含透明质酸、聚谷氨酸钠、乙酰壳糖胺护肤复合物的保湿性能及屏障修复功能研究

任姝静 王志华 张晓鸥 郭学平 刘卫 王玉玲

[摘要]目的：研究含透明质酸（Hyaluronic acid，HA）、聚谷氨酸钠（Sodium polyglutamate，PGA）、乙酰壳糖胺（Acetyl glucosamine，NAG）的护肤复合物（熙衡因）对皮肤屏障的影响。方法：采用角质形成细胞评估熙衡因的细胞毒性，在此基础上通过3D皮肤模型考察其对吡咯烷酮羧酸（Pyrrolidone carboxylic acid，PCA）、丝聚蛋白（Filaggrin，FLG）、兜甲蛋白（Loricrin，LOR）、转谷氨酰胺酶1（Transglutaminase 1，TGM 1）和神经酰胺的影响，并通过人体临床实验，于使用前、使用后1、2、4周分别测试含有2%熙衡因的乳液对经皮水分流失（Trans epidermal water loss，TEWL）的影响。结果：MTT实验结果表明熙衡因在10 mg/ml浓度范围内对角质形成细胞无明显细胞毒性，选定1.25 mg/ml进行测试，该浓度下其可以显著增加PCA、FLG、LOR、TGM1和神经酰胺含量（P＜0.05），并可以上调神经酰胺/蛋白（P＜0.05）和长碳链神经酰胺占比；人体临床功效测试显示，相比空白对照组，含有2%熙衡因的实验组在使用样品后1、2、4周可以显著降低TEWL（P＜0.01）。結论：熙衡因可以通过提高PCA、FLG、LOR、TGM1和神经酰胺含量，减少TEWL，发挥保湿和修复屏障功能。

[关键词]透明质酸；屏障修复；天然保湿因子；丝聚蛋白；兜甲蛋白；转谷氨酰胺酶；神经酰胺

[中图分类号]R758.2    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2023）11-0071-05

Evaluation of Moisturizing Properties and Influence of Skin Barrier Repair Function of A Cosmetic Material Composed of Hyaluronic Acid，Sodium Polyglutamate，and Acetyl Glucosamine

REN Shujing1，WANG Zhihua1，ZHANG Xiaoou1，GUO Xueping1，LIU Wei2，WANG Yuling1

（1.R&D Center Bloomage Biotechnology Co.，Ltd.，Jinan 250101，Shandong，China; 2.College of Life Science and Technology，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430074，Hubei，China）

Abstract： Objective  To investigate the effect of a cosmetic raw material containing HA， PGA and NAG on the skin barrier. Methods  Keratinocytes were used to evaluate the cytotoxicity， and the effect on PCA， FLG， LOR， TGM1 and ceramide were investigated by a 3D skin model. In order to further verify the barrier repair function， the effect of emulsion containing 2% of the compound material on TEWL was tested before and 1， 2 and 4 weeks after application through clinical trial. Results  MTT results showed that the compound material had no obvious cytotoxicity to keratinocytes within the concentration of 10 mg/ml， and at 1.25 mg/ml， the compound material could not only significantly up-regulate the expression of PCA， FLG， LOR， TGM1 and ceramide （P＜0.05），but also increase the ratio of ceramide to protein （P＜0.05） and the proportion of ceramide with long-chain. The clinical test showed that compared with the control group， the experimental group with 2% of the compound material could significantly reduce TEWL after applying the emulsion for 1 week， 2 weeks and 4 weeks （P＜0.01）. Conclusion  The cosmetic raw material containing HA， PGA and NAG can exert the function of moisturizing and repairing barrier by increasing the content of PCA， FLG， LOR， TGM1 and ceramide， and decreasing TEWL.

Key word： hyaluronic acid; skin barrier repair; natural moisturizing factor; filaggrin; loricrin; transglutaminase 1; ceramide

皮肤是人体最大的器官，具有屏障、体温调节、免疫等多种功能，是人体抵御外界危险因素的第一道防线[1]，其中90%的皮肤屏障功能依靠角质层形成。角质层的“砖墙结构”是皮肤屏障功能的基础，这与皮肤中的LOR、内披蛋白（Involucrin，INV）、FLG和晚期角化包膜蛋白（Latecornified envelope proteins，LCEs）等多种蛋白[2]以及神经酰胺等胞间脂质密切相关[3-4]。皮肤屏障受损将导致皮肤干燥、特应性皮炎、慢性光化性皮炎、银屑病、黄褐斑、痤疮、皮肤鳞状细胞癌等皮肤问题及疾病[5-8]。针对屏障受损皮肤，首先需加强保湿，诸多研究表明，HA不仅具有良好的保湿效果，还表现出优异的屏障修复功效[9]，含有HA的护肤品，已广泛用于多种皮肤病的辅助治疗和敏感性皮肤的修复[1]。基于此，本研究通过细胞、3D皮肤模型体外实验和人体功效测试评估含透明质酸、聚谷氨酸钠、乙酰壳糖胺的护肤复合物对皮肤保湿和屏障功能的影响，为屏障修护相关护肤品开发提供参考。

1  材料和方法

1.1 测试系统：角质形成细胞（人源包皮角质形成细胞，博溪生物）、3D表皮皮肤模型（EpiKutis）。

1.2 材料：熙衡因（华熙生物科技股份有限公司，成分含量见表1）、EpiGrowth培养液（博溪生物）、KC2500培养液（博溪生物）、PBS（博士德）、MTT（Sigma）、甲醇（Fisher Scientific）、氯仿（国药）、乙腈（Fisher Scientific）、异丙醇（Fisher Scientific）、DMSO（Sigma）、FLG抗体（Abcam）、LOR抗体（Abcam）、TGM1抗体（Abcam）、WY14643（Sigma）。

1.3 仪器设备：CO2培养箱（Thermo，150i）、超净工作台（苏州安泰，SW-CJ-1F）、经皮水分散失测试仪（Courage+Khazaka，德国）、荧光显微镜（Leica，DM2500）、高效液相色譜仪（安捷伦，1260）、酶标仪（BioTek，Epoch）。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞毒性实验

1.4.1.1 实验分组：细胞实验设置调零组、溶剂对照组、阳性对照组与样品组。

1.4.1.2 细胞接种：将细胞按8×103个/孔的密度接种至96孔板，培养箱（37℃、5% CO2）中孵育过夜。

1.4.1.3 给药：待96孔板中细胞铺板率达到40%～60%时进行给药。溶剂对照组每孔加入200μl培养液；阳性对照组每孔加入200μl含10%DMSO的培养液；样品组每孔加入200μl含有相应浓度（0.0781%、0.1563%、0.3125%、0.625%、1.25%、2.5%、5.0%、10.0%）样品的培养液；调零组无细胞接种，仅加入200μl细胞培养液。给药完成后将96孔板放置在培养箱中培养24 h。

1.4.1.4 细胞孵育培养24 h后，弃掉上清，加入MTT工作液（0.5 mg/ml），于37℃避光孵育4 h，孵育结束后，弃掉上清，每孔加150 ?l DMSO，使用酶标仪读取490 nm处的OD（Optical density，OD）值，并计算细胞相对活力。细胞相

1.4.2 屏障修复功能评估

1.4.2.1 阳性对照组（WY14643）工作液配制：取10 ?l WY14643母液（30 mmol/L）溶于6 ml培养液中。

1.4.2.2 模型给药：根据测试方案（见表2），将模型转移到6孔板中（提前添加0.9 ml EpiGrowth培养液），样品组添加相应浓度的工作液，置于CO2培养箱中孵育24 h，孵育结束后，用无菌PBS溶液清洗模型表面残留的受试物，用无菌棉签拭去模型内、外残留液体。

1.4.2.3 HPLC测试：将模型环切至1.5 ml EP管中，每管加入500 μl 0.2 mg/ml的蛋白激酶K，置于50℃水浴1 h，待角质层脱落后，每管加入250 μl甲醇，超声30 min，然后离心10 min（14 000 rpm），60℃水浴蒸干甲醇后，于4℃温度下保存，用于HPLC测试。

1.4.2.4 免疫荧光测试：用4%的多聚甲醛对测试模型进行固定处理，24 h后，将模型环切取下，使用免疫荧光检测，在显微镜下拍照观察并分析LOR、FLG及TGM1含量。

1.4.3 神经酰胺含量测试

1.4.3.1 神经酰胺含量测试实验方案：根据测试方案（见表3），将模型转移到6孔板中（提前添加3.7 ml模型培养液），PC组和样品组液下添加相应浓度的工作液，置于培养箱（37℃、5% CO2）中孵育24 h。

1.4.3.2 脂质样本的提取：模型切半，放入6孔板内，每孔中加入1 ml胰酶，放入37℃培养箱中孵育30 min，将角质层上粘稠物剥离下来，用纸将角质层上的水分吸干，放入玻璃管中，每个玻璃管中加入1 ml氯仿甲醇混合物（氯仿∶甲醇=1∶1），冰浴超声30 min，取上清液至进样瓶中，吹干。

1.4.3.3 脂质样本的上机前处理：氮吹干的样品瓶中加160 μl乙腈异丙醇混合溶液（乙腈∶异丙醇=1∶1），再加入20 μl脂肪酸内标溶液和20 μl神经酰胺C12内标溶液[游离脂肪酸内标为FFA（19∶0），内标溶液浓度为200 μg/ml，神经酰胺内标溶液浓度100 μg/ml，内标溶剂为比例1∶1的乙腈、异丙醇溶液]，超声10 min，震摇溶解30 min，转移到样品离心管中，12 000 rpm离心10 min，取上层100 μl于250 μl内衬管中，使用质谱联用仪检测脂质含量。

1.4.4 人体临床测试：选择30名20～65周岁健康志愿者，采用半脸对照法，左右半脸分别使用实验组（含2%熙衡因）和空白组（BC组，空白乳液），测试周期为4周，每天早晚各使用一次测试样品，分别于产品使用前和使用后1、2、4周测试TEWL，评估样品功效。

1.5 统计学分析：应用GraphPad Prism作图，结果表示为（x?±s），行t检验，统计分析均为双尾。P＜0.05为差异具有统计学意义，P＜0.01为差异具有显著统计学意义。

2  结果

2.1 熙衡因对细胞活性的影响：依据《GB/T 16886.5-2017医疗器械生物学评价第5部分体外细胞毒性试验》，在测试范围（10 mg/ml）内，经熙衡因处理的角质形成细胞的细胞活力均大于70%，证明其对角质形成细胞无明显毒性，安全性较高，浓度为1.25 mg/ml时，细胞形态学结果与空白样品相比无明显异常，因此选择该浓度进行测试。不同浓度的熙衡因对角质形成细胞的细胞毒性MTT检测结果见表4，经不同浓度样品处理的细胞形态学图片见图1。

2.2 屏障功能测试

2.2.1 NMF测试结果：PCA是皮肤中天然存在的物质，具有较强吸湿能力，是天然保湿因子的重要组成。按表2中方案对3D皮肤模型进行处理，给药后观测表皮皮肤模型的PCA含量，与BC组相比，经1.25 mg/ml熙衡因处理后的皮肤模型，其PCA含量显著上升，差异有显著统计学意义（P＜0.01），证明该浓度下熙衡因可以显著促进PCA的生成。见图2。

2.2.2 屏障相关蛋白测试结果：3D皮肤模型经过给药处理后进行免疫荧光检测，根据积分光密度（Integrated optical density，IOD）评估各蛋白含量，与空白组（BC）相比，经1.25 mg/ml熙衡因处理的3D表皮皮肤模型荧光强度明显增强；结果显示，与BC组相比，测试组3D表皮皮肤模型中LOR、FLG、TGM1蛋白相对IOD平均值分别由1.00上升至1.20、1.14、1.16，均显著性提高（P＜0.05），表明熙衡因在该浓度下可以显著促进LOR、FLG及TGM1的表达。见图3。

2.2.3 神经酰胺测试结果：對3D表皮皮肤模型进行给药处理，检测角质层中的脂质成分神经酰胺的含量及组成变化。结果显示，空白组模型中的神经酰胺总量为94.64 ng，神经酰胺/蛋白比值为0.15，经过1.25 mg/ml的熙衡因处理后，其神经酰胺总量提高至124.25 ng（P＜0.05），神经酰胺/蛋白则上升至0.23（P＜0.01），差异均具有统计学意义；此外，上述浓度熙衡因还能够影响神经酰胺组成，与空白组相比，样品组皮肤模型角质层中C34、C36、C38、C39、C63、C64、C65、C66、C67、C68、C69、C71等碳链长度的神经酰胺相对占比升高，表明其可以提高长链神经酰胺的含量，见图4。

2.3 临床测试：结果显示，志愿者使用样品后，实验组的TEWL显著低于空白对照组（见图5）。与初始值相比，当使用样品1周后，实验组TEWL由100 g/（m2·h）下降至79.33 g/（m2·h），4周后下降至88.31 g/（m2·h），而空白组第2周和第4周TEWL则大于初始值，表明含有2%熙衡因的测试样品可以减少皮肤的TEWL，具有良好的保湿和修复效果。见表5。

3  讨论

正常的皮肤屏障是多种重要生理功能的基础，皮肤屏障受损是特应性皮炎、慢性光化性皮炎、银屑病、黄褐斑、痤疮、皮肤鳞状细胞癌等多种皮肤病发生的重要诱导因素，此类皮肤疾病常常伴随着干燥、脱屑等症状[10]，因此针对此类问题，需在增强皮肤保湿的前提下，对皮肤屏障进行修复。

章婧[11]研究发现银屑病皮损中角化包膜的主要成分LOR的表达明显减少，王银娟[12]发现黄褐斑患者皮损处FLG、LOR、INV等表达较正常人群降低，角化包膜结构不全，证明了角化包膜及LOR等蛋白在皮肤屏障中的重要作用。角化包膜是LOR、INV、FLG等多种蛋白在TGM的作用下发生广泛交联形成的高度柔韧结构，标志着角质细胞的产生，是发挥屏障功能的基础。

另有研究发现，神经酰胺的含量和长度对皮肤屏障也至关重要，有文献报道，去除角质层细胞间的神经酰胺后，皮肤屏障功能丧失；痤疮患者角质层中神经酰胺含量下降，成分改变[13]，导致角质细胞间双层脂质膜的缺陷。基于以上研究，可通过调控NMF、LOR、FLG、TGM以及神经酰胺来增强皮肤屏障功能。

实验结果显示，1.25 mg/ml的熙衡因能够显著提高天然保湿因子PCA的含量，使LOR、FLG以及TGM1等皮肤屏障相关蛋白的含量显著增加，同时可以提高3D皮肤模型角质层中神经酰胺总含量及神经酰胺/蛋白数值，并且能上调长碳链神经酰胺的占比；人体临床测试表明使用含有2%熙衡因的样品，能够显著降低TEWL，表明该原料可以通过提高NMF、LOR、FLG和神经酰胺的含量，以及促进TGM１的表达，来发挥增强皮肤屏障的作用。

推测是因为其中含有的透明质酸是人体皮肤表皮和真皮的主要基质成分之一，其分子结构中的羟基、羧基及其他极性基团能与水分子形成氢键而结合大量水分，具有良好的保湿效果，而小分子透明质酸能够进入皮肤[14]，促进表皮角质形成细胞的增殖和迁移，进而促进NMF、LOR、FLG等皮肤屏障相关因子的形成；聚谷氨酸钠可以抑制透明质酸酶活性[15]，在起到保湿效果的同时延长透明质酸的作用时间；乙酰壳糖胺作为透明质酸合成的单体，可以促进皮肤内透明质酸合成[16]，进而起到促进NMF、屏障相关蛋白及脂质合成的作用。

综上，本研究对护肤复合物熙衡因的保湿及修复皮肤屏障的效果进行了评价，并对其机理进行初步探索，为含透明质酸、聚谷氨酸钠和乙酰壳糖胺的复合物在保湿和皮肤屏障修复领域的应用提供了理论依据。

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[收稿日期]2022-08-16

本文引用格式：任姝静，王志华，张晓鸥，等.含透明质酸、聚谷氨酸钠、乙酰壳糖胺护肤复合物的保湿性能及屏障修复功能研究[J].中国美容医学，2023，32（11）：71-75.