生物先将大分子多糖转化为小分子的单糖,然后利用单糖进行生长代谢[25],如果总糖浓度的降低幅度越大,说明微生物生长繁殖能力越强[26]。由此可见,接种芽孢杆菌、毕赤酵母菌、拜尔接合酵母菌和复合菌剂处理餐厨垃圾的能力较强。

图2 不同预处理方式对餐厨垃圾总糖的影响

2.1.3 餐厨垃圾SCOD的变化

在餐厨垃圾发酵过程中,物料中的SCOD随着时间的延长先升高后降低[27],主要是由于微生物先将大分子有机物转化为可溶性的小分子有机物,这时微生物消耗可溶性有机物的速率小于其产生速率,但是随着微生物的增殖,会消耗大量的可溶性有机物,同时微生物对有机物的水解作用受体系pH的影响,最终使SCOD降低[28]。因此,考察不同预处理方式对餐厨垃圾物料SCOD的影响,结果见图3。由图3可知:除戊糖片球菌处理组(B)、灭菌处理组(CK1)和餐厨垃圾预处理组(G)外,其余处理组的餐厨垃圾的SCOD都比对照组(CK0)的有所降低,其中复合菌剂处理组的SCOD降低幅度最大,达到12.39%,说明该处理组的微生物消耗可溶性小分子有机物来繁殖。但是,戊糖片球菌处理组(B)的SCOD却比对照组(CK0)的高,主要是因为戊糖片球菌具有抗酸性能,在pH较低的条件下,仍能够吸收利用餐厨垃圾中的有机物生长繁殖,并继续将餐厨垃圾中的大分子有机物分解为小分子可溶性有机物,使SCOD升高[29]。

图3 不同预处理方式对餐厨垃圾SCOD的影响

2.1.4 餐厨垃圾VFAs的变化

VFAs主要由乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸和异戊酸等[30]组成,它也是物料水解酸化的中间产物,发酵体系中的VFAs含量一定程度上可反映微生物水解和产酸的能力。因此,考察不同预处理方式对餐厨垃圾的VFAs的影响,结果见图4。由图4可知:各处理组的VFAs为3 085.16～10 627.14 mg/L,而且整个发酵体系中的VFAs以乙酸和丁酸为主,占总挥发性脂肪酸的87%～96%,所以乙酸和丁酸也被认为是餐厨垃圾发酵过程的稳定指标[31];戊糖片球菌处理组(B)的VFAs显著高于其他处理组的(p<0.05),其产生的总酸量是灭菌对照组(CK1)的3.44倍,这也与该处理组产生较多的SCOD结果有关,说明餐厨垃圾的可生化性能较好[32],同时也说明戊糖片球菌降解餐厨垃圾的能力较强;芽孢杆菌(A)处理组能够产生丙酸,这是因为它利用餐厨垃圾进入发酵后期,通过β-氧化作用产生长链脂肪酸戊酸[33]。

图4 不同预处理方式对厨余垃圾VFAs的影响

VFAs的组成与产生量不仅与pH、温度、碳氮比(C/N)等发酵条件有关,同时也受微生物群落的影响。pH为4～5时,为乙酸型发酵;pH为5～6时,为丙酸型发酵;温度为35和45 ℃时,乙酸和丙酸含量较高;温度为55 ℃时,丁酸含量高[34];C/N为12时,为乙酸发酵型发酵;C/N为56时,为丙酸型发酵[35]。同时也发现变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门亦是餐厨垃圾发酵产酸的特征微生物[36]。

2.2 发酵预处理后的餐厨垃圾对黑水虻生长发育的影响

2.2.1 黑水虻虫平均质量和总虫质量的变化

考察不同预处理方式处理后的餐厨垃圾对黑水虻虫平均质量和幼虫总质量的影响,结果见图5。由图5可知:以不同处理组的餐厨垃圾培养的幼虫质量在3～4 d内增长速度较快,直至第7天时增长速度趋于平缓,与徐齐云等[37]研究的结果一致;接种微生物预处理组的虫平均质量显著大于与对照组的(CK1和CK0)(p<0.05),与对照组(CK1)相比,接种微生物预处理组的虫平均质量依次提高了13.85%、14.87%、15.90%、17.95%、17.95%和17.44%。可见,餐厨垃圾经发酵预处理后对黑水虻幼虫质量的增加均有促进作用,因为微生物能够分解粪便中大分子有机物和黑水虻幼虫难以直接利用的营养物质,同时微生物产生的酶、小分子和营养物质是黑水虻所必需的[38-40]。因此幼虫能够吸收转化更多的营养物质供其生长发育。原始处理组(CK0)的黑水虻虫平均质量和幼虫总质量显著好于灭菌处理组(CK1)的(p<0.05),说明餐厨垃圾中存在的微生物有利于黑水虻的生长,而餐厨垃圾经过微生物预处理,有机物降解彻底,更利于黑水虻的吸收转化。F处理组的幼虫在2～5 d内生长发育最快,显著大于其他处理组,主要是由于丰富的微生物种群可以充分分解餐厨垃圾中的有机物,但是由于受到物料营养物质总量的限制,培养后期的黑水虻的生长趋于缓慢。所以,如果以幼虫总质量和虫平均质量为指标,拜尔接合酵母菌处理组(E)的厨余垃圾对黑水虻的生长发育最佳。

图5 不同方式预处理的餐厨垃圾对黑水虻虫总平均质量和虫质量的影响

2.2.2 黑水虻存活率和预蛹的变化

考察不同预处理方式处理后的餐厨垃圾对黑水虻存活率和预蛹率以及预蛹时间的影响,结果见图6。由图6可知:除F处理组外,其余处理组的黑水虻转化餐厨垃圾7 d后的存活率均在90%以上,各组间黑水虻存活率没有显著差异(p>0.05);A组的存活率最高(98%),F处理组的存活率仅为84%;黑水虻幼虫在第5天开始陆续出现预蛹,在试验结束时,接种微生物处理组的预蛹率显著大于对照组的(CK1)(p<0.05),并依次提高了64.24%、58.79%、64.24%、53.33%、55.15%和49.09%。由此可见,预处理的餐厨垃圾使黑水虻快速进入预蛹期,提高黑水虻的预蛹率,这主要是接种微生物菌剂后能够使有机物分解更加彻底,有利于幼虫摄食营养物质,幼虫通过调节分泌肠道酶的数量来平衡营养物质的分解和吸收[41],进而加快幼虫生长,使幼虫提前进入下一阶段。本研究中,各微生物预处理组的幼虫生长发育较快,特别是接种毕赤酵母菌处理组(C)的最好。Spranghers等[42]研究发现,黑水虻预蛹首次出现的时间是从第一次喂食开始的第19天,Meneguz等[43]研究的结果则是20 d,而本研究中是第9天。可见,微生物预处理的厨余垃圾有助于提高黑水虻的存活率和预蛹率。

2.3 发酵预处理后的餐厨垃圾对黑水虻虫体的粗蛋白质和粗脂肪含量的影响

黑水虻虫体的粗蛋白和粗脂肪含量受多种因素的影响,如饲养密度[44]和饲养物料种类[45]的不同均会影响黑水虻幼虫对营养物质的利用。因此,考察不同处理方式处理后的餐厨垃圾对黑水虻虫体的粗蛋白和粗脂肪的影响,结果见图7。由图7可知:以各处理组得到的餐厨垃圾培养的黑水虻虫体的粗蛋白质含量为40.41%～44.53%,其中拜尔接合酵母菌处理组(E)虫体的粗蛋白含量最高,比处理组(CK0)的提高了10.20%。接种外源微生物预处理组的黑水虻虫体内粗蛋白质含量显著高于对照组CK0的(p<0.05),这因为微生物将餐厨垃圾中的蛋白质分解成大量的小分子氨基酸,对虫体粗蛋白质的累积有促进作用。

图7 不同方式预处理的餐厨垃圾对黑水虻虫体粗蛋白和粗脂肪的影响

以各处理组得到的餐厨垃圾培养的黑水虻体内的粗脂肪含量为24.73%～32.16%,其中酿酒酵母菌处理组(B)虫体的粗脂肪含量最高,比灭菌对照组(CK1)的提高了18.76%,这可能是由于酿酒酵母菌处理组(B)预处理的餐厨垃圾中相关微生物被黑水虻摄食时随食物一起进入肠道,逐步成为幼虫肠道优势菌群,调节肠道生态平衡,对脂肪酸的氧化有促进作用[46]。本研究,黑水虻虫体粗蛋白质含量为40.41%～44.53%、粗脂肪含量为24.73%～32.16%,与Newton等[47]和窦永芳等[48]的研究结果相近。由此可见,外源微生物预处理的餐厨垃圾能够提高黑水虻虫体中的粗蛋白质,其中酿酒酵母菌预处理的餐厨垃圾能够提高黑水虻虫体中的粗脂肪。

3 结论

经过微生物预处理后的餐厨垃圾,物料的pH快速降低,最后稳定至3.5左右,总糖浓度和SCOD均有所降低,特别是戊糖片球菌对餐厨垃圾的分解能力和产酸能力强。经预处理的餐厨垃圾不仅能显著提高黑水虻平均质量、收虫时总虫质量和黑水虻虫体的粗蛋白,还能使黑水虻幼虫提前进入预蛹期,提高预蛹率,缩短黑水虻生长周期。戊糖片球菌和拜耳接合酵母菌组成的复合菌剂处理的餐厨垃圾更有利于黑水虻的生长发育。可见,开发更高效的外源微生物发酵处理的餐厨垃圾可提升大规模饲养黑水虻的过程效率。