尿石素A对高脂饮食老龄小鼠白色脂肪棕色化的影响

刘星宇,李 慧,李 菁,王 莹,赵立升,封纯真

肥胖症是一种以体内脂肪过度沉积和体重超常为特征的慢性代谢性疾病,是引起高血压病、糖尿病、心脑血管疾病、肿瘤等衰老相关疾病的危险因素和病理基础。在过去30多年,世界范围内超重和肥胖患者急剧增多,导致一系列肥胖相关的健康问题[1]。因此,寻找防治肥胖的干预措施迫在眉睫。

尿石素A(urolithin A)是石榴、草莓、树莓及核桃等水果或坚果中的鞣花单宁与鞣花酸经肠道微生物作用产生的活性代谢物[2],具有抗癌[3]、抗炎[4,5]、抗衰老[6]等多种生物学作用。最近有研究发现,尿石素A对肥胖及其相关疾病发挥有益的保护作用[7, 8],但其作用机制尚不十分清楚。促进白色脂肪棕色化是防治肥胖及其相关疾病的重要靶点[9, 10],因此,本研究探讨尿石素A对高脂饮食小鼠白色脂肪棕色化的影响,以期为防治肥胖症提供新药物及新靶点。

1 对象与方法

1.1 材料与试剂 18月龄雄性C57小鼠18只(湖北省实验动物研究中心);稳豪倍优型血糖仪(美国强生);酶标仪(Synergy HT,美国Bio Tek);LabMaster呼吸代谢分析系统(德国TSE);电泳仪(DYY-8C,北京六一仪器厂);凝胶成像分析仪(FlourChem FC12,美国Alpha);血糖试纸(英国LifeScan Europe);BCA(bicinchoninic acid);测定试剂盒(中国博迈德);吐温-80(美国Sigma-Aldrich);游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)试剂盒(南京建成生物工程研宄所);预制胶电泳液(中国索莱宝);PVDF(polyvinylidene fluoride)膜(美国Millipore);脱脂奶粉(美国BD);解偶联蛋白1(uncoupling protein 1,UCP1;货号bs-1925R,稀释比例1∶1000,分子量33 ku,北京博奥森)、过氧化物酶体增殖体激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)抗体(货号bs-4590R,稀释比例1∶1000,分子量57 ku,北京博奥森);过氧化物酶体增殖体激活受体γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator 1α, PGC-1α)抗体(货号sc-518025,稀释比例1∶500,分子量92 ku,美国Santa Cruz);小鼠β-肌动蛋白(β-actin)抗体(货号#3700,稀释比例1∶1000,分子量45 ku,美国CST)。

1.2 实验分组 实验动物在解放军总医院实验动物中心SPF级屏障环境中饲养,温度(25±1)℃,相对湿度(60±5)%,光照时间12 h/d,干燥通风。实验动物均单笼饲养,自由进食、进水。实验动物购回后适应性喂养1周,然后将18只C57小鼠随机分成3组:对照组,高脂饮食组(high fat diet,HFD)和尿石素A干预组(UA)。对照组小鼠仍采用维持饲料喂养,HFD和UA组小鼠给予高脂饲料(60%能量由脂肪供应)喂养12周。期间UA组小鼠按照30 mg/(kg.d)[7]的剂量给予尿石素A灌胃(吐温-80助溶),对照组和HFD组给予等剂量的吐温-80灌胃。

1.3 检测指标 (1)血液学指标检测:实验结束时,小鼠禁食不禁水过夜。剪尾法采血,测定空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG);腹腔静脉采血,测血清中三酰甘油(triglycerides,TG),总胆固醇(total cholesterol,TC),高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)和低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)。试剂盒检测血清中FFA浓度。(2)产热量检测:实验结束前1周,将小鼠放入LabMaster 呼吸代谢分析系统的分析笼内,适应6 h后,记录12 h白天和12 h黑夜的产热量。采样流速为 0.8 L/min, 每30 min采集1次数据。(3)病理学检查:实验结束时,腹腔注射戊巴比妥钠溶液麻醉小鼠,取腹股沟白色脂肪组织常规固定1周,石蜡包埋切片后进行HE染色,显微镜下观察并拍照。(4)qRT-PCR:Trizol 法提取心肌组织总RNA,两步法反转录为cDNA并进行扩增,扩增条件为94 ℃预变性3 min,94 ℃变30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,扩增30个循环,最后72 ℃ 延伸10 min。基因引物由上海英杰公司合成[10]。(5)Western blot:取出冻存的脂肪组织粉碎,加入300 μl 含PMSF的 RIPA裂解液裂匀浆,用移液器将裂解液吸至1.5 ml ep管(冰上操作)中。在4 ℃,12 000 g的条件下离心15 min,吸取上清液迅速转移至新的ep管,此即为提取的总蛋白。取30 μg总蛋白上样后进行电泳,220 nm的条件下转膜2 h,室温封闭2 h,分别滴加特异性一抗(UCP1,PPARγ,PGC-1α与β-actin)封闭过夜,再以辣根过氧化物酶标记的二抗封闭2 h。化学发光剂染色、显影,采用BandScan 5.0软件分析胶片灰度。所有实验至少重复3次。

2 结 果

2.1 尿石素A干预对高脂饮食小鼠体质量及代谢的影响 与对照组相比,HFD组小鼠的体质量、FPG、TG、TC、FFA和LDL显著升高(P<0.05);与HFD组比较,UA组老龄鼠的体质量、TG、FFA和LDL明显降低,差异有统计学意义(P<0.05,表1)。

表1 尿石素A干预对高脂饮食小鼠体质量及代谢的影响

2.2 尿石素A干预对高脂饮食小鼠代谢产热的影响 与对照组比较,HFD组小鼠日间产热量和夜间产热量均显著降低(P<0.05;表2),而尿石素A干预能明显升高老龄鼠的日间和夜间产热量,与HFD组相比差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 尿石素A干预对高脂饮食小鼠体重及代谢的影响

2.3 尿石素A干预对高脂饮食小鼠白色脂肪组织形态的影响 与对照组相比,HFD组小鼠白色脂肪组织细胞体积增大,而尿石素A干预能明显降低高脂饮食老龄鼠白色脂肪细胞的体积(图1)。

2.4 尿石素A干预对HFD组小鼠白色脂肪棕色化基因转录与表达的影响 如图2所示,与对照组相比,HFD组小鼠白色脂肪组织棕色化基因PGC-1α转录表达下调, UCP1、PPARγ、PGC-1α蛋白的表达显著降低(P<0.05),而尿石素A干预显著上调白色脂肪组织棕色化基因UCP1、PPARγ与PGC-1α转录与蛋白表达水平(P<0.05,表3)。

图1 尿石素A干预对高脂饮食小鼠白色脂肪组织形态的影响(HE,×200)

图2 尿石素A干预对高脂饮食小鼠白色脂肪棕色化蛋白表达的影响

表3 尿石素A对高脂饮食小鼠白色脂肪棕色化基因转录与表达的影响

3 讨 论

肥胖症是一种多因素疾病,与遗传、环境、内分泌调节紊乱、炎症、肠道菌群等因素均有关系,其发生机制是能量摄入超过能量消耗。肥胖症治疗的中心环节是减少热量的摄取或增加热量的消耗。既往研究表明,尿石素A具有抗肿瘤、抗炎和抗衰老等多种生物学作用[12-15],而且对肥胖症及其相关疾病发挥有益的保护作用,但其具体作用机制尚不清楚[7, 8]。本研究发现,尿石素A通过促进白色脂肪棕色化来增加能量消耗进而防治肥胖症,但对能量摄入无影响。

哺乳动物的脂肪组织类型主要分为白色脂肪组织和棕色脂肪组织,白色脂肪组织主要的生理功能是以三酰甘油的形式储存能量,而棕色脂肪组织主要的生理功能是以非战栗方式产热。棕色脂肪的代谢产热量巨大,是新生儿在寒冷条件下维持体温的重要方式。但是,成人体内棕色脂肪组织含量很少。在一定条件下,白色脂肪组织可以向棕色脂肪组织转化,亦即白色脂肪棕色化,如何促进白色脂肪棕色化是减重研究的重要方向之一[16]。本研究发现,尿石素A干预能促进肥胖老龄鼠白色脂肪棕色化并降低其体质量,可能的机制如下:(1)白色脂肪细胞胞质内通常可见1个大脂滴,而棕色脂肪细胞胞质内则有诸多小脂滴。尿石素A干预明显减少肥胖小鼠白色脂肪细胞的体积。(2)UCP1、PPARγ与PGC-1α是棕色脂肪细胞分化调控的重要分子[10],UCP1是棕色脂肪细胞线粒体内膜上的解耦联蛋白,当H+顺浓度梯度沿UCP1返回线粒体基质时,使得经线粒体呼吸链电子传递建立的质子跨膜电-化学势能以热能的形式释放出来,而不用于合成ATP。PPARγ是脂肪组织高表达的核受体,与脂肪细胞分化、棕色脂肪组织形成密切相关[17]。既往研究表明,PPARγ激动剂罗格列酮能促进寒冷环境中C57小鼠燃脂产热[18]。PGC-1α在棕色脂肪组织中高表达,在白色脂肪组织中低表达。在白色脂肪组织中过表达PGC-1α可使其获得棕色脂肪组织的某些特征,如线粒体增多、脂肪酸氧化增强等[19]。而且,PGC-1α的代谢产物鸢尾素也能促进白色脂肪的棕色化[20]。本研究发现,尿石素A干预从转录和翻译两个层面促进UCP1、PPARγ与PGC-1α的表达。(3)因老龄鼠比年轻鼠在高脂饮食条件更容易发生肥胖[21],因此本研究以18月龄老龄小鼠为研究对象。尿石素A干预可以减少肥胖老龄鼠的体质量,而且与小鼠的进食与排泄量无关。

综上所述,本研究发现,尿石素A能促进肥胖小鼠白色脂肪棕色化,可能是防治肥胖症的一种有效干预措施。但对于尿石素A促进白色脂肪棕色化的确切作用机制还不十分清楚。既往研究提示,线粒体自噬是维持棕色脂肪组织生理功能所必需的[22, 23],而尿石素A是一种线粒体自噬激活剂[15, 24],尿石素A是否通过调节线粒体自噬促进白色脂肪棕色化值得进一步探讨。