用于动态调控的响应启动子在合成生物学中的应用进展

马 定,高思远,王 昕,陈可泉,2

(1.南京工业大学 生物与制药工程学院,江苏 南京 211800;2.南京工业大学 国家生化工程技术研究中心,江苏 南京 211800)

在绿色、环保、可持续发展的理念下,绿色制造是实现这一理念的重要手段,也是目前世界各国重要的战略发展方向[1]。合成生物学的目标是构建微生物细胞工厂,通过定向修改和重构细胞代谢途径,赋予微生物新的表型,使之具备目标产物的生产性能[2]。通过代谢工程手段,对底盘细胞进行改造,如敲除副产物途径或竞争途径、过表达代谢途径的关键基因等,从而实现目标产物收率最大化、碳源和能量消耗最优化[3]。但是,这些策略不仅会导致碳源的浪费、能量的损失、氧化还原的失衡以及毒性代谢物的积累等问题,而且还会引起的细胞代谢网络的失衡,从而影响细胞的生长,最终限制产品的产量[3-4]。

利用传感器(sensor)/调节器(regulator)构建的基因回路则是一个有效的解决办法[5]。类似于微生物的自然调节方式,细胞通过感知环境信号和细胞内信号,实时调节代谢通路,合理分布碳流向和能量[3,6]。动态调控系统是动态代谢调控的重要组成部分,对它进行合理选择与设计是有效动态调控代谢途径的关键,其中,响应启动子是动态调控系统中的重要组成部分,是响应信号和基因表达的重要枢纽。因此,本文就响应启动子的发现、设计与改造以及应用进行综述,并对其未来的发展做出展望。

1 动态调控系统及响应启动子概述

1.1 动态调控系统的发现及原理

动态调控系统是微生物面临环境变化,自发调控体内代谢网络,并由多个响应元件逐级调控、协调工作,实现微生物对环境变化的响应。因此,挖掘动态调控的响应元件是构建动态调控系统的基础[7]。启动子工程是工业底盘细胞中转录调控最有效的方法之一[8]。与传统的组成型启动子相比,响应启动子可以在合适的时间和空间启动基因的表达,所以它们在调控和再分配代谢通量方面发挥着重要的作用。如,通过响应启动子调控碳流再分配,实现生物量积累和产物积累的平衡,加速有毒产物的消耗和外排以提高菌株耐受性和产物产量[9]。目前,常规的诱导启动子广泛应用于合成生物学中,虽然它们可对宿主进行代谢调控,但是存在较多局限性:如,有毒的(IPTG)或者能耗尽(乳糖)的诱导剂并不利于工业化生产。此外,在培养期间添加诱导物,需要监测细胞生长状态并优化诱导物添加的时间[10],这会增加工艺路线及生产成本。因此,开发响应启动子受到研究人员更多的关注。

20世纪70年代,研究人员发现,费氏弧菌在菌体密度达到一定阈值时出现生物发光现象,直到1994年Fuqua等[11]根据这种现象提出了群体感应(QS)的概念,发现了LuxI/R、EsaI/R等一系列群体感应系统,其中,自诱导剂高丝氨酸内酯(AHL)在QS系统中起到关键作用,因为随着细菌密度的增加,当细胞外周环境中由细菌分泌的AHL积聚到一定浓度阈值时,可与细胞质中的作为受体的LuxR蛋白的氨基残端结合,激活诱导启动子,使调控的基因得到表达。2010年,Valdez-Cruz等[12]发现,温敏启动子PR/PL受温敏阻遏蛋白CI857调控,基于此开发温敏启动子,继而温敏启动子在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌等微生物中得到大规模的应用[13]。近年来,响应启动子得到了更广泛的挖掘。Rohlhill等[14]在分析甲醛解毒操纵子的基础上,在大肠杆菌中开发甲醛响应启动子,结果发现:当转录因子FrmR特异结合到响应启动子上会抑制基因表达,但该转录因子受甲醛变构调节作用解除抑制,加速甲醛的消耗,使之能在更高浓度的甲醇中生长。Xu等[15]通过杂交启动子技术插入PdhR box,杂交启动子能特异性识别丙酮酸,通过检测细胞内丙酮酸浓度来优化中心代谢的代谢流,从而使枯草芽孢杆菌高效合成葡萄糖二酸。周大袁等[16]根据可溶性血红蛋白(VHb)能在低溶氧下摄氧而开发溶氧响应启动子Pvhb,通过对溶氧响应启动子的串联,增强诱导强度,使表面活性素(surfactin)表达强度得到显著提升。Zhang等[17]通过天然存在的脂肪酸敏感蛋白FadR开发了脂肪酸响应启动子PFadR,结果发现:当转录因子与响应启动子特异性结合抑制表达,脂肪酸能解除该特异结合;将转录因子结合位点杂交到强启动子T7上提高动态响应范围,加速中间代谢产物脂肪酸消耗,提高终产物脂肪酸乙脂的产量。

1.2 响应启动子的结构及调控机制

启动子是一段位于目标基因上游的核苷酸序列,具有能够被RNA聚合酶特异性识别并实现转录的特性[18]。转录调控是基因表达实现供给平衡的重要方法之一[19],启动子是转录调控的核心元件[20-21]。一般原核生物的启动子主要由上游序列、-35区、间隔序列、-10区、转录起始位点及核糖体结合位点(RBS)等部分组成。-35区和-10区的序列和距离相对保守,对RNA聚合酶的结合与转录有很大的影响[22]。真核生物的启动子则较为复杂,而且不被RNA聚合酶直接识别,需要某些反式作用因子识别及其相互作用才能识别。真核生物的启动子可分为三类,分别由RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ转录起始。RNA聚合酶Ⅰ启动子(Ⅰ类)主要由-45至+20的核心启动子和-187至-107的上游调控元件构成。RNA聚合酶Ⅱ启动子(Ⅱ类)是研究最多的类型,由基本启动子、上游元件、起始子及应答元件构成。RNA聚合酶Ⅲ启动子组成较复杂,可分为3个亚类,即I型基因内启动子、Ⅱ型基因内启动子和基因外启动子(Ⅲ型)。

在启动子的结构中存在着转录因子结合位点,这些转录因子结合位点一般都与响应信号有关,实现对目标基因表达调控。基因的表达调控一般由正反馈或者负反馈调控完成。负反馈调节是由阻遏蛋白或抑制因子结合到启动子的操纵区上,从而抑制目标基因的正常表达。当细胞中存在响应信号时,响应信号与阻遏蛋白结合,改变阻遏蛋白构型,使之不能与启动子序列结合,目标基因得以正常表达(图1)。正反馈调节则是在响应信号存在的情况下,激活蛋白结合在启动子上,从而使RNA聚合酶能在启动子上顺利转录翻译与表达(图2)。目前开发的大部分响应启动子,都是基于转录因子来实现对信号的响应到基因表达的传导。由于转录因子与响应启动子特异结合,阻止了RNA聚合酶的转录,从而实现对目的基因表达的抑制,当转录因子受到响应信号的变构调节解除抑制,目的基因得以表达。基于响应启动子的相关原理,研究人员开发出了各种调控开关,通过响应信号对启动子的激活或者抑制,实现对目的基因表达的激活或者抑制,如,对代谢过程关键酶的调控来增加产量[23]、对抗逆基因的过表达增加抗逆性等[24]。

图1 负反馈调节示意

图2 正反馈调节示意

2 响应启动子的类型及特征

目前,根据启动子的响应信号可分为化学信号和物理信号两大类。在化学信号响应启动子中,目前还是以类似IPTG的外源添加诱导剂为主(图3),但这种类型的诱导启动子在目前还存在着一定的缺陷:一方面,诱导剂价格昂贵,不适合工业规模的生产;另一方面,诱导剂对宿主菌有一定毒性且添加诱导剂时需要持续观测菌株的生长情况等。

响应启动子受外源压力或添加的诱导剂激活,关键酶过表达,加速底物消耗,增加终产物产量

物理信号响应启动子主要基于细胞代谢过程的各种环境因素为响应信号而被开发出来。一般以代谢过程中的环境温度、溶氧及渗透压等因素作为响应信号,实现对代谢过程的动态调控。与外源添加的信号相比,宿主自身代谢产生的内源信号(多为化学信号)则有更多优势(图4),因为宿主会更加及时地处理内源信号,且不需要观测菌株的生长代谢情况再进行调控,可大大减少工作量,提高调控精确度,更好地为代谢目标产物服务,所以目前越来越多的研究人员将研究重点放在内源性响应启动子开发方面。通过对响应启动子的开发以及后续的改造等,实现启动子对整个代谢途径的动态调控,来解决代谢过程中的相关问题,如,提高终产物产量、加速有毒中间产物的消耗、检测胞内产物浓度、增加抗逆性等。

中间代谢产物或者终产物积累过多,诱导启动子被激活,关键酶过表达,加速中间产物消耗或者终产物外排

2.1 化学信号类型的响应启动子

为了实现细胞代谢过程的动态调控,减少诱导剂的使用,目前在响应启动子领域的研究取得较多成果。大肠杆菌在生产倍半萜紫穗二烯时,会产生有毒的中间代谢产物法尼焦磷酸(FPP),这会严重影响目标产物的产量,Dahl等[25]在FPP胁迫条件下对全基因组进行转录组分析,筛选出对FPP毒性作出反应的启动子PrstA和PgadE,虽然这两个启动子的响应机制还尚不清楚,但使用这两个启动子能使目标产物倍半萜紫穗二烯的产量比组成型启动子的提高2倍,同时也减少了副产物的积累(图5)。这种在不清楚响应机制的情况下,通过转录组分析得到理想的启动子的思路受到越来越广泛的关注,因为这能够大大减少各种类型响应启动子开发的时间。

图5 PFPP响应示意

同时也存在另一种情况,即通过解析细胞对有毒物质的解毒机制来寻找响应启动子,但是这种方法需建立在对有毒代谢物有一定的研究基础上。如,Rohlhill等[14]通过对中间代谢产物的甲醛进行解毒机制分析后得到甲醛解毒操纵子frmRAB及甲醛响应启动子Pfrm,再对启动子进行突变并筛选阳性突变株,这极大地提高了启动子在甲醛诱导下的响应强度;同时发现,突变体能在更高浓度的甲醇中生长,能更好地利用甲醇,这种结合细胞自身的解毒机制和自我保护机制为响应启动子的开发提供了新思路,正成为响应启动子开发的一种重要方法。

除了加速有毒中间代谢产物消耗外,响应启动子还在提高终产物产量方面得到很好的应用,更可用于监测产物的浓度。Binder等[26]研究碱性氨基酸诱导的启动子后发现,转录因子LysG与启动子Psenlys特异性结合后,受赖氨酸变构调控,可通过响应启动子Psenlys实时监控胞内赖氨酸浓度。最近Zhao等[27]在转录因子cgmAR中发现了腐胺、尸胺等二胺的响应启动子PcgmA,因为cgmR能与响应启动子特异结合,抑制基因的表达,但该转录因子受二胺的变构调节后,解除与启动子的结合;同时他们通过对转录因子的随机突变获得更加灵敏的传感器,该传感器通过响应启动子调控报告基因GFP,再通过监测胞内荧光值变化来实时监测细胞产二胺的情况(图6)。

图6 PcgmA响应示意

除了代谢产物作为诱导信号外,影响代谢过程外部环境中的化学信号也受到广泛关注,Xu等[28]在研究大肠杆菌对酸的耐受性时发现,启动子PfabA、PfabB能对中性酸(pH 4.0～5.0)作出响应,通过提高细胞膜的不饱和脂肪酸(UFAs)的含量,从而提高细胞对酸的耐受。该启动子对酸响应主要是通过双组分系统CpxRA周质组氨酸残基质子化来实现的:在低pH情况下,CpxA周质结构的H52和H117的组氨酸残基质子化,使CpxA磷酸化激活CpxR蛋白,该蛋白能直接结合到响应启动子PfabA和PfabB上,从而增强启动子转录的强度,增加不饱和脂肪酸的含量,从而产生对中性酸的耐受性,使对数生长期的大肠杆菌在该酸性环境下实现从生存到生长的转变(图7)。这种由细胞分级调控、最后由启动子响应来调控目的基因的表达,这种动态调控方式将会受到越来越多的关注。

图7 PfabA、PfabB响应示意

2.2 物理信号类型的响应启动子

除了上述的化学诱导信号外,细胞内还存在与代谢过程的环境因素密切相关的物理信号。物理信号作为代谢过程的重要指标,在微生物代谢过程中起到重要的作用,影响着细胞的生长代谢过程。因此,温度、渗透压及溶氧等物理信号在响应启动子开发方面受到了越来越多的关注,研究人员试图以物理信号为诱导因子来调控细胞代谢,以减少代谢过程产生的一系列负担以及副产物等,从而提高终产物的产量以及菌株对环境因素的耐受性。

在这些物理信号中,温度是应用最广泛的,温敏启动子也被随之开发出来。温敏系统主要由启动子PL和PR及温敏蛋白CI857ts两部分构成,其中PL和PR来源于大肠杆菌λ噬菌体,具有极强的RNA转录功能,在合成生物学中有广泛的应用。更重要的是,该启动子受蛋白CI857ts负调控:在30 ℃时,CI857ts具有抑制PL/PR启动子的活性,但在42 ℃时,该蛋白则失去抑制启动子的活性,启动子能正常调控基因表达[12,29]。Harder等[13]用温度敏感的CI857阻遏蛋白来调控大肠杆菌生物合成衣康:在37 ℃时,积累菌体生物量,而在28 ℃时合成目标产物衣康酸,最终将衣康酸产量从32 g/L提高至47 g/L(图8)。除了PL/PR类型的温敏型启动子外,Wang等[30]通过全基因组转录组分析及qRT-PCR扩增得到一个高温敏响应启动子PCgcwp1,将其应用于谷氨酸棒杆菌,使木糖醇的产量提高了204%,达到15.4 g/L;同时,在木糖醇发酵验证实验中发现,与30 ℃发酵相比,虽然在42 ℃发酵的生物量较低,但是木糖醇的产量从5.07 g/L提高到15.40 g/L,使更多的碳源流向了终产物。该研究扩大了温敏启动子“工具箱”,使其不再局限于PL/PR启动子。

图8 温敏启动子响应示意[13]

除了温度外,渗透压对代谢过程的影响也很大。一般在发酵中后期,渗透压成为发酵过程中不得不考虑的因素,因为过高的渗透压不仅影响细胞的生长,还会大大降低目标产物的产量,所以越来越多的研究人员也将目光聚焦于此。Huang等[24]研究调节渗透保护基因mtrA/mtrB后发现,PNCgl1418对渗透压的响应是最明显的,但与传统的IPTG诱导启动子和组成启动子相比,表达强度还有很大的差距。因此,对该启动子间隔序列进行了随机突变,得到了一个突变体,强度为对照组的8.5倍,常规启动子的1.5倍,将该突变启动子PNCgl1418/A10用来调控赖氨酸转运蛋白基因lysE,通过加速发酵中后期赖氨酸的外排来提高赖氨酸的产量;通过渗透压响应启动子对赖氨酸转运蛋白基因的过表达和 CRISPRi对赖氨酸消耗途径的抑制相结合,赖氨酸产量从17.0 g/L提升到28.0 g/L,增长了64.7%(图9)。这在一定程度上解决了渗透压对代谢的影响。因为渗透压是在代谢过程中普遍存在的物理信号,比化学信号有更高的特异性,所以应用更广泛,普适性更强。

图9 渗透压响应启动子示意[24]

在发酵过程中,溶氧是至关重要的影响因素。Hwang等[23]对启动子的间隔序列进行随机突变,筛选了强、中、弱3个不同强度的启动子调控关键基因,经研究发现:在大肠杆菌中引入溶氧响应启动子Pnar,成功地将D-乳糖产量从79.0 g/L增至105.6 g/L,增加了34%;在2,3-丁二醇生产中,将丙酮酸到2,3-丁二醇途径的3个酶用3个不同强度的Pnar进行调控后得到最优组合,2,3-丁二醇的产量也从51.1 g/L增至88.0 g/L,提高了88%。与其他启动子不同的是,他们使用了响应启动子的组合,不再是单一启动子的调控,而是通过不同强度的启动子调控,实现供给和消耗的平衡,使终产物产量达到最优。

综上可知,通过对物理和化学信号响应启动子的开发与改造,可拓宽目前启动子的“工具箱”,根据不同的信号类型、发酵条件、发酵中间代谢产物和终产物选择合适的响应启动子。同时,也可以使用相关启动子的开发和改造方法来挖掘更多的响应启动子。如,可通过在胁迫条件下进行转录组学分析得到PCgcwp1、Pstress,对解毒操纵子或者保护机制的分析得到PNCgl1418、Pfrm,对现有已发现响应操纵子的解析得到:PcgmA、PmarO和PPuuR以及在前人研究的基础上开发的响应启动子Pnar、PBAD、Pc120和Psenlys。由于新开发的响应启动子的强度一般还达不到常规成熟的启动子的性能,所以对其突变改造是必不可少的。目前,对响应启动子的改造主要集中于启动子全序列的随机突变、对间隔序列的随机突变、转录因子的随机突变以及杂交启动子的利用等方面,另外通过induces box与强启动子的结合,可改变box与启动子结合区域的位置等方面以获得理想型响应启动子[15]。虽然通过相关的方法开发和改造已获得一些响应启动子,但对于建立微生物细胞工厂的需求来说,这些响应启动子的数量还是远远不够的,特别是基于化学信号的响应启动子对中间产物或终产物具有特异性识别,存在较多的局限性,所以在响应启动子开发方面还是任重道远。迄今为止,研究人员已开发出受不同的化学或物理信号调控的响应启动子,对目标基因进行不同强度的调控表达,总结部分响应启动子的相关研究进展于表1。

表1 不同类型的响应启动子

3 响应启动子的应用

在响应启动子的开发和改造方面,研究人员通过一系列方法获得较为理想的响应启动子。现在响应启动子的应用不再局限于终产物的产量最大化,而是根据实际需要,多元化应用响应启动子。如,加速中间有毒代谢产物的消耗,提高终产物的产量;响应细胞生长环境中的各种压力胁迫,提高细胞的耐受性;响应生长环境变化,使细胞从生物量的积累转化到产物的积累,通过响应细胞代谢产物,报告基因及时反馈终产物的浓度。这些响应启动子的多元化应用也加速响应启动子的开发。

3.1 响应胁迫压力提高耐受性

除了有毒中间代谢产物会影响细胞的产能外,在细胞生长代谢过程中,尤其是在发酵的中后期,各种胁迫压力严重影响细胞的生长和代谢。虽然这些因素是无法避免的,但它们也是天然存在的诱导信号,每个代谢过程都存在,比化学信号有更好的普适性。Qin等[35]通过在高温和高葡萄糖浓度等胁迫条件下获得多个胁迫响应启动子,通过对各响应启动子的组合来优化谷胱甘肽(GSH)抗氧化系统以提高酵母对各种胁迫的耐受性,最终酵母的耐受性得到提高,继而大幅提高木质纤维素发酵产乙醇能力,比对照组提升了49.5%。Huang等[24]在研究渗透压调节保护系统时发现:天然渗透压响应启动子,在大肠杆菌发酵产赖氨酸时,该启动子对发酵后期的渗透压及时响应,通过赖氨酸外排蛋白LysE及其CRISPR系统来调控;当发酵体系的渗透压过高时,响应启动子被激活,赖氨酸外排蛋白LysG过表达,加速赖氨酸外排,从而提高赖氨酸产量;另一方面,CRISPR系统在高渗下被激活,抑制了赖氨酸消耗途径,使赖氨酸产量进一步提高。这些胁迫压力的响应启动子既可解决各种胁迫,又可提高菌株的耐受性,提升终产物的产量,这类普适性较好的响应启动子在合成生物学研究及生物制造中会有更广泛的应用。

3.2 响应环境变化增加产量

通过响应环境变化,使微生物从生物量积累转变到产物的积累,一般以物理类型的响应启动子来实现,其中溶氧响应启动子、光响应启动子因其能快速切换,在相关的研究与生产中得到广泛应用。特别是更为简便的QS系统因其受细胞密度诱导,在生长与生产切换之间有着独特的优势,成为应用最多的系统。Soma等[44]将QS系统的LuxI/R应用到大肠杆菌乙酰辅酶A的消耗途径中,实现了大肠杆菌从生物量积累切换到产物异丙醇的合成:当细胞密度较低时,更多的碳源经TCA循环来增加生物量;当细胞密度达到阈值时,QS系统激活,减少乙酰辅酶A进入TCA循环来增加终产物异丙醇的碳通量,减少碳损失的同时增加终产物的产量。Zhao等[33]在酿酒酵母中应用光响应启动子,实现光控制发酵:在光诱导下,丙酮酸脱羧酶(PDC)表达,最终产生乙醇,菌体正常生长;在黑暗状态下,菌体生长被抑制,乳酸脱氢酶表达,使丙酮酸流向乳酸,最终实现产物异丁醇和2-甲基-1-丁醇的生产。

3.3 响应检测产物浓度

响应启动子不仅在提高耐受性、增加终产物产量方面得到很好的应用,而且在监测产物浓度的应用也逐渐被开发出来。生物传感器一般用于产物的浓度检测及高通量筛选,主要是由响应启动子和报告基因实现的,通过报告基因的荧光值能反映胞内产物浓度。Binder等[26]开发了碱性氨基酸诱导的启动子,转录因子LysG能够与启动子Psenlys特异性结合,受赖氨酸变构调控,通过响应启动子PsenLys实时监控胞内赖氨酸浓度。Zhao等[27]在操纵子cgmAR中发现二胺响应启动子PcgmA,转录因子cgmR能与响应启动子特异结合,抑制基因的表达;通过对转录因子的随机突变获得更加灵敏的传感器,整个传感器通过调控报告基因GFP,监测胞内荧光值实现对细胞产二胺的实时监控。而传统的二胺类检测一般采用高效液相色谱(HPLC)法[45],存在样品前期处理和检测流程复杂等缺点,与传统的HPLC方法相比,生物传感器具有检测方法便捷,在实现高通量检测同时能够实时检测,大大提高检测效率。

4 结论与展望

在绿色、环保、可持续发展的理念下,绿色制造产业蓬勃发展,合成生物学产业化在未来的发展中必将成为热点。启动子作为合成生物学重要的元件之一,通过调控目的基因表达与代谢路径,最终达到高效合成产物和酶的目标,所以启动子的研究是高效构建细胞工厂的关键。开发新型响应启动子,不断丰富合成生物学的“工具箱”,为更多的生物合成体系提供服务。启动子的应用研究正逐步从最初的IPTG诱导型启动子迈向更加复杂类型的响应启动子,从单一的启动子到多个启动子串联杂交应用。目前的研究主要集中在特殊的代谢中间产物和终产物方面的响应启动子的开发,因为这些类型的启动子似乎更加具有创新性。因为化学信号的响应启动子与对应的代谢产物之间存在特异性,对其他代谢过程并不一定通用;而物理信号响应启动子,具有更好的广谱性和可控性等优点,使它们不再局限于某一特定代谢途径。一般来说,在发酵过程中,温度和溶氧都要维持在较为稳定的状态,但是在变温和混菌等特殊的发酵过程中,应用温度和溶氧响应启动子是一种很好的选择。

目前,响应启动子的开发仍然存在许多具有挑战性的科学问题。如,单一启动子调控代谢过程常常伴随着表达泄露的问题,目前还不能从根本上解决这问题;特异性的响应启动子响应强度和程度还不能满足工业化生产的要求,达不到组成型启动子和常规诱导启动子的性能,还需要对其进行突变和改造来提高其性能。目前,已开发的响应启动子的工作原理和调控机制还需要进一步解析。这些问题是响应启动子开发的重点方向。随着生物信息学的快速发展,用计算机以及人工智能技术来挖掘各种类型的响应启动子,能够大大减少工作量,同时在响应启动子的改造和突变方面,可采用理性设计来取代随机突变构建文库。从单一的响应启动子调控向多级调控的生物传感器模块乃至扩大到细胞全局调控都将是未来响应启动子的研究重点。

综上所述,响应启动子的开发及应用仍然面临许多挑战和瓶颈,但在未来必将成为研究热点,这不仅可推动绿色生物制造产业的发展,更可为我国的绿色、环保、可持续发展做出不可替代的贡献。