新疆不同产地苦豆子种子中生物碱含量测定与分析

安佳琳，李勇，董川，刘兵兵，双少敏*

（1.山西大学 化学化工学院，山西 太原 030006；2.山西大学 环境科学研究所，山西 太原 030006；3.山西大学 黄土高原研究所，山西 太原 030006）

0 引言

苦豆子（Sophora alopecuroidesL.）系豆科槐属多年生草本植物，俗名苦豆根、苦草槐等［1-2］，多生长于沙质土地和盐碱地，广泛分布于内蒙古、宁夏、新疆、甘肃、青海、西藏等地区［3］，其全草、根及种子皆可入药。苦豆子含有生物碱、黄酮、甾体、多糖等多种活性成分［4］，研究表明，苦豆子具有抗癌［5］、抗炎［6-7］、镇痛［8］、抗糖［9-10］、抗菌［11］、抗氧化［12-13］等众多药理活性。

生物碱是苦豆子种子的主要活性成分之一［14］，其存在与苦豆子的生物活性存在众多关联，研究发现，苦豆子生物碱在抗炎［15］、抗肿瘤［16-17］、抗菌［18-19］等方面有着重要的药理活性，因此采用生物碱成分作为含量测定的指标。此外，对于以生物碱含量为指标进行的质量分析而言，聚类分析和主成分分析可将不同种地生物碱含量特征加以归类，体现不同种地的差异性，从而区分苦豆子药材的产地来源。

目前市场对苦豆子需求量巨大，远远满足不了国内外苦豆子加工企业原料缺口。除新疆以野生为主外，宁夏、内蒙古等地已开始规模化发展模式。因此控制新疆苦豆子药材的质量以及新疆苦豆子药材的规模化生产已成为当务之急，而有关新疆不同产地苦豆子质量评价的文献目前还没有报道。为了更加系统地研究新疆不同产地苦豆子的品质，山西大学黄土高原研究所刘兵兵副教授于2019 年7 月-2019 年10 月，行程8万多公里，在新疆苦豆子广泛分布地区，采集野生苦豆子标本2000 多份，为优秀种质的筛选提供了丰富的资源。本实验对新疆23 批不同产地的苦豆子质量进行了系统的分析和评价，同时对不同产地样品中生物碱成分含量进行聚类分析和主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）分析，旨在为评价新疆不同产地苦豆子的质量提供科学依据，为筛选出优良的苦豆子产地和实施中药材生产质量管理规范（Good Agricultural Practice，GAP）奠定重要基础。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

金雀花碱（质量百分含量≥99.90%）、槐定碱（质量百分含量≥96.97%）、氧化苦参碱（质量百分含量≥98.76%）、苦参碱（质量百分含量≥98.69%）、烟碱（质量百分含量≥99.17%）均购于成都曼斯特生物科技有限公司，N-甲基野靛碱（质量百分含量≥98.00%）购于四川省维克奇生物科技有限公司，分析纯二氯甲烷、氨水、甲醇、色谱纯甲醇、醋酸铵、氢氧化钾、磷酸二氢钾均购于天津市大茂化学试剂厂，分析纯乙腈购于斯瑞斯化工科技有限公司，水为实验室制备的二次水。

苦豆子样品采集于新疆，样品信息为：S1：托里（图克村）、S2：沙湾（安集海镇）、S3：富蕴（恰库尔图）、S4：博乐（86 团）、S5：伊宁（萨木于孜乡）、S6：哈巴河（铁热克提乡阿克加尔村）、S7：霍城县城、S8：布尔津（冲乎尔乡布拉乃村）、S9：额敏县城、S10：达坂城柴窝堡、S11：天池、S12：玛纳斯、S13：新和县、S14：和硕县塔哈斯、S15：阿克陶县、S16：皮山县、S17：泽普、S18：若羌、S19：巴楚、S20：且末县、S21：若羌拉克勒克乐村、S22：阿克苏六团三连、S23：喀什上阿图乡，S1-S13 位于北疆，S14-S23 位于南疆。

1.2 仪器

Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国Agilent公司），METTLER TOLEDO/FE20 酸度计（上海梅特勒-托利多国际贸易有限公司），Heidolph/G3 型真空旋转蒸发仪（德国Heidolph 公司），Neofuge 15 型高速离心机（上海力申科学仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液的制备

准确称取对照品槐定碱0.023 g、金雀花碱0.014 g、N-甲基野靛碱0.012 g、氧化苦参碱0.013 g、苦参碱0.018 g、烟碱0.014 g，置于25 mL 容量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度线，制备成储备液，再取12.5 mL 储备液置于25 mL 的容量瓶中，加入甲醇定容至刻度线，配制成浓度为槐定碱0.46 mg·mL-1、金雀花碱0.28 mg·mL-1、N-甲基野靛碱0.24 mg·mL-1、氧化苦参碱0.26 mg·mL-1、苦参碱0.36 mg·mL-1、烟碱0.28 mg·mL-1的混合对照品溶液，以备后续使用。

1.3.2 供试品溶液的制备

准确称取苦豆子种子粉末0.5 g，置于50 mL离心管中，依次加入20 mL 二氯甲烷和0.2 mL氨水，用封口膜密封，超声30 min，用布氏漏斗将其豆渣过滤，滤液用真空旋转蒸发仪浓缩后称重，再用20 mL 甲醇溶剂溶解，作为供试品溶液以备后续使用。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：10 mmol·L-1醋酸铵（氨水调pH9）（A）-含有20 mmol·L-1醋酸铵的甲醇-乙腈1∶2（B），梯度洗脱（0～20 min，5%B；20～39 min，5%～7%B；39～40 min，7%～15%B；40～60 min，15%～23%B；60～80 min，23%～32%B）；检测波长210 nm；柱温37 ℃，流速1.0 mL·min-1，进样量50 μL。

1.4 方法学考察

1.4.1 专属性考察

在1.3.3 色谱条件下，对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液分别进样。

1.4.2 线性关系考察

分别精密量取“1.3.1”项下所制备的混合对照品溶液50 μL、250 μL、500 μL、1 mL、1.25 mL、1.5 mL、1.75 mL，以甲醇定容至10 mL，即得7 个浓度的对照品溶液。按照“1.3.3”项下的色谱条件进样50 μL，以峰面积为Y轴，以各种生物碱的质量浓度为X轴进行线性回归，得到每种生物碱的线性回归方程、r值以及线性范围。

1.4.3 精密度试验

精密吸取2.5 mL、1 mL、0.5 mL “1.3.2”项下所制备的供试品溶液，以甲醇定容至10 mL，即得高、中、低三个浓度的供试品溶液，进行日内精密度（n= 6）和日间精密度（n= 6）试验。

1.4.4 稳定性试验

取某一产地的苦豆子种子样品，按照“1.3.2”项下的方法制备供试品溶液，在室温下分别放置0、2、4、6、8、10、12、24 h 后进样，进样量为50 μL，记录6 种生物碱的峰面积。

1.4.5 加样回收率试验

取已知生物碱含量的苦豆子种子粉末0.5 g，共18 份。采用实际供试品溶液加标的方式，加入6 种生物碱各成分含量的50%、100%、150%，制备出6 种生物碱的低、中、高加标溶液，在“1.3.3”项的色谱条件下，每次进样50 μL，记录6 种生物碱的峰面积，并计算其回收率。

1.4.6 重复性试验

取同一产地苦豆子种子样品，按照“1.3.2”项下的方法平行制备供试品溶液6 份，在“1.3.3”项的色谱条件下，每次进样50 μL，记录6 种生物碱的峰面积，并计算其含量。

1.5 不同产地样品生物碱含量测定

取23 个产地苦豆子种子粉末，按照“1.3.2”项下的方法制备出苦豆子种子的样品溶液，每个产地平行制作3 份，按照“1.3.3”项下的色谱条件，每次进样50 μL，测定23 个种地苦豆子种子的生物碱含量。

1.6 聚类分析

本研究运用SPSS22.0 软件对23 个产地的苦豆子种子生物碱含量进行系统聚类，聚类方法为组之间的链接法，测量区间为组之间的欧式平方距离。

1.7 主成分分析（PCA）

利用SIMCA-P 14.1 软件对23 个产地苦豆子种子中的生物碱含量进行主成分分析（PCA），将生物碱含量作为变量标识号（Identity document，ID），苦豆子的种地编号作为观察ID，根据种地的地理位置将其分为两组，即南疆组和北疆组进行分析。

2 结果与分析

2.1 专属性考察

混合对照品溶液、样品溶液及阴性样品溶液见图1。图1 表明：在此色谱条件下六种生物碱有较好的分离度，无干扰，样品色谱峰出峰时间与标准品保持一致。

2.2 线性关系考察

以峰面积为Y轴，以各种生物碱的质量浓度为X轴进行线性回归，得到每种生物碱的线性回归方程、r值以及线性范围见表1。结果显示，6 种生物碱线性关系的r值均大于0.999，且N-甲基野靛碱的线性范围下限最小。结果表明，6 种生物碱含量与色谱峰面积呈现出良好的线性关系，且检测器对N-甲基野靛碱有相对较高的灵敏度。

表1 6种生物碱的线性方程、相关系数（r）和线性范围Table 1 Linear equations，correlation coefficients （r） and linear ranges of six kinds of alkaloids

2.3 精密度试验

日内精密度（n= 6）和日间精密度（n= 6）结果见表2，本方法6 种生物碱精密度结果相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值均小于2.0%，表明实验仪器的精密度良好。

表2 6种生物碱的日内精密度和日间精密度Table 2 The relative standard deviation (RSD) (%) of intra-day and inter-day for the six kinds of alkaloids

2.4 稳定性试验

金雀花碱、氧化苦参碱、N-甲基野靛碱、烟碱、槐定碱、苦参碱六种生物碱峰面积的RSD值分别为：1.21%、0.72%、0.77%、1.31%、0.21%、1.37%，结果表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5 重复性试验

金雀花碱、氧化苦参碱、N-甲基野靛碱、烟碱、槐定碱、苦参碱六种生物碱含量的RSD 值分 别 为 0.076%、0.52%、0.52%、1.02%、1.20%、0.81%（n= 6），6 种生物碱含量的RSD 值均小于2.0%，结果表明供试品溶液制备方法的重复性良好。

2.6 加样回收率试验

加样回收率结果见表3，6 种生物碱加样回收率介于97.5%～101.5%，RSD 值均小于2.0%，结果表明本方法的准确性较好。

表3 6种生物碱的加样回收率Table 3 The recoveries of the 6 alkaloids

2.7 不同产地样品生物碱含量测定

不同产地样品生物碱含量结果见表4，结果表明，不同产地苦豆子种子中金雀花碱、氧化苦参碱和槐定碱的含量相对较高，最高达到57.12 mg·g-1、218.69 mg·g-1和97.76 mg·g-1。北疆产地（S1-S13）的苦豆子种子中金雀花碱、槐定碱的含量普遍高于南疆产地（S14-S23），且不同产地苦豆子中氧化苦参碱和苦参碱的含量呈负相关。从 6 种生物碱总量来看，北疆产地苦豆子普遍高于南疆产地苦豆子，北疆苦豆子种子中生物碱含量最高为329.80 mg·g-1，而南疆苦豆子种子中生物碱含量最高为187.09 mg·g-1。

表4 23个种地苦豆子生物碱含量测定（±s，n = 3）Table 4 Determination results of alkaloid content of S.alopecuroides L.in 23 species(±s, n = 3)

表4 23个种地苦豆子生物碱含量测定（±s，n = 3）Table 4 Determination results of alkaloid content of S.alopecuroides L.in 23 species(±s, n = 3)

注：“-”表示生物碱含量较低，仪器未检测到其色谱峰。

种地S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S23金雀花碱/(mg/g)20.37±0.35 47.21±0.31 27.57±0.32 40.48±0.18 45.16±0.10 48.07±0.15 35.85±0.23 36.84±0.33 57.12±0.38 43.25±0.58 31.91±0.47 35.49±0.06 56.23±0.22 36.73±0.34 23.66±0.60-31.56±0.42 0.65±0.27 9.42±0.13 17.09±0.15 16.45±0.15 17.18±0.26 40.50±0.06氧化苦参碱/(mg/g)15.28±0.35 82.48±0.46 55.41±0.59 7.53±0.24 45.43±0.44 123.86±0.26 3.45±0.09 218.69±0.47 12.62±0.56 174.19±0.08 116.16±0.10 157.55±0.47 161.89±0.52 137.23±0.27 10.09±0.13 43.81±0.16 128.26±0.39 20.75±0.44 95.50±0.47 69.95±0.31 9.82±0.41 14.00±0.39 95.78±0.37 N-甲基野靛碱/(mg/g)1.03±0.17 1.75±0.20 1.43±0.16 1.61±0.14 1.33±0.19 2.23±0.07-1.26±0.06 0.52±0.11 1.01±0.16-0.40±0.16 2.19±0.08 1.86±0.05 2.60±0.12 1.19±0.10 0.52±0.13 1.27±0.21 1.25±0.04 0.88±0.08 1.71±0.03 1.08±0.11 1.02±0.06烟碱/(mg/g)-13.27±0.16 8.34±0.07 21.27±0.24 16.52±0.27 10.55±0.22 15.81±0.16 7.12±0.08-13.12±0.18--19.58±0.34--5.94±0.25 4.08±0.13 3.43±0.10 4.08±0.07-3.21±0.03--槐定碱/(mg/g)20.20±0.29 49.26±0.03 43.92±0.26 79.83±0.21 89.25±0.04 49.19±0.15 0.94±0.09 44.20±0.06 62.59±0.10 97.76±0.24 19.25±0.42 25.88±0.74 41.90±0.26 9.69±0.11 11.72±0.15 19.57±0.08-3.09±0.08 20.47±0.18 28.20±0.77 1.01±0.08--苦参碱/(mg/g)0.88±0.09 0.66±0.10 0.43±0.05 0.23±0.03 0.21±0.02 0.24±0.02 1.40±0.10 1.14±0.02 0.32±0.04 0.48±0.03--1.78±0.09 1.59±0.02 1.65±0.02 1.55±0.06 3.89±0.10 0.90±0.09--2.66±0.07--生物碱总量/(mg/g)57.76±0.77 194.63±0.27 137.11±0.79 150.95±0.49 197.89±0.75 234.13±0.36 57.44±0.42 309.24±1.76 133.17±0.23 329.80±0.46 167.32±1.43 219.31±1.11 283.57±0.26 187.09±0.19 49.73±0.67 72.06±0.47 168.31±0.72 30.09±0.53 130.71±0.43 116.11±0.80 34.86±0.47 32.25±0.17 137.30±0.32

2.8 聚类分析

对23 批新疆不同产地的苦豆子药材的生物碱含量与样品号建立矩阵，运用 SPSS22.0软件采用聚类方法为 Between-groups linkage，测量区间为 Squared Euclidean distance，得到苦豆子药材的聚类谱系图（图2）。结果表明，平方欧式距离为20 时，23 个种地的苦豆子样品被分成2 大类，其中S1、S3、S15、S16、S18-S22 为第一大类，包含了南疆种地的70%，S2、S4-S6、S7-S14、S17、S23 为第二大类，包含了北疆种地的约85%。南疆产地和北疆产地基本上可以区分开。

图2 23批新疆不同产地苦豆子聚类分析结果图Fig.2 Dendrogram result of 23 batches of S alopecuroides L.samples from different habitats in Xinjiang

2.9 主成分分析（PCA）

利用 SIMCA-P 14.1 软件对 23 批新疆不同产地的苦豆子药材的生物碱含量进行 PCA分析，将生物碱含量作为变量 ID，苦豆子的种地编号作为观察 ID，得到主成分分析结果如图3。主成分分析结果显示，根据生物碱的含量，23 个苦豆子种地被分成两大类，南疆种地和北疆种地基本分开，此结果与聚类分析结果基本吻合，这两种分析结果的一致性说明23个种地苦豆子的质量较稳定，且分类较为清晰，这为苦豆子质量的综合判断提供了有力的手段。

图3 23批新疆不同产地苦豆子样品主成分分析图Fig.3 Principal component analysis chart of 23 batches of S alopecuroides L.samples from different habitats in Xinjiang

3 结论

本文研究了新疆不同地区23 个产地苦豆子种子中六种生物碱成分的含量差异，并根据结果对药材质量进行分析。结果表明苦豆子种子中金雀花碱、氧化苦参碱、槐定碱含量相对较高，北疆产地的苦豆子中金雀花碱和槐定碱的含量普遍高于南疆产地。且从6 种生物碱总量来看，北疆产地苦豆子普遍高于南疆产地苦豆子，因此可以推测北疆的气候，土壤等条件更适合苦豆子中生物碱的产生。聚类分析与主成分分析结果显示可将23 个种地划分为两大类，南北疆产地基本可以分开，这和生物碱含量数据的结果基本吻合。

在聚类分析结果中，种地S14 可能由于地理位置在天山脚下，与北疆的气候地理相差不大，因而与北疆种地苦豆子种生物碱类成分含量差别较小，种地S1、S3 的苦豆子可能和南疆苦豆子种群分支存在基因交流，因此在生物碱含量方面和南疆苦豆子相似，而聚合在同一支上，种地S17、S23 可能由于气候条件、生态环境与北疆地区相似，因而在生物碱含量方面呈现出和北疆地区苦豆子相似的情况，因而被聚合在一支上。从主成分分析结果来看，23 个种地被分为两类，南北疆产地基本分开，这一结果与聚类分析结果基本吻合，聚类分析和主成分分析结果相互映证，其分析结果的一致性说明23 个种地苦豆子的质量较稳定，且分类较为清晰，这为苦豆子质量的综合判断提供了有力的手段。