ICP-MS法测定富马酸替诺福韦二吡呋酯中元素杂质含量

2023-12-11邹巧根

生物加工过程 2023年6期

高盼,邹巧根

(1.南京工业大学生物与制药工程学院,江苏南京 211800;2.南京工业大学药学院,江苏南京 211800)

乙型肝炎病毒(HBV)是一个世界性的公众健康难题,据统计,全世界至少有数亿人曾感染过HBV[1]。每年有3亿多人为HBV慢性感染者,我国是HBV感染的高流行区[1]。慢性乙型肝炎(CHB)感染者前期大多无明显症状,直到发病后期才会出现。临床治疗CHB目前以采取干扰素、核苷酸类似物为主[2-3]。富马酸替诺福韦二吡呋酯作为一种新型的核苷酸逆转录酶抑制剂[4-5],由美国Cilead公司开发,可有效对抗多种病毒,被用于治疗病毒感染疾病,也是治疗CHB的首选药物之一。

元素杂质可能存在于原料、辅料或制剂中。主要来源于药物合成中催化剂的残留;或是由药品生产制备过程中引入;或辅料中存在的,由生产设备、或是由容器密闭系统引入。某些元素杂质不仅会对药品的稳定性、保质期产生不利影响,还可能因为潜在的毒性,从而引发副反应[6]。根据文献[7]的规定:口服给药途径的风险应评估1类元素杂质砷(As)、镉(Cd)、铅(Pb)、汞(Hg)和2A类元素杂质钒(V)、钴(Co)和镍(Ni)在药品中的可能性。富马酸替诺福韦二吡呋酯颗粒在制剂生产过程中,使用了加工助剂聚乙烯,而钛(Ti)系催化剂,作为目前应用最广泛的聚烯烃催化剂,在反应过程中易存在残留的风险[8]。

电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)对比电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)具有灵敏度高、检出限低及分析速度快等优点[9]。参照中、美药典中相关要求和准则[10-11],笔者建立了湿法消解,即ICP-MS法测定富马酸替诺福韦二吡呋酯中元素杂质含量的方法,以期为产品质量的控制提供参考依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Agilent 7800电感耦合等离子体质谱仪,美国安捷伦公司;Digiblock EHD36电热消解仪,北京市莱伯泰科公司;MilliDirectQ纯水仪,美国密理博公司;XS105十万分之一电子分析天平,美国梅特勒公司。

1.2 试剂

HNO3(批号:C0210606,UP级),德国CNW Technologies Gmb21公司;试验用水均为超纯水;富马酸替诺福韦二吡呋酯颗粒(批号:190122121、190124121、190126121、190310121、190312121和190314121),南京市海纳医药科技股份有限公司;容量瓶均为聚4-甲基-1-戊烯(PMP)材质。

As、Cd、Pb、Hg、Co、V和Ni单元素标准溶液各100 μg/mL,Ti单元素标准溶液10 000 μg/mL,国家有色金属及电子材料分析测试中心;锂(Li)、钪(Sc)、锗(Ge)、铑(Rh)、铟(In)、铽(Tb)、镥(Lu)和铋(Bi)多元素内标溶液各100 μg/mL,美国安捷伦科技有限公司。

2 方法

2.1 仪器的工作条件

射频功率(RF)1 550 W,等离子体流量15 L/min,采样深度10.0 mm,雾化室温度2 ℃,蠕动泵速0.1 r/s,载气流量1.07 L/min,He碰撞模式,He流量5.0 mL/min,测量方式为跳峰采样模式,每峰采样点为3,重复次数6次,采集质量数为47Ti、51V、59Co、60Ni、75As、111Cd、201Hg和208Pb,积分时间为0.999 s。

2.2 内标溶液的配制

精密量取内标溶液0.1 mL,置于100 mL容量瓶中,用HNO3与水混合溶液(体积比为1∶99)稀释至刻度,摇匀,制成质量浓度为0.1 μg/mL的内标储备液。

2.3 标准曲线溶液的配制

分别精密量取As、Cd、Pb、Hg、Co、V、Ni和Ti单元素标准溶液0.30、0.10、0.10、0.60、1.00、2.00、4.00和2.60 mL,置于100 mL量瓶中,用HNO3与水混合溶液(体积比为1∶99)稀释至刻度,摇匀,制成质量浓度分别为0.3、0.1、0.1、0.6、1.0、2.0、4.0和260.0 μg/mL的混合元素储备液。

分别精密量取0.025、0.075、0.125、0.200、0.250、0.300和0.375 mL上述混合元素储备液,置于25 mL量瓶中,用HNO3与水混合溶液(体积比为1∶99)稀释至刻度,摇匀,作为10%、30%、50%、80%、100%、120%及150%标准曲线溶液。以同样方法制备空白试剂。

2.4 供试品溶液的配制

取富马酸替诺福韦二吡呋酯颗粒50 mg,精密称定后,置于聚四氟乙烯消解罐中,移入浓HNO35 mL,混匀,置于电热消解仪上,130 ℃消解30 min,消解后,于130 ℃赶酸30 min,取出放冷,将消解液全部转至25 mL量瓶中,用纯水洗涤消解罐2～3次,洗液并入量瓶中,用纯水定容至刻度,摇匀后即得。以同样方法制备空白试剂。

3 结果与讨论

3.1 线性实验的测定结果

取空白试剂及标准曲线溶液,依次进样测定,以待测元素强度与内标强度比(Y)为纵坐标,质量浓度(X)为横坐标,进行线性回归,得到线性回归方程及相关系数,结果见表1。由表1可知:8种元素杂质线性关系良好,相关系数(r)>0.999 1。

表1 线性实验结果

3.2 LOD、LOQ的实验测定结果

连续进样11次,以空白试剂响应值的3.3倍标准差对应的浓度作为LOD,以空白试剂响应值的10倍标准差对应的浓度作为LOQ。根据式(1)和(2)计算LOD和LOQ。

LOD=3.3δ/S

(1)

LOQ=10δ/S

(2)

式中:δ为连续测定空白样品中各元素杂质的每秒计数(CPS)比率的标准偏差;S为标准曲线的斜率。

3.3 专属性实验的测定结果

按2.3及2.4节方法,分别制备空白试剂、空白样品、混合元素对照品(100%限度浓度水平)及样品+对照品(100%限度浓度水平),测定各元素的CPS与内标元素的CPS的比(以下简称CPS比率),结果见表2和图1～4。由表2和图1～4可知:溶剂和样品经稀释后,均不干扰各元素的检测,表明该方法的专属性良好。

图1 空白试剂的专属性测定结果

图2 对照品的专属性测定结果

图3 空白样品的专属性测定结果

图4 样品+对照品的专属性测定结果

表2 专属性实验测定结果 (CPS比率)

3.4 重复性实验的测定结果

取6份富马酸替诺福韦二吡呋酯颗粒适量,精密称定后,准确加入混合元素对照品0.250 mL,按2.4节方法制备样品,按2.1节仪器参数测定样品,要求每个元素浓度的相对标准偏差(RSD)不超过20%。结果发现:As、Cd、Pb、Hg、Co、V、Ni和Ti元素的RSD分别为2.0%、1.5%、1.4%、3.7%、0.3%、0.3%、0.4%和0.6%,结果均不高于3.7%,表明该方法的重复性良好。

3.5 中间精密度实验的测定结果

由不同分析员在不同时间,按2.4节方法制备6份样品,上机检测后,考察随机变动因素对实验数据的影响,要求每个元素浓度的RSD均不超过25%。结果发现:As、Cd、Pb、Hg、Co、V、Ni和Ti元素的RSD分别为1.7%、1.4%、4.5%、2.9%、0.6%、0.4%、0.7%和0.6%,结果均不高于2.9%,表明该方法的中间精密度良好。

3.6 准确度实验的测定结果

取9份富马酸替诺福韦二吡呋酯颗粒适量,精密称定后,分为3组,每组分别准确加入0.075、0.250和0.375 mL混合元素的对照品,作为低、中和高浓度水平样品,按2.4节方法制备样品,按2.1节仪器参数测定样品,要求每个元素的平均回收率均在70%～130%,每个元素浓度的RSD不超过15%,结果见表3。由表3可知:8个元素3个水平的平均回收率均在89.1%～100.4%,RSD均不高于4.8%,表明该方法的准确度良好。

表3 加样回收率实验测定结果(n=9)

3.7 耐用性实验的测定结果

按2.1节仪器工作参数进样,测定100%限度浓度水平的供试品,要求每个元素浓度RSD应不高于20%。结果发现:As、Cd、Pb、Hg、Co、V、Ni和Ti元素的RSD分别为1.1%、2.0%、0.5%、4.8%、0.3%、0.4%、0.4%和1.1%,表明该方法的耐用性良好。

3.8 稳定性实验的测定结果

按2.1节仪器工作参数进样,测定100%限度浓度水平的加标供试品溶液,于室温条件下分别在0、1、2、4、6和8 h时间点进样测定,要求各元素CPS比率RSD应不高于20%。结果发现:As、Cd、Pb、Hg、Co、V、Ni和Ti各元素CPS比率的RSD分别为1.9%、1.0%、0.9%、2.1%、0.4%、0.5%、0.4%和1.3%,表明供试品在室温8 h下基本稳定。

3.9 样品的测定结果

按2.4节方法制备供试品,按2.1节仪器参数检测6批次样品中8种元素的杂质含量,结果见表4。由表4可知:各批次样品元素杂质含量均低于样品限度。

表4 样品测定结果

表5 元素PDE和J的转换

3.10 元素杂质限度的测定结果

富马酸替诺福韦二吡呋酯颗粒每日最大摄入量为300 mg,1类元素杂质(As、Cd、Pb和Hg)和2A类元素杂质(V、Co和Ni)参考文献[7]中元素限度要求,药品的每日摄入量不超过10 g的以10 g计。按文献[12]中的分类,并没有将Ti元素归类,因此,将其归为第三类金属,每日允许最大暴露量(PDE)按13 000 μg计,按式(3)计算各元素杂质限度浓度。

(3)

3.11 内标元素的选择结果

内标是添加到空白样品和未知样品中的一种或几种元素,必须是一类容易测量的独特元素,正确使用内标可以校正信号的干扰[13]。内标元素的选择通常有2种标准:①通过质量(最接近分析物的质量);②基于元素电离势能(IP)的匹配。本实验结合上述2种标准,选择45Sc作为Ti、V、Co和Ni的内标,72Ge作为As的内标,103Rh作为Cd的内标,209Bi作为Hg、Pb的内标,使用T型混合三通在线引入内标。

3.12 前处理条件的选择结果

对于非难溶样品消解可以选择湿法消解,而富马酸替诺福韦二吡呋酯颗粒在水中呈微溶状态,因此,选择湿法消解并采用环绕加热方式,在常压状态下可达到快速、稳定的样品处理效果。

对HNO3的用量、消解温度和消解时长等条件进行考察,在考察每个单一条件时,固定其他条件不变。HNO3用量选择2、3、4和5 mL,消解温度选择110、120、130和140 ℃,消解时长选择20、25、30和35 min。结果表明:在使用HNO3为5 mL,消解温度为130 ℃,消解时长为30 min时,样品能够完全消解,溶液呈现完全澄清状态。