“益气健脾方”对肝郁脾虚型慢加急性肝衰竭患者临床疗效及外周血中性粒细胞功能的影响——附31例临床资料

赵 强 王 希 赵 容 陈小妹 梁重锋 谭善忠

（南京中医药大学附属南京医院，江苏南京 210003）

慢加急性肝衰竭（acute on chronic liver failure，ACLF）是在慢性肝病（如慢性乙型肝炎病毒感染或酒精性肝炎）基础上因急性肝代谢失调导致的一种危急症候群，易发生多器官功能衰竭[1]。ACLF发病迅速，病情较为严重，且并发症较多，具有极高的死亡率。ACLF发生发展过程中，外周血中性粒细胞百分比增加，但其吞噬功能却显著降低，形成中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NETs）的能力增强，此现象在预后不良的ACLF患者中尤为明显[2]。NETs是以DNA为骨架，嵌有各种杀菌蛋白如组蛋白Histone H3的网状结构，Histone H3是真核生物体细胞中的一种碱性蛋白质组分，其和DNA共同组成核小体结构，在DNA修复、复制和维持染色体稳定性中发挥核心作用[3]，而NETs的过度生成是造成肝脏损伤的重要原因[4]。

近年来，中医药治疗ACLF的临床研究日益增多，中西医结合治疗方案在改善ACLF患者临床症状，促进肝功能恢复，提高生存率等方面优势渐显[5]。笔者团队前期研究发现，乙型肝炎（以下简称乙肝）病毒相关慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）以正虚为主要病机特点，在内科综合用药基础上加用具有补气健脾、利湿退黄功效的益气健脾方能明显减轻该类患者肝损伤程度，且能提升外周血淋巴细胞百分比以恢复免疫功能，进而改善预后[6]。本研究在前期研究基础上进一步观察了联合用药对HBV-ACLF肝郁脾虚证患者总胆红素（total bilirubin，TBIL）水平、凝血酶原活动度（prothrombin time activity，PTA）及中性粒细胞百分比等的影响，并基于中性粒细胞功能调控探索益气健脾方的药理作用机制，现报道如下。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取2016年4月至2022年12月在南京中医药大学附属南京医院中西医结合肝病科收治的基础病变为慢性乙肝或肝硬化且辨为肝郁脾虚证的ACLF患者65例，按随机数字表法随机分为治疗组31例与对照组34例。治疗组男21例，女10例；年龄44～69岁，平均年龄（52.43±13.92）岁；平均病程（16.32±4.40）d。对照组男22例，女12例；年龄37～60岁，平均年龄（50.84±12.31）岁；平均病程（15.58±5.81）d。2组患者性别、年龄、病程等一般资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经南京中医药大学附属南京医院伦理委员会批准（批号：2015-ly-ky030，2017-ly-kt015）。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准 参照《乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭诊断与预后评估的中国标准》[7]中HBVACLF的诊断标准制定：极度乏力，并有明显厌食、呕吐和腹胀等严重消化道症状；黄疸进行性加深，TBIL≥171 µmol/L或每日上升≥17.1 µmol/L；有出血倾向，30%＜PTA≤40%，或1.5＜国际标准化比值（INR）＜1.9；排除肝性脑病或其他并发症。

1.2.2 中医辨证标准 参照《病毒性肝炎中医辨证标准（2017年版）》[8]拟定HBV-ACLF肝郁脾虚证辨证标准：胁肋胀痛，腹胀或便溏，情志抑郁，身倦乏力，舌质淡有齿痕、苔白或白腻，脉弦细。

1.3 纳入标准 符合HBV-ACLF西医诊断标准及肝郁脾虚证中医辨证标准；年龄18～70岁，男女不限；半年内未使用免疫抑制剂；自愿参加本研究，并签署知情同意书。

1.4 排除标准 急性肝衰竭、亚急性肝衰竭，或B超/CT等影像检查提示有肝癌者；有明显腹水、消化道及其他器官出血倾向者；肝肾综合征、肝性脑病者；细菌或真菌感染者；妊娠或哺乳期妇女；有精神疾病者。

2 治疗方法

2.1 对照组 予内科综合用药：丁二磺酸腺苷蛋氨酸（浙江海正药业股份有限公司，批号82302041A，规格0.5 g/支），2.0 g/d，静脉滴注；异甘草酸镁注射液（正大天晴药业集团股份有限公司，批号221212104，规格50 mg/支），200 mg/d，静脉滴注；HBV-DNA阳性者予恩替卡韦（北京百奥药业有限责任公司，批号A25421210，规格0.5 mg/片），0.5 mg/d，口服。

2.2 治疗组 在对照组治疗基础上加用中药汤剂益气健脾方口服，基本方药物组成：炙黄芪30 g，太子参30 g，炒白术30 g，陈皮10 g，当归10 g，茯苓10 g，酒女贞子10 g，酒黄芩10 g，炙甘草3 g。随证加减：湿偏重者，加茵陈30 g、生大黄10 g、虎杖15 g；热偏重者，加金钱草30 g、赤芍15 g、栀子8 g。中药汤剂由南京中医药大学附属南京医院中药房提供。每日1剂，水煎200 mL，分早晚饭后温服。

2组均连续治疗4周。

3 疗效观察

3.1 观察指标

3.1.1 肝功能指标和中性粒细胞百分比 于治疗前和治疗2周、4周后采集2组患者晨起空腹静脉血5 mL，采用全自动生化分析仪（雅培，型号：C8000）检测TBIL、PTA水平；采用血细胞分析仪（Mindray，型号：BC-20）检测中性粒细胞百分比。

3.1.2 中性粒细胞Histone H3蛋白水平 于治疗前随机提取6例患者（治疗组、对照组各3例）晨起空腹静脉血中性粒细胞样本，参考前期研究方法[9]，使用浓度分别为0.1、0.2、0.4 mg/mL的益气健脾方药液对中性粒细胞样本进行培养。前期研究表明，浓度在0.8 mg/mL以上的益气健脾方药液会对细胞产生毒性，因此本研究所选浓度在安全范围[9]。将中性粒细胞样本随机分为4组，分别为益气健脾方低、中、高剂量组和空白对照组，每组样本数为3，加相应浓度的益气健脾方药液和生理盐水培养24 h后，采用蛋白质免疫印迹（Western blot）法检测各组中性粒细胞Histone H3蛋白水平。运用Image Lab 6.0.1软件分析条带灰度值。

3.2 疗效判定标准 治疗4周后判定2组患者临床疗效，疗效标准参考《中药新药临床研究指导原则（试行）》[10]拟定。临床治愈：症状消失或基本消失，肝功能指标正常或轻微异常（TBIL≤34 µmol/L或PTA≥40%）；显效：症状明显减轻，肝功能指标明显好转（TBIL较治疗前下降50%以上或PTA较治疗前提高50%以上），且稳定在2周以上，无明显波动者；有效：症状有所改善，肝功能有所好转（TBIL较治疗前下降25%以上，或PTA较治疗前提高25%以上），且稳定在2周以上，无明显波动者；无效：症状无改善，TBIL、PTA无恢复甚至加重，或病情继续恶化。总有效率（%）=[（临床治愈例数+显效例数+有效例数）/总例数]×100%。

3.3 统计学方法 采用SPSS 26.0 软件对数据进行统计学分析。本研究计量资料均符合正态分布，用均值±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，组内比较采用单因素方差分析。计数资料以例或百分比表示，率的比较采用Fisher确切概率法检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3.4 治疗结果

3.4.1 2组患者临床疗效比较 治疗后治疗组临床总有效率为67.74%，对照组为52.94%，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 治疗组与对照组患者临床疗效比较

3.4.2 2组患者治疗前及治疗2周、4周后中性粒细胞百分比、肝功能指标比较 治疗前2组患者TBIL水平、PTA、中性粒细胞百分比比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。治疗2周后，治疗组患者TBIL较治疗前改变并不明显，对照组反而有上升趋势。治疗4周后，治疗组患者TBIL水平较本组治疗前、本组治疗2周后明显降低（P＜0.05），也明显低于同期对照组（P＜0.05）；而对照组TBIL水平明显低于本组治疗2周后（P＜0.05）。治疗2周后，治疗组患者PTA较本组治疗前明显升高（P＜0.05），也显著高于同期对照组（P＜0.05），对照组此指标与本组治疗前比较差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗4周后，2组患者PTA均明显高于本组治疗前（P＜0.05），治疗组明显高于同期对照组（P＜0.05）。治疗2周后，2组患者中性粒细胞百分比与本组治疗前比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；治疗4周后，2组患者中性粒细胞百分比均明显低于本组治疗前和治疗2周后（P＜0.05），治疗组明显低于同期对照组（P＜0.05）。详见表2。

表2 治疗组与对照组患者治疗前及治疗2周、4周后中性粒细胞百分比和肝功能指标比较（x-±s）

3.4.3 经不同浓度药物干预后中性粒细胞Histone H3蛋白相对表达量比较 益气健脾方中、高剂量组中性粒细胞Histone H3蛋白相对表达量明显低于空白对照组（P＜0.05），其中益气健脾方高剂量组Histone H3蛋白相对表达量明显低于低剂量组（P＜0.05）。见图1、表3。

图1 各组中性粒细胞Histone H3 蛋白电泳图

表3 各组中性粒细胞Histone H3 蛋白水平比较（x-±s）

4 讨论

ACLF患者在发病初期即出现严重的肝功能障碍，中性粒细胞最先被招募至损伤部位，但中性粒细胞的核心功能发生缺陷，即吞噬作用和脱颗粒作用下降，而产生NETs的能力增强，加重了ACLF患者肝损伤[11]。活化的免疫细胞功能耗竭，代偿性抗炎应答存在缺陷，导致病情进展迅速，病死率高。因此，有效改善患者的免疫抑制状态是阻止ACLF进展的关键。目前尚无针对ACLF的特异性治疗方法，主要采用内科综合支持治疗、人工肝治疗或肝移植，肝移植是目前治疗ACLF最有效的方法，但因供肝紧缺、术后需长期使用抑制剂等因素，临床应用受到很大限制。

根据ACLF临床表现，可将其归于中医学“黄疸”“急黄”“肝瘟”等范畴[12]。本病病理因素包括毒、热、湿、虚、瘀等，病性属正虚邪实，病位在肝、肾、脾。HBV-ACLF是在慢性乙肝或肝硬化基础上发生的严重肝脏损害，病程较长。久病必虚，因虚致实，故本病以本虚标实为主要证候特点[13-14]。笔者团队发现，本病之虚以气虚、血虚为多，实以湿邪为主，瘀为主要兼证，加之病程较长，正气耗伤严重，故而正虚之象尤为明显。“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”，针对HBV-ACLF本虚标实的证候要点，我们法以益气养肝、健脾补血治其本，清热利湿、理气疏肝治其标，运用益气健脾方标本兼治，临床取效良好。益气健脾方化裁自当归补血汤和四君子汤，方中重用炙黄芪益气健脾，太子参补气健脾兼可生津，与黄芪相伍增益气养阴之功，共为君药；当归养血活血，与黄芪配伍取当归补血汤之意，补气以生血，酒女贞子滋补肝肾阴精，共为臣药；佐以炒白术、茯苓、陈皮、酒黄芩等健脾药，兼清热利湿、理气疏肝；炙甘草调和诸药为使。药理研究表明，黄芪可通过降低血小板黏附性、抑制血小板聚集从而改变血液流变性，同时具有保护血管内皮细胞、抗肝纤维化等药理作用[15-16]。

TBIL和PTA是预测和判定ACLF病情程度和疗效评价的重要指标，TBIL升高表明肝脏出现病变或者胆管阻塞，导致肝脏代谢功能下降，大量的胆红素聚集肝脏，严重时可引起肝衰竭和多脏器功能衰竭[17]；而PTA是反映肝脏损害的特异性指标，PTA≤40%是诊断ACLF的重要依据，且PTA越低预示预后越差[18]。本研究结果显示，2 种治疗方案均能明显改善HBV-ACLF患者PTA、TBIL水平，联合治疗方案改善效果更明显，且在治疗2 周时已有效果显现。本研究也观察了不同浓度益气健脾方体外干预对HBV-ACLF患者中性粒细胞Histone H3蛋白相对表达量的影响，结果表明，在安全浓度范围内的益气健脾方药液能明显降低HBV-ACLF患者中性粒细胞Histone H3蛋白水平，间接抑制NETs的生成，其抑制能力随着药物浓度的增加呈上升趋势，表现出一定的剂量依赖性。

综上所述，在内科综合用药基础上加用益气健脾方能显著提高HBV-ACLF患者的临床疗效，减轻肝损伤，其机制可能与抑制中性粒细胞Histone H3的表达从而降低NETs的生成有关。我们将继续收集病例进行临床研究，增加疗效指标以验证益气健脾方治疗HBV-ACLF的有效性，同时进行分子生物学实验以探索ACLF发生时中性粒细胞的变化与肝细胞损伤之间的内在联系，为建立和完善益气健脾方对HBV-ACLF患者中性粒细胞干预作用的循证医学提供更多的科学证据。