加入脾氨肽口服液培养的人肺癌细胞系A549增殖凋亡及线粒体膜电位、活性氧簇表达观察

石颖慧，王铁山，王煊，卢涛

1 北京中医药大学生命科学学院，北京 102488；2 北京中医药大学北京中医药研究院；3 北京中医药大学第三附属医院呼吸科

WHO 国际癌症研究机构（IARC）的GLOBOCAN项目分析报告［1］表明，2020 年全球新增肺癌患者约220 万例，占全部新发恶性肿瘤的11.4%。肺癌也是我国最常见的恶性肿瘤之一［2］。肺癌的治疗方法分为外科治疗、放射治疗和药物治疗，药物治疗包括化学疗法、分子靶向治疗和免疫治疗等［3］。寻找高效安全的肺癌治疗药物是世界范围内的研究热点。多肽类药物可能通过抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡发挥直接抗肿瘤作用，也可通过增强和激发机体对肿瘤细胞的免疫应答、抑制肿瘤血管生成等发挥间接抗肿瘤作用［4］。研究［5］发现，线虫中分离的Mere15 可能通过提高人肺腺癌细胞活性氧簇（ROS）、抑制癌细胞的线粒体膜电位，促进癌细胞凋亡。脾氨肽口服液是一种免疫调节剂，主要是从健康牛脾脏中提取的多肽氨基酸和多肽核苷酸混合物，目前主要用于慢性肝炎和过敏性鼻炎的治疗中［6］。研究［7-8］发现，脾氨肽口服液中的四肽活力成分塔夫素可以通过提高巨噬细胞吞噬作用，发挥抗感染、抗肿瘤作用。脾氨肽口服液对肺癌细胞的增殖、凋亡迁移的影响及其可能作用机制，目前相关研究较少。2023年1—5月，我们观察了脾氨肽口服液对人肺癌细胞系A549增殖凋亡迁移的影响，并进一步探讨脾氨肽口服液的可能作用机制，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 A549 细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。脾氨肽口服液（北京第一生物化学药业有限公司，国药准字：H10950310，规格为10 mL：10 mg 多肽；0.1 mg 核苷酸），磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清（FBS）和DMEM培养基、青-链霉素（P/S）溶液和胰蛋白酶购自美国Gibco，细胞增殖-毒性检测试剂盒Cell counting Kit-8CCK-8、JC-1 线粒体膜电位荧光探针及DCFH-DA ROS 荧光探针购自北京兰博利德，Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡双染试剂盒购自美国BD。CO2培养箱购自美国NUAIRE，高速离心机购自美国Thermo，冷冻干燥机购自德国CHRIST，酶标仪购自美国BioTek，InCucyte S3 长时间动态活细胞成像及功能分析系统购自美国Essen Bioscience，流式细胞分析仪LSRFortessa SORP购自美国BD。

1.2 A549 细胞分组及脾氨肽口服液给予方法 取对数生长期A549细胞，在含10%胎牛血清和1%青-链霉素溶液的DEME 培养基中培养，置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养，每2 天换液一次，待细胞融合度达到90%时，胰蛋白酶消化后传代备用。脾氨肽口服液指导用量10 mL/天，即多肽浓度1.0 mg/mL，本研究将其设为中剂量浓度，0.5 倍浓度为低剂量浓度（0.5 mg/mL），2 倍为高剂量浓度（2 mg/mL）。将细胞分为四组，1、2、3 组分别在含10%胎牛血清的DMEM 培养基中加入0.5、1.0 及2.0 mg/mL 脾氨肽口服液，4组不做任何处理。

1.3 各组细胞细胞增殖情况观察 培养24 h 时采用CCK-8 法检测各组细胞活力。取各组细胞，加入CCK-8 试剂后培养1 h，使用酶标仪测量各组细胞波长450 nm处的光密度OD值，根据OD值计算各组细胞活力。细胞活力=［A（加药孔OD 值）-A（空白孔OD 值）］/［A（对照孔OD 值）-A（空白孔OD 值）］。干预后即刻（培养0 h）将各组细胞置于IncuCyte S3活细胞动态成像与分析仪器（可对活细胞进行长时程动态监测）中观察各组细胞的增殖情况。每3 h拍照记录1 次，连续监测36 h，由InCucyte 内置算法利用拍摄图片测算细胞汇合度（衡量细胞数量的变化，代表细胞增殖情况）。以培养0 h时细胞汇合度为基准进行归一化，测算各组培养3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 h 时的细胞汇合度。实验重复测算3 次，取平均值。

1.4 各组细胞迁移情况观察 培养0 h时取各组细胞，立刻放入InCucyte S3 长时间动态活细胞成像及功能分析系统，每2 h 拍照记录1 次，连续拍照36 h。由InCucyte 内置算法利用拍摄图片计算相对划痕区域密度（某一个时间点划痕面积占初始划痕面积百分比，代表细胞迁移能力）。以培养0 h 时细胞相对划痕区域密度为基准进行归一化，测算各组培养2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h时各组细胞相对划痕区域密度。实验重复测算3 次，取平均值。

1.5 各组细胞凋亡情况观察 采用流式细胞术。培养48 h 时取各组细胞，用不含EDTA 的0.25%胰蛋白酶对细胞进行消化，400 g 离心5 min，弃去上清液，加入300 μL Binding Buffer 重悬细胞并收集培养上清中的细胞。加入5 μL 的Annexin V-FITC，避光室温孵育15 min，在上机前5 min 再加入5 μL 的PI进行染色，使用流式细胞仪测算各组细胞凋亡率。实验重复测算3次，取平均值。

1.6 各组细胞线粒体膜电位检测 培养24 h 时取各组细胞，600 g离心5 min后弃上清，加入0.25%的胰蛋白酶消化下孔板上的细胞，400 g 离心5 min 后弃上清。使用JC-1 线粒体膜电位荧光探针检测线粒体膜电位，0.5 mL 的JC-1 工作液重悬细胞，37 ℃孵育15 min，400 g 离心5 min 后弃上清，PBS 洗涤2次，加入500 μL 的PBS 重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测，选择525 nm 激发，PE 通道检测以及490 nm 激发，FITC 通道检测分析测算线粒体膜电位。实验重复测算3次，取平均值。

1.7 各组细胞ROS 检测 培养24 h 时取各组细胞，0.25%的胰蛋白酶消化，400 g 离心5 min，用无血清培养液将DCFH-DA 稀释至终浓度为10 μmol/L，每个细胞样品加入1 mL 稀释好的DCFH-DA 工作液重悬细胞，于细胞培养箱内孵育30 min。待孵育完成后用无血清培养基洗涤细胞2次，使用流式细胞仪测算DCFH-DA 的荧光值（代表细胞ROS相对表达量）。实验重复测算3次，取平均值。

1.8 统计学方法 采用SPSS 26.0 统计软件进行数据处理。正态性检验采用Shapiro-Wilk 检验，符合正态分布的计量资料以-x± s 表示，组间比较用独立样本t 检验或方差分析（ANOVA），进一步两两比较用SNK-q法。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞增殖情况比较 培养24 h 时1、2、3、4 组细胞的细胞活力分别为80.62% ± 5.30%、49.10% ± 10.03%、39.03% ± 6.37%、100.00% ±6.17%。与4组比较，培养24 h时1、2、3组细胞的细胞活力低（P均＜0.05），随脾氨肽口服液浓度上升，细胞的细胞活力逐渐下降，且呈剂量依赖性（F=91.659，P＜0.05）。

培养3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 h 时1 组细胞汇合度分别为1.01 ± 0.02、1.11 ± 0.02、1.22 ±0.02、1.32 ± 0.03、1.42 ± 0.02、1.53 ± 0.04、1.64 ± 0.04、1.73 ± 0.04、1.84 ± 0.06、1.94 ±0.06，培养3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 h 时2 组细胞汇合度分别为1.01 ± 0.03、1.11 ± 0.03、1.22 ± 0.05、1.31 ± 0.04、1.39 ± 0.04、1.46 ±0.04、1.53 ± 0.07、1.59 ± 0.08、1.64 ± 0.08、1.67 ± 0.11，培养3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 h时3组细胞汇合度分别为1.01 ± 0.01、1.05 ± 0.01、1.08 ± 0.02、1.1 ± 0.02、1.1 ± 0.02、1.1 ± 0.02、1.05 ± 0.05、0.95 ± 0.15、0.89 ± 0.17、0.87 ±0.13，培养3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 h 时4 组细胞汇合度分别为1.09 ± 0.00、1.19 ± 0.01、1.30 ± 0.02、1.41 ± 0.02、1.52 ± 0.03、1.63 ±0.04、1.73 ± 0.03、1.84 ± 0.05、1.91 ± 0.07、1.98 ± 0.12。与4 组比较，各时间点2、3 组细胞的细胞汇合度低（P均＜0.05）。随脾氨肽口服液浓度上升，培养24 h时细胞的细胞汇合度逐渐降低，呈剂量依赖性（F= 76.110，P＜0.05）。

2.2 各组细胞迁移情况比较 培养2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h 时1 组细胞相对划痕区域密度分别为8.51 ± 4.54、9.36 ± 4.51、10.32 ± 4.15、11.6 ± 3.76、12.14 ± 3.40、13.03 ±3.57、13.85 ± 3.65、14.65 ± 3.55、15.22 ± 3.46、15.81 ± 3.26、16.72 ± 3.03、17.53 ± 2.93、18.84 ±3.08、19.92 ± 3.23、27.23 ± 4.60，培养2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h 时2 组细胞相对划痕区域密度分别为9.71 ± 4.05、11.22 ±4.07、12.25 ± 3.78、13.47 ± 3.84、15.04 ± 4.11、17.05 ± 4.06、19.19 ± 4.37、21.74 ± 4.70、23.82 ±5.00、26.22 ± 5.42、28.78 ± 5.67、31.49 ± 5.79、34.1 ± 6.08、36.6 ± 6.70、40.81 ± 7.71，培养2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h 时3 组细胞相对划痕区域密度分别为14.54 ± 4.65、15.84 ± 4.60、16.88 ± 4.25、18.2 ± 3.94、19.98 ±4.13、20.99 ± 3.56、23.07 ± 3.60、25.36 ± 3.30、27.76 ± 2.84、30.18 ± 3.13、32.69 ± 3.09、35.64 ±3.03、38.52 ± 3.35、41.22 ± 3.51、46.15 ± 4.83，培养2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h时4组细胞相对划痕区域密度分别为18.91 ± 2.74、20.39 ± 2.42、21.66 ± 2.41、23.05 ± 1.74、25.01 ±1.89、27.44 ± 1.11、29.95 ± 1.65、33.03 ± 1.94、35.71 ± 2.40、38.74 ± 2.92、41.97 ± 2.60、44.70 ±2.78、47.59 ± 3.10、51.18 ± 3.34、56.28 ± 2.64。

与4组比较，各培养时间1、2、3组细胞相对划痕区域密度小（P均＜0.05），随脾氨肽口服液浓度上升，培养36 h 时细胞相对划痕区域密度逐渐降低（F=76.110，P＜0.05）。

2.3 各组细胞凋亡率比较 培养48 h 时1、2、3、4组细胞的细胞凋亡率分别为12.08% ± 1.56%、50.07% ± 1.64%、71.03% ± 2.75%、3.82% ±0.49%，与4 组比较，培养48 h 时1、2、3 组细胞的细胞凋亡率高（P均＜0.05）。随脾氨肽口服液浓度上升，培养48 h时细胞的细胞凋亡率逐渐升高，呈剂量依赖性（P均＜0.05）。

2.4 各组细胞线粒体膜电位比较 培养24 h 时1、2、3、4 组细胞的线粒体膜电位分别为0.79 ±0.18、0.70 ± 0.24、0.65 ± 0.11、1.11 ± 0.06，与4组比较，培养24 h 时1、2、3 组细胞的线粒体膜电位低（P均＜0.05）。随脾氨肽口服液浓度上升，培养24 h时细胞的线粒体膜电位逐渐下降，呈剂量依赖性（P均＜0.05）。

2.5 各组细胞ROS 相对表达量比较 培养24 h时1、2、3、4 组细胞的ROS 相对表达量分别为5 541.67 ± 390.69、6 758.50 ± 235.87、13 534.00 ±710.99、5 458.33 ± 605.87，与4 组比较，培养24 h时2、3 组细胞的ROS 相对表达量高（P均＜0.05）。与2 组比较，培养24 h 时3 组细胞ROS 相对表达量高（P＜0.05）。

3 讨论

肺癌的发病是一个复杂的过程［9］，目前肺癌疗法的总体治疗效果均不佳［3］。抗癌肽是目前在发展中的抗癌药物的一种类型，很多抗癌肽已经进入临床阶段甚至已经获批上市［10］。提取自牛脾脏的多肽具有多种免疫活力，不仅可以缓解化疗引起的免疫抑制［11］、改善小鼠经环磷酰胺诱导的造血功能损伤［12］还可以可以通过ROS 促进肝癌细胞的凋亡［13］。同样主要成分是提取自牛脾脏的多肽类药物，脾氨肽口服液也因其抗癌活力受到了关注。有研究发现而脾氨肽口服液不仅可以改善乳腺癌患者的预后还可以和含铂药物联合治疗结直肠癌［14］。但目前国内外对脾氨肽口服液抑制肺癌的研究甚少，结合多肽类药物多通过促进肿瘤细胞凋亡的方式，本研究通过检测A549细胞的活力、凋亡以及迁移能力探究脾氨肽口服液抗肺癌的活力，并通过检测JC-1 以及细胞内ROS 的变化，评价脾氨肽口服液对肺癌细胞氧化应激水平的影响，进一步解释其抗癌作用的机制。

CCK-8 试剂常被用来测定细胞的活力、细胞增殖、细胞毒性等，在450 nm 波长处测定的吸光度越高，则细胞活力越强。从CCK-8 实验可发现脾氨肽口服液可以抑制人肺癌上皮细胞A549的活力，并且随着脾氨肽口服液给药浓度的升高，细胞的活力下降的更加明显，这也初步说明了脾氨肽口服液具有一定的抗肺癌作用。

为进一步证实脾氨肽口服液对肺癌的抑制作用，使用InCucyte S3对给药后A549细胞增殖情况进行了实时的检测，发现在给予脾氨肽口服液处理后的30 h内A549细胞的细胞汇合度明显下降，这代表着A549细胞的增殖受到了抑制，并且随着剂量的增加，抑制的趋势更加明显，说明脾氨肽口服液可以抑制人肺癌上皮细胞A549 细胞的增殖。此结果说明脾氨肽口服液可以抑制人肺癌上皮细胞A549 细胞的增殖，也进一步证实脾氨肽口服液确实有抗癌活力。

恶性的肿瘤细胞具有经淋巴道、血管或者体腔从原发部位到达机体的其他部位继续生长的特点，因此在评价药物对肿瘤细胞的作用时还会评价药物对肿瘤细胞迁移能力的影响。划痕实验是评价细胞迁移能力的一种方式，通过InCucyte S3 对脾氨肽口服液处理的A549 细胞相对划痕区域密度进行监测与分析，发现脾氨肽口服液处理组A549细胞的相对划痕区域密度明显低于正常培养组，且呈现出剂量依赖性。这表明发现脾氨肽口服液可以抑制A549细胞的迁移，进一步说明脾氨肽口服液不仅抑制了肺癌细胞的活力，还可以抑制肺癌细胞的转移，在治疗肺癌中可以起到一定的作用。

综合以上的活力实验、增殖实验和划痕实验的结果可以得出结论：脾氨肽口服液可以抑制人肺癌细胞A549 细胞的活力、增殖并降低其迁移能力，表明脾氨肽口服液有抑制肿瘤细胞发展的能力，能够在肺癌治疗中起到一定的作用。但其作用机制尚不明确，因此，在接下来的实验中进一步对其抑癌作用的原理和机制进行探究。

抗肿瘤药物的作用方式主要有促进肿瘤细胞凋亡、促进细胞坏死、抑制癌细胞DNA 合成等方式。大多数抗癌药物是通过凋亡途径抑制癌症细胞的生长，结合多肽类药物多通过促进肿瘤细胞凋亡的方式抑制癌症，推测脾氨肽口服液可能通过凋亡途径实现对肿瘤细胞的抑制。随着细胞的凋亡，细胞质膜内部小叶上的磷脂酰丝酸会外翻到外部小叶，暴露在细胞外部，使用膜连蛋白（Annexin V）的荧光耦连物和活细胞非渗透染料PI 双染对外翻的磷脂酰丝酸检测。发现脾氨肽口服液处理24 h后磷脂酰丝酸外翻的A549 细胞数量增多，且呈现浓度依赖，这说明脾氨肽口服液可以促进A549 细胞的凋亡。细胞的凋亡是一个高度受控的复杂过程，是多个信号通路共同参与的结果，无法仅通过一种实验方式对细胞凋亡进行全面的检测，需要对脾氨肽口服液促进A549细胞凋亡的途径进行进一步探索。

细胞凋亡的途径分为内在途径和外在途径，其内在途径主要与线粒体相关，也被称为线粒体途径。另一个细胞凋亡的典型特征就是线粒体活力受损。相较于磷脂酰丝酸的外翻，线粒体膜电位的改变是细胞凋亡的早期事件。进一步使用阳离子染料JC-1 对线粒体膜电位的变化进行了检测，在线粒体中JC-1 会表现出电位依赖性的积累，当JC-1 染色后检测到的红色/绿色荧光强度比降低时，提示细胞内线粒体功能下降，线粒体功能与细胞氧化应激密切相关。通过对脾氨肽口服液处理24 h 后的A549 细胞线粒体膜电位进行检测，发现脾氨肽口服液可以促进A549细胞线粒体膜电位的去极化，一方面证实脾氨肽口服液促进了人肺癌上皮细胞A549的凋亡，另一方面也说明其促肿瘤细胞凋亡的机制可能与氧化应激相关。

ROS 的过量积累会引起细胞的氧化应激，从而导致细胞损伤、凋亡甚至坏死。ROS 主要来源于线粒体，其在线粒体中的产生主要是通过细胞呼吸链产生的，它是细胞凋亡的一个早期事件。细胞内的ROS 和线粒体之间的关系是一个正反馈，当细胞凋亡时细胞内的线粒体会释放ROS，而环境中过高的ROS又会促使细胞凋亡［15］。有研究［16］发现从线虫中分离出的多肽可以升高细胞内的ROS 水平，破坏线粒体膜电位，诱导人红白血病K526细胞凋亡。假设脾氨肽口服液可能也是通过提高细胞内ROS 的水平促进线粒体膜电位去极化，进一步导致肺癌细胞凋亡，检测细胞内ROS水平。DCFH-DA的荧光值与细胞内ROS 的水平呈正比，脾氨肽口服液培养24 h后A549 细胞DCFH-DA 的荧光值升高了，说明其促进了A549 细胞内ROS 的释放，并且随着药物浓度的增大，细胞内ROS 升高的水平也随之升高。证实了脾氨肽口服液是通过促进细胞内ROS 水平的升高进一步破坏线粒体膜电位并实现使肺癌细胞凋亡的。

综上所述，通过观察脾氨肽口服液对人肺癌细胞系A549增殖、凋亡、迁移的影响，证实脾氨肽口服液可以抑制A549细胞的活力，进一步研究表明脾氨肽口服液是通过ROS 相关的线粒体途径来诱导人肺癌细胞A549细胞的凋亡，抑制A549细胞的活力、增殖及迁移，发挥抗肺癌作用。