抗寒锻炼中紫花苜蓿非结构性碳水化合物转化转运与抗寒性关系

赵金梅，殷国梅，孙娟娟，卫媛，李薇，郭茂伟*，刘思齐，张佳琪

（1. 中国农业科学院草原研究所，内蒙古 呼和浩特 010010；2. 农业农村部牧草资源与利用重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010010；3. 内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031）

紫花苜蓿（Medicago sativa）为优良多年生豆科牧草，在全球广泛种植［1］。我国北方气候干燥寒冷，降水量少，适合苜蓿生长，是我国苜蓿主产区［2］，但同时也是苜蓿冻害发生的主要地区，抗寒性成了该地区苜蓿品种选择时考虑的关键因素。苜蓿在北方秋季日照时间缩短、温度降低的气候条件下，抗寒性会大幅提高。植物暴露在结冰以上低温（一般为0～15 ℃）条件下一定时间后，抗寒性大幅度提高的过程称为抗寒锻炼（cold hardening， CH）［3］。在抗寒锻炼过程中，植物体内会积累大量的渗透调节物质和抗氧化物质，如可溶性糖、淀粉等非结构性碳水化合物［4］，使植物器官免受由低温所产生的伤害，从而提高植株的抗寒性［5］。苜蓿根冠经过抗寒锻炼后半致死低温（semi-lethal low temperature， LT50）可以达到-20 ℃以下［6-7］，在此过程中体内可溶性糖累积量明显提高［7］。研究发现，抗寒性强的苜蓿品种秋季主根中可溶性糖含量较高，其含量与苜蓿再生率呈正相关［8］。Castonguay 等［9］指出抗寒的苜蓿品种在夏末到秋季末，根冠可溶性糖几乎呈线性增加，其含量在100 mg·g-1以上［10］，是冬季受冻害严重苜蓿品种可溶性糖含量的2 倍（50 mg·g-1）。淀粉为非结构性碳水化合物的重要成分之一，其在根冠中含量随苜蓿抗寒锻炼表现为先快速降低，然后缓慢降低，与可溶性糖含量变化有一定的互补性［7］。以上研究均表明，可溶性糖和淀粉在苜蓿抗寒性形成中起重要作用，同时在苜蓿抗寒锻炼中存在可溶性糖与淀粉间的转化。

植物在刈割或利用后再生初期，会将残留器官中贮藏的非结构性碳水化合物转化成可利用形态，用于地上部分生长，随着地上部器官的再生和光合功能的恢复，在供应地上部继续生长的同时将部分有机同化物运输到根、根颈等器官并转化为贮藏物质［11］。苜蓿1 年可以多次刈割利用，在无低温胁迫的条件下，苜蓿根与根颈中碳水化合物总量随秋眠级增加而增加，刈割后再生量也随之增加［12］，秋季刈割后，在温度降低、日照时间变短的条件下，不同苜蓿品种再生高度不同，即苜蓿品种的秋眠级不同［13］，同时苜蓿品种抗寒性和越冬性能也不同，因此推测刈割后苜蓿地上、地下器官中非结构性碳水化合物存在用于再生与提高越冬器官抗寒性之间的分配问题及品种差异。故需要对苜蓿秋季刈割后再生期间越冬器官-根与叶中非结构性碳水化合物的转化、不同器官间的转运及与苜蓿抗寒性的关系进一步研究。据此本研究模拟秋季抗寒锻炼过程中温度和光照变化，以2 个不同抗寒性苜蓿品种为对象，研究抗寒锻炼过程中苜蓿根、叶中不同非结构性碳水化合物的动态变化、转化、不同器官间的转运和品种间的差异，解析非结构性碳水化合物利用模式与苜蓿抗寒性的关系，为苜蓿种质资源鉴定和抗寒性评价提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为抗寒性强弱不同的2 个紫花苜蓿品种，其中：肇东（Zhaodong）苜蓿的抗寒性强，秋眠级1～2［8］，由国家种质牧草中期库提供；赛迪10（Sardi 10）的抗寒性较弱，秋眠级10 级，由百绿（天津）国际草业有限公司提供。

1.2 试验地点与培养方法

试验在中国农业科学院草原研究所实验室内进行。于2019 年6 月25 日将肇东和赛迪10 苜蓿种子播种于塑料花盆中（口径6 cm×6 cm，高11 cm），每个品种种植45 盆。盆中填装营养土与蛭石的混合土，比例为3∶1。播种后花盆放置在培养箱（Percival LT-36VL，美国）中，在光照强度 300 μmol·m-2·s-1、光照时间13 h 和昼夜温度25 ℃/18 ℃的条件下培养。待幼苗长出一片真叶时定苗，每盆保留3 株。生长至初花期将其刈割，再生7 d 后开始采集处理样品。

1.3 试验处理

2 个苜蓿品种植株均分为2 组，分别为抗寒锻炼组（cold hardening group， CH）和正常条件生长组（normal growing group， NG），CH 组设3 个处理，分别为对照（CK）、抗寒锻炼初期-降温处理（CH1）和抗寒锻炼后期-低温处理（CH2）。再生7 d 后（处理前）为CK，接受抗寒锻炼处理的CH1处理，初始昼夜温度为25 ℃/18 ℃，光照时间13 h，昼夜温度按照1 ℃·d-1，日照时间按照15 min·d-1递减，处理7 d，处理结束时昼夜温度为18 ℃/11 ℃，日照时间为11.25 h；CH2处理植株在接受CH1处理后继续进行抗寒锻炼处理，处理的初始昼夜温度从18 ℃/11 ℃直接降到10 ℃/6 ℃，然后按照1 ℃·d-1的速率降温，日照时间从11.25 h 开始，按照15 min·d-1递减，处理7 d，夜间温度降到1 ℃时不再降低，处理结束时昼夜温度为3 ℃/1 ℃，日照时间为9.50 h。NG 组植株再生7 d 后仍在前述培养条件下生长。

1.4 取样方法

CH 组植株分别在处理前（CK）、CH1处理后和CH2处理后采集叶片和根系样品，NG 组分别在再生7、14、21 d取样，2 组取样时间序列相对应。每组每个处理3 个重复，各重复样品取自同一处理的不同盆中植株。采集叶片样品时，取各处理组植株顶端第3～6 个完整展开的叶片，一部分立即进行LT50测定，另一部分采样现场用液氮快速冷冻后保存于-80 ℃超低温冰柜中，用于可溶性糖和淀粉的测定。采集根样品时，将根与营养土从培养钵中倒出，取出完整根系，流水冲去根表面土壤和其他物质，然后用去离子水冲洗3～5 次，用滤纸吸干根表面水分，一部分立即进行LT50测定，另一部分置于烘箱中105 ℃杀青30 min，65 ℃烘48 h，并粉碎备用。

1.5 测定指标与方法

1.5.1 根、叶半致死低温的测定 参照梁莉等［14］的方法测定2 个品种苜蓿根、叶LT50，但略有改动，具体为先将梯度降温盒按一定比例加入预冷的异丙醇和常温异丙醇，达到不同设定的温度。然后将所取完整叶片和切成段的主根置于冻存管中，冻存管置于不同温度的梯度降温盒中，每个梯度降温盒中加入一枚纽扣温度计，准确记录盒中温度。将梯度降温盒置于冷藏柜中，放置2 h 后取出样品，置于4 ℃冷藏过夜。过夜后的样品置于加有25 mL 去离子水的离心管中，振荡4 h，测定电导率C1，然后沸水中煮30 min，冷却到室温，振荡4 h，测定总电导率C2。空白对照试管中加25 mL 去离子水，不加样品，与其他样品一起振荡、煮沸并分别测定电导率，为Cck1、Cck2。离子渗透率计算公式如下：离子渗漏率（%）=（C1-Cck1）×100/（C2-Cck2）。不同处理温度下离子渗漏率数据通过Logistic 方程进行拟合，在相关性显著情况下，计算拐点温度，即LT50［15］。

1.5.2 可溶性糖和淀粉含量测定 采用蒽酮-硫酸法测定可溶性糖和淀粉含量［16］，采用酸水解的方法降解提取可溶性糖后的残渣，然后通过蒽酮-硫酸法以葡萄糖为标准物质进行测定［16］，得到的葡萄糖含量乘以换算系数0.9 即为淀粉含量。

1.6 数据计算与统计分析

使用SAS 软件ANOVA 程序进行单因素方差分析和多重比较，采用Sigmaplot 软件作图。结果以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 抗寒锻炼过程中不同紫花苜蓿品种根、叶抗寒性变化

CH1的2 个苜蓿品种叶和肇东根的LT50显著低于CK（P＜0.05），赛迪10 根的LT50高于CK（表1）。CH2处理2 个苜蓿品种根、叶的LT50均显著低于CH1（P＜0.05），在抗寒锻炼过程中肇东根、叶的LT50降低幅度明显大于赛迪10，二者差异显著（P＜0.05）。肇东叶的LT50在处理前低于赛迪10，根高于赛迪10，在CH1和CH2处理后均低于赛迪10。

表1 不同苜蓿品种半致死低温比较Table 1 Comparison of semi-lethal low temperature between two alfalfa varieties （℃）

2.2 抗寒锻炼过程中不同紫花苜蓿品种根、叶中可溶性糖含量变化

NG 组肇东苜蓿从再生第7 天到第21 天根中可溶性糖含量逐步降低，赛迪10 在第14 天之前降低而后升高（图1）。经CH1处理后，2 个苜蓿品种根中可溶性糖含量均升高，赛迪10 增幅较大（P＜0.05）。经CH2处理后，肇东根中可溶性糖含量继续增加，而赛迪10 降低，最终肇东高于赛迪10。NG 组苜蓿叶中可溶性糖含量随再生变化较小，CH 组2 个苜蓿品种叶中可溶性糖含量均高于NG 组。CH1处理后肇东和赛迪10 叶中可溶性糖含量明显高于CK，赛迪10 叶中可溶性糖含量显著高于肇东（P＜0.05）。CH2处理后肇东与赛迪10 叶中可溶性糖含量降低，赛迪10 的含量低于肇东。

图1 抗寒锻炼和正常生长条件下苜蓿根和叶中可溶性糖含量变化Fig.1 Changes of soluble sugar content of alfalfa roots and leaves under cold acclimation and normal growth conditions

2.3 抗寒锻炼过程中不同紫花苜蓿品种根、叶中淀粉含量变化

NG 组2 个苜蓿品种从再生第7 天到第21 天，根中淀粉含量均大幅度降低（图2）。CH1处理后2 个品种根中淀粉含量基本保持不变，但经CH2处理后肇东根中淀粉含量降低，赛迪10 增加且显著高于肇东（P＜0.05）。NG组肇东叶中淀粉含量随再生表现为先降低后增加的趋势，赛迪10 则逐步降低。抗寒锻炼过程中，2 个苜蓿品种叶中淀粉含量均先降低后增加，肇东的变化幅度较小，且在CK、CH1和CH2处理下均显著高于赛迪10（P＜0.05）。

图2 抗寒锻炼和正常生长条件下苜蓿根和叶中淀粉含量变化Fig.2 Changes of starch content of alfalfa roots and leaves under cold acclimation and normal growth conditions

2.4 非结构性碳水化合物含量与紫花苜蓿抗寒性的相关性分析

根可溶性糖与根LT50、叶LT50、根淀粉、叶可溶性糖的相关性达到极显著水平（表2，P＜0.01），叶可溶性糖与根LT50、叶LT50、根可溶性糖、根淀粉的相关性达到显著水平（P＜0.05）。根淀粉与根LT50、根可溶性糖、叶可溶性糖的相关性达到极显著水平（P＜0.01），叶淀粉含量与叶LT50极显著相关（P＜0.01），与其他指标相关性较低。苜蓿根、叶的LT50与各指标为负相关，根、叶可溶性糖和淀粉之间的相关性为正相关。

表2 不同指标间相关性分析Table 2 Correlation analysis among different indexes

3 讨论

3.1 紫花苜蓿可溶性糖和淀粉含量及其与抗寒性的关系

有研究表明糖类的代谢变化与植物抗寒性直接相关，植物在低温胁迫条件下积累可溶性糖可以增加细胞的渗透调节能力，预防冻害的发生［4，6，17］；越冬期间的植物和抗寒性强的植物可溶性糖含量较高［7］。Castonguay 等［7］在3 个不同抗寒性苜蓿品种（Rambler，Apica，CUF-101）上的研究表明苜蓿根中可溶性糖含量较高时，LT50较低。本试验结果亦是如此，接受抗寒锻炼后肇东和赛迪10 根、叶的LT50随着其中可溶性糖含量的增加而降低（相关系数r值分别为-0.728、-0.587 和-0.601，-0.387，P＜0.05）。以上研究结果证实可溶性糖含量越高，苜蓿抗寒性越强。淀粉是植物抗寒锻炼过程中非结构性碳水化合物的主要储备形式［7］，在植物抗寒性能的提高和安全越冬中起着重要作用。本研究2 个苜蓿品种根、叶淀粉含量及刘香萍等［8］苜蓿根冠淀粉含量，均与抗寒性间呈显著负相关关系。Xu 等［6］研究表明，苜蓿抗寒锻炼后根颈淀粉含量大幅度增加，在温度继续降低情况下，淀粉含量降低。本试验中，经历CH1降温处理后苜蓿根淀粉含量变化较小，但仍明显高于正常生长植株，保持在较高水平，但接受CH2低温处理后抗寒性强的肇东根中淀粉含量下降31.39%，CH2处理后变化与Xu 等［6］用抗寒性较强的苜蓿品种得出的结果一致。在抗寒锻炼前期二者淀粉含量变化产生差异可能主要是由于本试验是在苜蓿刈割后再生期进行的抗寒锻炼。从正常条件下生长植株根、叶中淀粉和可溶性糖的变化中可以看到，苜蓿再生初期需要大量消耗根、叶中可溶性糖和淀粉。本试验中，与正常条件下生长植株根中可溶性糖、淀粉含量大幅度降低相比，抗寒锻炼后植株可溶性糖和淀粉保持在较高水平，也是苜蓿再生过程对抗寒锻炼的响应，使器官保持较高的抗寒性。

不同苜蓿品种抗寒性差异与其根中累积可溶性糖的能力有关。石立媛等［18］研究表明，抗寒锻炼后（10 月15日）抗寒性强的苜蓿品种根中可溶性糖含量高于抗寒性弱的品种。同样地，本研究CH1处理后抗寒性强的肇东根中可溶性糖含量仍低于抗寒性弱的赛迪10，但继续进行CH2处理，使温度降低到昼夜温度为10 ℃/6 ℃后，肇东根、叶中可溶性糖含量高于赛迪10。Castonguay 等［19］研究指出苜蓿在温度降低到10 ℃以下时，抗寒性极强的苜蓿品种根冠中淀粉含量低于不抗寒的品种，随着温度继续降低，抗寒性极强的苜蓿根中的淀粉含量快速降低，而抗寒性弱的品种淀粉含量快速增加。抗寒锻炼前后，肇东根中的淀粉含量低于赛迪10，在CH2处理后肇东的淀粉含量降低，赛迪10 含量增加，表现出的品种间差异非常明显。CH1处理后，赛迪10 根、叶中可溶性糖含量大幅增加，且显著高于肇东，叶中淀粉含量大幅降低，且显著低于肇东。而抗寒性弱的苜蓿品种在降温期间，地上生物量增加且显著高于抗寒性强的品种［20］，因此赛迪10 不断消耗根中物质［20］与叶中的淀粉，使根、叶中可溶性糖含量保持在较高水平，并使器官保持较高再生能力，导致抗寒锻炼后根的抗寒性与肇东差异较大。

3.2 紫花苜蓿根、叶中淀粉与可溶性糖之间的转运与转化

抗寒锻炼改变了植物非结构性碳水化合物地上、地下的转运，特别是淀粉，作为植物体内非结构性碳的重要贮存形式，在低温胁迫下其可以水解成可溶性糖来提高器官的抗寒性［6-7，21-22］。正常条件生长植株在再生初期，根中淀粉、可溶性糖含量降低，淀粉转化成可溶性糖，并供应给地上部生长，同时叶中淀粉含量也降低，可溶性糖含量保持在较低水平，消耗的这些非结构性碳水化合物主要用于地上部再生［11，20］。CH1处理后，苜蓿叶中淀粉含量降低，根、叶中可溶性糖含量增加，而根中淀粉含量变化较小，叶中淀粉向可溶性糖转化，并向根中转运；CH2处理后地上、地下的转运较少。

本试验中，抗寒锻炼处理下苜蓿根、叶中淀粉含量与可溶性糖含量表现出互补的变化趋势，发生淀粉与可溶性糖的相互转化，且根、叶间及品种间表现出不同的转化方向。除上述CH1处理后，叶中发生淀粉向可溶性糖转化外，CH2处理后，2 个品种叶中可溶性糖含量降低，淀粉含量增加，叶中可溶性糖向淀粉转化，而2 个品种根中非结构性碳水化合物的转化方向不同，肇东根中淀粉含量降低，可溶性糖含量增加，淀粉向可溶性糖转化，赛迪10根淀粉含量增加，可溶性糖含量降低，可溶性糖向淀粉转化。抗寒性较强的苜蓿品种WL353LH（秋眠级4）的研究结果表明，苜蓿根茎中淀粉含量在抗寒锻炼后期被利用［6］，在苜蓿其他品种［7，21，23］的研究表明苜蓿在自然降温条件下根中淀粉含量降低，使可溶性总糖含量增加，并认为低水平的淀粉含量有利于提高苜蓿抗寒力。姚胜蕊等［22］和Palonena 等［24］也在桃（Prunus persica）和红树莓（Rubus idaeus）的研究中指出越冬器官中淀粉利用率越高，抗寒性越强。本试验中，2 个不同抗寒性苜蓿品种根中淀粉利用率差异较大，抗寒性强的肇东苜蓿在CH2处理后淀粉向可溶性糖转化，利用率提高，抗寒性弱的赛迪10 根中可溶性糖向淀粉转化，不仅不利用淀粉反而积累淀粉。本研究2 个苜蓿品种在低温处理后根中非结构性碳水化合物转化方向不同可能是因为二者抗寒性差异大所致，这也说明抗寒锻炼后期苜蓿根中淀粉向可溶性糖的转化是保障地下器官抗冻性的重要途径，而转化方向的不同也可能是品种间抗寒性差异大的重要原因。

4 结论

紫花苜蓿在抗寒锻炼过程中根淀粉含量及根、叶中可溶性糖含量与其抗寒性高度相关，在抗寒锻炼初期叶中淀粉转化成可溶性糖并向根部转运，提高根、叶的抗寒性，在抗寒锻炼持续推进后，根中发生淀粉向可溶性糖转化，从而使根的抗寒性得到不断提高。抗寒性强弱不同的苜蓿品种在抗寒锻炼中对于非结构性碳水化合物的利用与转化模式也不同。抗寒锻炼初期，与抗寒性强的肇东相比，抗寒性弱的赛迪10 根、叶中消耗更多的非结构性碳水化合物保障和用于再生。抗寒锻炼后期肇东根中淀粉向可溶性糖转化，赛迪10 根中可溶性糖向淀粉转化。因此，苜蓿在抗寒锻炼初期消耗较少的非结构性碳水化合物，后期根中淀粉向可溶性糖转化，有利于品种抗寒性增加。