全氟烷基类化合物对卵巢的毒性作用及其机制研究进展
2023-12-11吕咏敏胡晓洁尹小瑞张苏云
吕咏敏,胡晓洁,尹小瑞,张苏云
南京医科大学附属南京医院妇科,南京 210006
环境内分泌干扰物(EDCs)又称环境激素、内分泌活性化合物、内分泌干扰化合物,是会干扰有机体激素的合成及功能的外源性化学物质。全氟烷基类化合物(PFASs)是EDCs 的的一种,目前广泛用于各种工业、农业和商业化学物品中。PFASs 的种类众多,主要有全氟辛酸酯(PFOA)、全氟壬酸酯(PFNA)、全氟辛烷磺酸酯(PFOS)和全氟己烷磺酸酯(PFHxS)等。PFASs 由碳和氟原子构成,其中的氟原子半衰期较长,导致PFASs降解时间较长,可在自然环境和生物样品中持久存在。人主要是通过摄入被污染的水、食物和灰尘间接摄入PFASs。目前人血清里可以普遍检测到PFOA、PFNA、PFOS 及PFHxS 等。PFASs 对人类生殖功能的影响是目前的研究热点。卵巢作为女性生殖器官,能产生卵子并且分泌类固醇类激素,具有生殖和内分泌功能。女性出生时卵巢内已有足够数量的始基卵泡,青春期部分卵泡会在性激素的调控下发育为初级卵泡、次级卵泡和窦卵泡等,经过募集卵泡、选择优势卵泡后排卵。EDCs可以通过影响卵泡发育、性激素合成影响卵巢的生殖和内分泌功能,导致更年期提前、卵巢早衰和不孕等疾病。国内外已有较多关于PFASs对卵巢毒性作用的相关报道,现从卵子发生、卵泡发育及卵巢类固醇激素合成过程等方面将PFASs对卵巢的毒性作用及其机制进行综述如下。
1 PFASs对卵巢的毒性作用
PFASs 对卵巢的毒性作用主要表现在延迟月经初潮时间、导致月经周期紊乱、抑制卵巢类固醇激素合成、导致卵巢衰老、多囊卵巢综合征(PCOS)及子宫内膜异位症等方面。
1.1 PFASs 可导致月经初潮延迟 女性平均月经初潮年龄一般为13岁左右,若较平均值延长2~2.5年仍无青春期发育体征出现被称为月经初潮延迟。月经初潮阶段的子宫对EDCs 十分敏感,性激素水平决定月经初潮的时间,初潮时间的延迟可能与日后生理疾病的发生、不良妊娠结局的出现以及年老后心血管疾病的增加有关。目前国内外就PFASs水平与月经初潮早晚的相关性研究并没有得到共识。有研究称,PFASs 的暴露与月经初潮时间的早晚并无明确的相关性[1]。也有一项通过对2931 例8~18岁女孩进行的横向研究发现,血清中PFOA 和PFOS的浓度与初潮的年龄有较大的关系,浓度最高的四分位数组与最低四分位数组相比较,PFOA 和PFOS分别造成了初潮时间延迟130、138 天[2]。一个丹麦的出生队列在2008~2009 年对267 例20 岁左右的女性进行了随访,发现与PFOA 浓度较低的参考组相比,体内PFOA 浓度较高的女性其月经初潮年龄会推迟5.3个月,而PFOS 的暴露水平并没有发现与月经初潮的年龄相关[3]。一项英国随机对照试验[1]发现,实验组为218 例初潮年龄<11.5 岁的女孩,对照组为230 例初潮年龄≥11.5 岁女孩,结果发现,初潮年龄的早晚与接触PFOSA、 EtFOSAA、MeFOSAA、 PFOS、PFOA、PFHxS及 PFNA等物质无关。
1.2 PFASs 导致月经周期紊乱 月经周期的主要特征包括其规律性、周期长度和月经量。无论是动物模型还是临床相关性分析结果均发现,PFASs 暴露会影响正常月经周期的建立。据Lyngsø 等[4]报道,在三个国家(格陵兰岛、波兰和乌克兰)的1623例育龄期妇女体内,PFOA 的暴露水平与较长的月经周期(周期长度≥32 天)之间存在统计学上的明显相关性,而对PFOS 暴露水平的分析中并没有发现其与月经周期的相关性。另有一项对950 例中国妇女的横断面分析显示,PFOA、PFOS、PFNA 和PFHxS暴露水平的增高与育龄期女性月经周期的紊乱和月经周期的延长有关。PFOA、PFNA 和PFHxS 浓度较高的女性更有可能出现月经量过少的情况[5]。
从丹麦国家出生队列(DNBC)研究[6]结果发现,在随机纳入1240例孕妇的临床资料后,发现PFOA、PFOS 与月经不调有关,接触PFOA 和PFOS 较多的妇女出现月经紊乱的概率会升高。LUM 等[7]使用了来自密歇根州和德克萨斯州的501 对夫妇的数据,这些夫妇在为怀孕而停止避孕时加入了一个前瞻性队列--生育力和环境纵向调查(LIFE)研究。与PFDA血清浓度最低的三分位数相比,第二个三分位数的女性月经周期延长3%,但PFOA 浓度最高的三分位数女性的月经周期比PFOA 最低的三分位数的女性短2%,PFOS并没有观察到与月经周期的相关性。当然,也有研究发现,母亲接触PFOA 和 PFOS 与其月经周期的长短或其后代的卵巢卵泡数量之间并没有明确的关联[3]。由于研究设计差异和潜在的地理暴露差异,很难解释PFASs 水平升高是否会导致月经不调,或者月经不调是否会导致血清PFASs 水平升高,因为月经也是女性PFAS 代谢的关键途径之一。
1.3 PFASs 可抑制卵巢类固醇激素的合成 血清PFOS 水平与女性血清性激素水平相关,PFASs 可能通过上调或下调负责胆固醇转运和卵巢类固醇生成的蛋白质的表达来干扰卵巢的正常生理功能。ZHANG 等[8]研究发现,PFOS 暴露可能会降低卵巢早衰患者血清中雌二醇及催乳素的水平,同时升高卵泡刺激素的水平。MCCOY 等[9]研究发现,在接受体外受精的女性中,PFOS的浓度与血清雌二醇的水平之间存在负相关。一项纳入25 957例成年女性的队列研究[10]结果发现,PFOS暴露水平与女性血清雌二醇水平降低相关。另有研究[11]结果发现,PFOS暴露导致25~35 岁、健康、正常月经周期的未经产女性血清雌二醇和孕酮水平明显降低。HEFFERNAN等[12]研究发现,在没有多囊卵巢综合征的健康女性中,PFOS的暴露会显著降低游离雄激素指数FAI。
研究[8-12]认为,PFOA 暴露可能与血清性激素水平变化无关。2011~2012 年全国健康和营养调查的研究[13]结果发现,PFOS、PFOA 暴露与12~80 岁女性的血清睾酮水平无关。另有研究[3]发现,PFOS和PFOA 的子宫内暴露不会影响其后代的血清总睾酮、性激素结合球蛋白、FAI、脱氢表雄酮、雌二醇、卵泡刺激素、黄体生成素及抗苗勒管激素的水平。但也有体外研究[14]报道,低剂量的PFOA 可以通过加速脂肪酸的代谢来刺激睾丸中类固醇激素的生成。
HEFFERNAN 等[12]在多囊卵巢综合征的病例组和对照组中发现,PFNA 的暴露与雄烯二酮的水平均呈正相关,PFHxS 的暴露和健康女性血清总睾酮水平呈正相关。ZHANG 等[8]发现,PFHxS 暴露会升高原发性卵巢功能不全患者的卵泡刺激素水平,同时降低患者体内的雌二醇水平。也有研究[9,13]认为,PFNA、PFHxS暴露与女性血清性激素水平没有明显相关性。与成人相比,青少年对PFASs 的易感性更强。一项针对12~17 岁青少年的研究[15]结果发现,PFOA、PFUnDA 和PFOS 的血清浓度分别与性激素结合球蛋白、卵泡刺激素以及睾酮的血清水平呈负相关,但在年轻成年人中并没有发现这些相关性。同样,对于参加C8 健康项目的6~9 岁女孩来说,血清中的睾酮水平也与PFOS 的暴露呈负相关[16]。有关PFASs的暴露与性激素的水平的相关性还需要更多的研究来证实。
1.4 PFASs 可导致卵巢衰老、PCOS 及子宫内膜异位症 早发性卵巢功能不全(POI) 是一种由多病因引起的女性在40 岁前卵巢功能的减退,临床表现为闭经或者月经稀发4~6 个月,间隔>4 周连续两次FSH>25 IU/L。POI 会导致不孕、骨质疏松、泌尿生殖器官萎缩、心血管疾病、认知功能减退及抑郁等。直链PFOS、支链PFOS、直链全氟辛烷磺酸和PFNA及其他PFASs 类型都可能与卵巢的提前衰老、自然绝经年龄的提前有关。
我们前期研究[8]共检测了120 例POI 患者、120与之匹配的健康对照体检者血清中十种常见PFASs的水平,结果发现,与对照组相比,POI 患者血清中PFOA、PFOS 和PFHxS 的水平显著增高,且随着PFOA、PFOS 和PFHxS 暴露水平的增高,POI 的发病率也显著增高。但本研究并未发现POI发病风险增加与PFDA、PFNA、PFBS、PFDoA、PFUnDA和PFHpA暴露的相关性。另有一项国家级健康和营养调查研究[10]发现,PFOA 和PFOS 的暴露与较早的绝经年龄呈明显的正相关趋势。有学者[17]发现,相比于健康体检者,全子宫切除术后患者体内PFOA、PFOS、PFHxS 和PFNA 水平升高。但也有部分研究结论不一致,DHINGRA 等[18]研究发现,PFOA 暴露水平与自然绝经时间并没有显著的关联。
PCOS 是青春期及育龄期女性常见的内分泌紊乱症候群,该疾病的病因尚未完全了解,可能和遗传和环境因素有关。一项对180 例PCOS 的不孕患者和180 例健康对照者的研究[19]显示,血清中PFDoA的浓度与PCOS 不孕症发生的风险存在显著的正相关。而PFBS、PFHpA、PFHxS、PFOA、PFOS、 PFNA、PFDA 以及PFUnDA 与PCOS 的发生并无明显关联性。一项2003~2006 年的临床研究[20]数据显示,子宫内膜异位症女性血清PFOA、 PFNA 和PFOS 的平均水平均高于健康女性。目前,只有少数研究[21]表明,PFASs的暴露会增加女性罹患卵巢癌的风险,但该研究未观察到显著相关性,且纳入病例数量较少。
2 PFASs的卵巢毒性作用机制
PFASs 可能从卵子发生、卵泡发育及卵巢类固醇激素合成过程等方面发挥毒性作用。PFASs可能通过激活过氧化物酶体增殖物受体 (PPAR) 信号通路、中断卵母细胞和颗粒细胞胞间通讯以及诱导产生氧化应激等途径干扰卵子的发生,PFOS可通过抑制类固醇生成急性调节蛋白mRNA 表达、抑制KiSS1 转移抑制因子 (Kiss1) 和 KISS1 受体(Kiss1r) 的表达,影响卵泡发育。PFASs 可通过调控负责胆固醇转运和卵巢类固醇生成蛋白质的表达,抑制卵巢类固醇激素的合成。
2.1 PFASs 影响卵子发生的机制 卵子发生是指从胚胎发育早期开始,经过胚胎期、出生、直至性成熟才完成的由原始生殖细胞形成到卵原细胞,再由卵原细胞形成成熟卵细胞的过程。PFASs 可以通过影响卵子的发生干扰早期卵泡的生成。其潜在作用机制可能包括激活过氧化物酶体增殖物受体(PPAR) 信号通路、中断卵母细胞和颗粒细胞胞间通讯以及诱导产生氧化应激等。
PPAR是核激素受体家族,可能参与了PFASs致生殖毒性的过程中。已知的三个PPAR家族成员α、β/δ 和γ 都有在卵巢中表达。PPAR-α 和PPAR-β/δ亚型主要在卵巢的膜和基质细胞中表达,而PPAR-γ亚型在颗粒细胞和黄体中高度表达。PPAR-α 可以通过各种靶基因的反式激活来调节脂质代谢和能量稳态,PFASs可以通过与PPAR-α相互作用从而引发代谢障碍[22]。而PFASs 激活PPAR-γ 后能够抑制参与卵母细胞减数分裂的基因(如内皮素-1 和一氧化氮合酶)的合成,这意味着它在雌性卵子发生中发挥了作用[23]。
一项研究[24]报告称,用10 μg/mL 的PFNA 体外处理牛卵母细胞22h 会破坏卵母细胞成熟期间的发育能力。卵母细胞存活率的下降可能是由于PPAR-α 的过表达引起卵巢脂肪代谢紊乱进而引起脂肪堆积所造成的。另一项研究[25]也证实了卵细胞质中过多的脂肪与卵母细胞发育能力受损和卵母细胞存活率降低相关。PFASs 可以结合并激活PPAR受体,干扰卵子的发生,进而影响卵巢的相关功能。
除了对PPAR信号通路的影响外,PFASs还可能干扰卵泡的细胞间通信。卵泡内部是无血管的,颗粒细胞之间以及颗粒细胞和卵母细胞之间的细胞-细胞通信依赖于低分子营养物质、信号分子和废物通过缝隙连接的双向转移。当在体外用含PFOS 的水溶液处理44 小时后,猪卵巢中活卵母细胞的数量和成熟卵母细胞的百分比明显减少[26]。同样,体外暴露于PFOS7 天的胎鼠卵母细胞会出现更多的凋亡和坏死[27]。这些结果可能归因于PFOS 干扰了卵母细胞和颗粒细胞之间的缝隙连接通信所造成的。
PFASs 还可能通过促进活性氧簇(ROS)的产生,增加DNA 损伤以及降低总抗氧化能力从而诱导氧化应激。小鼠每日暴露于PFOA 会抑制卵巢中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性,促进ROS 的生成,增加p53 和Bax 蛋白 (在凋亡细胞死亡中很重要)的表达[27]。另一项研究同样说明,将大鼠暴露于PFOA,会明显增加ROS 的产生,干扰线粒体呼吸链中复合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的活性并导致卵母细胞的凋亡[28]。
2.2 PFASs 影响卵泡发育的机制 研究[29]发现,PFASs可以在卵泡发育的几个不同阶段影响啮齿动物卵泡的形成和/或功能。暴露于PFOS4 个月的成年雌性小鼠排卵前的卵泡数量会出现明显减少,闭锁卵泡数量明显增加。此外,小鼠血清中雌二醇和孕酮水平出现降低,可能是由于PFOS 降低了类固醇生成急性调节蛋白 (Star) 的 mRNA 水平的表达,PFOS 对 Star 蛋白的这种影响被认为是卵泡成熟和排卵障碍的可能原因。CHEN 等[27]也报告了类似的发现,PFOS 导致妊娠小鼠卵巢中黄体数量明显减少,并且卵巢中 Star mRNA 水平的表达也出现了降低。
新生雌性大鼠暴露于PFOS 后,其卵巢原始卵泡、生长卵泡和黄体的数量显著减少[28]。PFOS可能通过抑制KiSS1 、Kiss1r 表达及下丘脑中kisspeptin神经元的活性发挥卵巢的毒性作用。kisspeptin 信号通路参与卵巢周期的调节及人类青春期的启动。PFOA 、PFOS 可能是通过破坏下丘脑kisspeptin 神经元信号干扰卵泡发育。
妊娠小鼠经过全氟丁烷磺酸盐 (PFBS)处理后,产下的雌性后代会表现出卵巢功能受损的许多症状:卵巢大小和重量降低、卵泡数量减少(所有阶段)、阴道开放延迟、发情时间延迟、发情期延长和血清雌二醇水平的降低。此外,PFBS 还会破坏与低甲状腺素血症一致的甲状腺激素的合成,表现为妊娠第20 天及雌性后代中甲状腺激素三碘甲状腺原氨酸(T3) 和甲状腺素(T4) 的血清水平的降低[30]。越来越多的动物和人体研究[31]结果发现,甲状腺激素的水平会随着 PFASs 浓度的增加而减少。甲状腺激素在卵巢卵泡发育和成熟以及其他生理功能的维持中起着不可或缺的作用。甲状腺激素不足可能通过影响卵泡液抑制素、雌激素和其他细胞因子的产生来影响卵泡的正常发育。
2.3 PFASs 影响卵巢类固醇激素合成的机制 卵巢的另一个主要功能是产生和分泌性类固醇激素。卵巢类固醇激素的生成依赖于卵泡膜细胞和颗粒细胞的协调作用以及下丘脑-垂体-性腺轴的调控。甾体激素的生物合成需要多种羟化酶及芳香化酶的作用,在LH 的刺激下,卵泡膜细胞内的胆固醇经P450胆固醇侧链裂解酶 (CYP11A1) 的催化转化为孕烯醇酮。孕烯醇酮在3β 羟基类固醇脱氢酶 (3β-HSD) 的作用下转化为前体雄激素脱氢表雄酮(DHEA),其中涉及酶 17α 羟化酶、20-脱氨酶(CYP17A1) 或孕酮的产生。然后,孕酮和 DHEA 分别通过 CYP17A1 或 3β-HSD 转化为雄激素A4。卵泡膜细胞中产生的最终雄激素类固醇是睾酮 T。A4和T 是卵泡膜细胞类固醇生成的雄激素的终产物,可以跨过卵泡基底层迁移到颗粒细胞中。在排卵前的卵泡中,颗粒细胞增殖并分化,产生越来越多的17β-雌二醇。卵泡膜细胞含有LH 受体 (LHRs),LH在与其受体结合后,刺激卵泡膜细胞衍生基因的转录,这些基因编码胆固醇转化为雄激素所需的酶。颗粒细胞含有FSH 受体 (FSHRs),与FSH 结合后会刺激颗粒细胞衍生基因的转录,这些基因编码雄激素向雌激素转化所必需的酶。
PFASs 可以通过上调或下调负责胆固醇转运和卵巢类固醇生成的蛋白质的表达来干扰内分泌系统的调节。摄入全氟十二烷酸(PFDoA)的雌性大鼠,其青春期前卵巢黄体生成素/绒毛膜促性腺激素受体、Star、Cyp11a1 和 Hsd17b3 的 mRNA 表达会显著下降,导致雌二醇的合成明显减少[32]。成年雌性大鼠长期暴露于PFOS 可能会通过减少组蛋白的乙酰化水平来抑制Star 的表达从而降低雌二醇的生物合成[33]。游离的猪卵巢颗粒细胞经过PFOS或PFOA 处理后,细胞内LH/FSH 调控的孕酮、雌二醇和雄烯二酮的分泌会受到明显抑制[33]。鉴于PFASs 的暴露不会改变卵巢中的底物(胆固醇)的供应,Star mRNA 水平的降低可能是胆固醇转运减少的原因,而胆固醇是卵巢类固醇生成的必要前体。
PFASs 具有一定的弱雌激素活性,并且与其他弱雌激素一样,在与雌二醇结合后,这些化合物也会产生一定的抗雌激素作用。下丘脑中的GnRH 神经元不表达ER,雌二醇和T 主要通过弓状核 (ARC)和前腹室周围核 (AVPV) 中的kisspeptin 神经纤维向GnRH 神经元发送反射信号。雌二醇和T 可以下调ARC 核团但是上调AVPV 核团中kisspeptin 的表达[34]。有研究发现,成年雌性小鼠经过PFOS 处理后,其AVPV 神经元中kisspeptin 的表达受到抑制,小鼠出现动情间期延长和排卵障碍[35]。我们课题组前期研究[36]也发现PFHxS 的慢性染毒可以通过抑制小鼠下丘脑ARC 和AVPV 核团中kisspeptin 的表达,影响性腺轴的功能,抑制LH 脉冲峰的释放,导致卵泡发育和排卵障碍。另有研究[37]报道了PFOA影响动情周期及排卵功能的可能机制与下丘脑中kisspeptin 神经元活动的改变有关。因此,PFASs 可能通过抑制ER 介导的AVPV 核团中kisspeptin 的表达造成排卵障碍或生育力的下降。
综上所述,PFASs 作为EDCs 的一种,可能导致月经初潮时间的延迟、月经周期的紊乱、类固醇激素水平的异常、卵巢功能低下、PCOS、子宫内膜异位症等。PFASs 可能从卵子发生、卵泡发育及卵巢类固醇激素合成过程等方面发挥卵巢毒性作用。PFASs可能通过激活PPAR 信号通路、中断卵母细胞和颗粒细胞胞间通讯以及诱导产生氧化应激等途径干扰卵子的发生,PFOS可通过抑制类固醇生成急性调节蛋白mRNA 表达、抑制Kiss1 及Kiss1r 表达,影响卵泡发育。PFASs可通过调控负责胆固醇转运和卵巢类固醇生成蛋白质的表达,抑制卵巢类固醇激素的合成。PFASs 各亚型之间、PFASs 与其他EDCs 之间是否存在协同卵巢毒性作用,尚需进一步研究探索。