北京柠檬不同部位精油的成分及抑菌活性分析

尤桂春,蔡锦玲,蓝波妙,武竞超,林文忠,陈品品,刘灿洪,梁超凡

(泉州市农业科学研究所,福建晋江,362212)

在食品工业中,为防止食品中病原微生物的生长,往往需要添加防腐剂。有研究发现,植物精油的抗菌效果显著,可做为天然防腐剂代替合成化学添加剂用于食品防腐,且更安全、无毒,人体很容易被耐受[1]。在柑桔中,柠檬类果实的加工比例较高[2]。柠檬精油是柠檬两大加工产品之一[3],其附加值高,在食品、日用品、化妆品和医药等行业得到了广泛应用[4-11]。近年来,国内外学者对柠檬果皮精油[12-17]和叶片精油[18-20]的化学成分及生物活性展开了研究。柑桔植株在种植的过程中,往往会根据栽培需求,每年疏剪掉大量枝条和果,且被视为废物而遗弃。柠檬类果树北京柠檬(Citruslimon)原产于我国,适应性广、耐湿热和较耐寒等特点,在我国有一定量的栽培,但关于北京柠檬精油的研究报道较少。本研究采用水蒸气蒸馏法分别提取北京柠檬叶片、枝干和果皮的挥发油,利用GC-MS技术进行化学成分分析和比较,并分别对3种食源性细菌进行了抑菌活性研究,以期为北京柠檬的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料来源于福建省泉州市国家农业科技园区果蔬园柠檬良种筛选圃内长势良好的6年生北京柠檬植株。

丙酮:分析纯,太仓沪试试剂有限公司。无水乙醇:分析纯,常熟市鸿盛精细化工有限公司。牛肉膏蛋白胨:广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

实验型精油提取机组(JYT-20L):上海矩源机械设备有限公司。低温冷却液循环泵(DLSB-5/20):杭州庚雨仪器有限公司。气相色谱-质谱联用仪(7890B-5977B):安捷伦科技(中国)有限公司。色谱柱:HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。净化工作台(SW-CJ-2D):苏州博莱尔净化设备有限公司。恒温培养摇床(SPH-200B):上海世平实验设备有限公司。生化培养箱(SPX-150BE):邦西仪器科技(上海)有限公司。科学型超纯水机(ELGA PURELAB Classic DI):威立雅环境集团。

1.3 方法

1.3.1 样品采集 于2020年10月下旬,选取6年生北京柠檬植株3株采集样品。叶片和枝干采集位置为植株东、南、西、北、中五个方位,剪取1～2年生枝条,采集叶片和枝干。果实采集位置为树冠外围中部,选转色后的正常果实,削取果皮(含白色海绵层)。

1.3.2 精油提取 各样品采用水蒸气蒸馏法提取精油。取样品1.0 kg(鲜质量),设置蒸馏温度105 ℃、锅炉温度110 ℃、蒸馏时间2.5 h,提取的精油避光保存。精油出油率(%)=(精油质量/原料质量)×100。

1.3.3 GC-MS分析[21]GC条件:进样口温度250 ℃,载气为氦气(99.999%),恒定流量0.8 mL/min,进样体积1.0 μL,分流比10∶1。升温程序:初始温度45 ℃保持2 min,以20 ℃/min升至280 ℃并保持3 min。

MS条件:4级杆温度150 ℃,离子源温度250 ℃,电离方式为EI电离,电子能量70 eV,扫描范围50～600 m/z,溶剂延迟时间5 min;SCAN扫描采集。

根据得到的总离子流图,利用计算机对各峰进行质谱数据系统检索和NIST 2014标准质谱图数据库比对,并用峰面积归一化法计算各成分的相对百分含量。

1.3.4 菌悬液制备 大肠埃希氏菌Escherichiacoli(ATCC25922)和金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus(ATCC6538)来自上海保藏生物技术中心,伤寒沙门氏菌Salmonellatyphi(FSCC215009)来自广东环凯微生物科技有限公司。细菌在牛肉膏蛋白胨培养基上活化培养,用无菌水配制成(1～10)×106CFU/mL的菌悬液[22],备用。

1.3.5 抑菌活性测定 抑菌圈大小测定:采用滤纸片扩散法测定抑菌圈大小[23]。待培养皿中的固体培养基冷却凝固后,吸取100 μL菌悬液,注于固体培养基表面,使用无菌三角涂布棒将菌悬液涂抹均匀,再用含有6 μL样品精油、直径约6 mm的无菌滤纸片轻轻贴于培养基表面,用不含样品精油的滤纸片做对照,培养皿用封口膜密封后,以倒放的形式置于37 ℃恒温培养箱中培养,培养24 h后测量抑菌圈直径,计算平均值。每处理重复3次。

最低抑菌浓度测定:用丙酮作为溶剂,配制所需梯度浓度的样品精油溶液。待培养皿中固体培养基冷却凝固后,吸取100 μL菌悬液均匀涂抹于固体培养基表面,平板分为4个区域,用直径6 mm、厚度0.7 mm的无菌滤纸片分别蘸取浓度为0.725%、1.5%、3%、6%的样品精油溶液,然后轻轻贴于培养基表面4个区域内,以浓度为9%、12%和25%的样品精油溶液作为补充,用蘸取丙酮的滤纸片作为对照,培养皿用封口膜密封后,以倒放的形式置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h,观察抑菌现象。以抑制细菌生长的最低精油浓度作为该菌种的最低抑菌浓度[23]。

1.4 统计分析

应用SPSS 22.0进行单因素方差分析和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同部位精油的出油率

试验结果表明,利用水蒸气蒸馏法提取,北京柠檬新鲜叶片、枝干和果皮的出油率分别为0.308%、0.076%和0.091%,相互间差异显著(p<0.05);叶片精油出油率是枝干的4倍,是果皮的3倍多。

2.2 不同部位精油的成分

经HP-5MS安捷伦色谱柱分离,MS检测,得出3个部位精油的总离子流色谱图(见图1)。结合计算机对各峰经质谱数据系统检索和NIST 2014标准质谱图数据库比对,3个部位提取的精油共鉴定出38种化学成分,其中,叶片23种,枝干21种,果皮29种。

图1 北京柠檬3个部位精油的总离子流色谱图

利用峰面积归一化法计算各成分的相对百分含量,结果见表1和表2。从叶片、枝干和果皮精油中鉴定出的化合物分别占精油总量的98.80%、99.66%和99.99%。在3个部位提取的精油中,萜烯类化合物20种,醇类化合物8种,酯类化合物2种,醛类化合物3种,酮类化合物1种,烷烃类化合物1种,酚类化合物1种,其他化合物2种。叶片精油以萜烯类、醛类和醇类占主要部分,达到93.97%;还含有脂类(4.47%)和烷烃类(0.36%)。枝干精油以萜烯类、酯类和醛类为主,达到93.17%,还含有醇类(6.49%)。果皮精油以萜烯类、醇类和酚类为主,达到93.18%,还含有脂类(0.32%)、醛类(3.20%)、酮类(0.57%)和其他(2.72%)。不同部位精油成分类别由多到少为果皮>叶片>枝干。3个部位精油均以萜烯类化合物相对含量最高,为68.29%～72.91%。

表1 北京柠檬植株不同部位的精油成分及相对含量

表2 北京柠檬植株不同部位精油的成分类别相对含量 %

3个部位精油的共有成分15种:d-柠檬烯、香茅醛、3-蒈烯、芳樟醇、柠檬醛、(E)-3,7-二甲基八-2,6-二烯基碳酸乙酯、β-月桂烯、β-榄香烯、β-水芹烯、石竹烯、香茅醇、紫苏醇、α-松油醇、γ-松油烯、4-萜烯醇。这15种成分的相对含量分别占叶片、枝干和果皮精油的93.05%、92.30%和78.82%。3个部位精油的各共有成分相对含量有差异。如:d-柠檬烯是精油中最主要的成分,在精油中的相对含量为51.23%～53.03%。香茅醛在叶片和枝干中含量较为丰富,分别为10.42%和8.41%;在果皮中含量较少,为0.64%。在3个部位精油中,(E)-3,7-二甲基八-2,6-二烯基碳酸乙酯和γ-松油烯的相对含量差异也较大,分别为7.53%(枝条)～0.32%(果皮)和7.60%(果皮)～0.51%(叶片)。

叶片精油特异成分为α-法呢烯、(3E,7E)-4,8,12-三甲基十三-1,3,7,11-四烯、2-亚甲基-4,8,8-三甲基-4-乙烯基-双环[5.2.0]壬烷,共3种,相对含量达2.70%。

枝干精油特异成分为(+)-β-芹子烯、α-雪松烯、β-松油烯,共3种,相对含量达1.34%。

果皮精油特异成分为丁香烯环氧化物、顺式-α-香柠檬烯、α-侧柏烯、2-乙烯基-1,3,3-三甲基环己烯、萜品油烯、p-薄荷-1(7),8-二烯-2-醇、顺式-对薄荷-2,8-二烯-1-醇、α,4-二甲基-3-环己烯-1-乙醛、(S)-3-甲基-6-(1-甲基乙烯基)-2-环己烯-1-酮、百里酚、1-烯丙基-2-甲苯、2-异丙基-1-甲氧基-4-甲基苯,共12种,相对含量占19.20%。果皮精油特异性成分数量最多,且特异性成分相对含量最高。

以3个部位精油共有色谱峰的峰面积作相关分析,进行3个部位精油相似度评价,结果叶片和枝干精油的相关系数为0.993,叶片和果皮精油的相关系数为0.961,枝干和果皮精油的相关系数为0.962,即叶片和枝干精油的相似度较近。

2.3 精油抑菌活性

2.3.1 抑菌圈大小 通过测定3个部位精油对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和伤寒沙门氏菌的抑菌圈直径大小,比较3个部位精油分别对这3种细菌的抑菌效果,结果见表3。3个部位精油对3种细菌均有一定的抑制活性;对同一细菌而言,不同部位精油间的抑菌圈直径差异显著。在抗菌素抑菌圈试验中,抑菌圈直径大于15 mm时为高度敏感,10～15 mm时为中度敏感,7～9 mm时为低度敏感,无抑菌圈者为不敏感[22]。由此可见,叶片精油对3种细菌的抑菌圈直径均大于15 mm,属高度敏感;枝干精油对金黄色葡萄球菌属高度敏感,对大肠埃希氏菌和伤寒沙门氏菌属中度敏感;果皮精油对金黄色葡萄球菌和伤寒沙门氏菌属高度敏感,对大肠埃希氏菌属中度敏感。不同部位精油对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌抑菌活性为叶片精油>果皮精油>枝干精油,对伤寒沙门氏菌属抑菌活性为果皮精油>叶片精油>枝干精油。

表3 北京柠檬植株不同部位精油对3种细菌的抑菌圈直径 mm

2.3.2 最低抑菌浓度(MIC) 3个部位精油对大肠埃希氏菌最低抑菌浓度的测定结果见图2。当叶片精油浓度为1.50%时,不产生抑菌圈;当浓度为3%时,滤纸片周围产生抑菌圈。可见,叶片精油对大肠埃希氏菌的最低抑菌浓度所处区间为1.50%～3%。相应地,枝干精油对大肠埃希氏菌的最低抑菌浓度所处区间为6%～9%,果皮精油对大肠埃希氏菌的最低抑菌浓度所处区间为3%～6%。叶片精油对大肠埃希氏菌的最低抑菌浓度最小。

注:0:对照;1:精油浓度6%;2:精油浓度3%;3:精油浓度1.50%;4:精油浓度0.75%;5:精油浓度25%;6:精油浓度12%;7:精油浓度9%。图3至图4同。图2 北京柠檬3个部位精油对大肠埃希氏菌的最低抑菌浓度测定

由图3可知,对金黄色葡萄球菌,叶片精油浓度≤1.50%时不能产生抑菌圈,当浓度达到3%时出现抑菌圈,叶片精油的最低抑菌浓度所处区间为1.50%～3%;枝干和果皮精油的最低抑菌浓度所处区间均为3%～6%。叶片精油对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度最小。

图3 北京柠檬3个部位精油对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度测定

由图4可知,对伤寒沙门氏菌,叶片和枝干精油的最低抑菌浓度所处区间均为3%～6%,果皮精油的最低抑菌浓度所处区间为0.75%～1.50%。果皮精油对伤寒沙门氏菌的最低抑菌浓度最小。

图4 北京柠檬3个部位精油对伤寒沙门氏菌的最低抑菌浓度测定

3 小结与讨论

对北京柠檬叶片、枝干和果皮3个部位精油出油率进行比较的结果显示,出油率由大到小为叶片>果皮>枝干。通过GC-MS分析,3个部位精油共鉴定出38种成分,叶片精油成分有23种,枝干精油成分有21种,果皮精油成分有29种;3个部位精油共有成分为15种,特异性成分分别为3种、3种和12种,3个部位精油成分差异明显;对3个部位精油共有成分进行相关性分析,相似度为0.993～0.961,叶片和枝干精油的相似度较近。以大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和伤寒沙门氏菌3种食源性细菌为对象,测定3个部位精油的抑菌圈大小和最低抑菌浓度。结果表明3个部位精油均有一定的抑菌活性,其中,叶片精油对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌抑菌活性最强,抑菌圈直径最大,最低抑菌浓度最小(1.50%～3%);果皮精油对伤寒沙门氏菌的抑菌活性最强,抑菌圈直径最大,最低抑菌浓度最小(0.75%～1.50%)。

北京柠檬叶片、枝干和果皮3个部位精油最主要的成分均为d-柠檬烯,相对含量分别为52.85%、53.03%和51.23%。d-柠檬烯具有令人愉快的柠檬香气,具有抗炎、抗肿瘤和镇静中枢神经系统等作用,以及具有杀虫、杀螨、杀菌和消炎止痛等多种生物活性,对人、畜安全无害,近年来在医药工业和农药领域都有广泛的应用[24-26]。3个部位精油均含有具有杀虫驱避、抑菌抗菌、抗氧化、治疗心血管疾病和抗白血病等功效的柠檬醛[27-28],均含有具强效的抗炎活性,在医药上开始应用的β-月桂烯[29-30]。香茅醛为叶片和枝干精油的主要成分(相对含量分别为10.42%和8.41%),其具有柠檬香气,以及杀虫、抑菌活性,常用来制作香精、驱虫剂和防腐剂[31-33]。3-蒈烯为叶片和枝干精油的重要成分(相对含量5.39%),其可作为食品用香料,也作为合成香料、药物和农药或相应中间体的原料[34-35]。百里酚为果皮精油的主要成分(相对含量12.81%),其具有抗氧化、抗炎、局部麻醉和杀菌等活性,对多种食源性致病菌有很强抑制作用,也用于驱蚊的商业配方中[36-37]。γ-松油烯也为果皮精油的主要成分(相对含量7.60%),其具有抗氧化、抑菌和抗肝癌细胞活性的作用[38-39]。可见,北京柠檬叶片、枝干和果皮精油在香料、医药和防治农业害虫等方面具有广阔的开发前景;不同部位精油活性成分含量差异较大,在对其开发利用时,应考虑各自优势,合理利用。