不同发育时期澳洲坚果果实果皮中酚酸类物质成分分析

应支萍,李 彪,张 澳,王瑞丽,熊 智,施 蕊

(1 西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室/昆明生态林业产业国际科技研发中心/西南林业大学园林与园艺学院,昆明,650224;2 玉溪三农高原特色现代农业有限责任公司,云南玉溪,652500)

澳洲坚果(Macadamiaispp.)原产于澳大利亚,属山龙眼科(Proteaceae)澳洲坚果属常绿乔木果树[1]。20世纪70年代末我国开始进行澳洲坚果环境适应性试验,至今我国已成为世界上种植澳洲坚果面积最大的国家[2],在我国广东、广西、云南、福建、四川、重庆及贵州等地均有种植[2]。澳洲坚果果实主要由果皮、种壳和种仁组成[3],果仁为可食部分,占鲜果质量1/2的青皮和占壳果质量2/3的果壳为澳洲坚果加工的副产物[4]。澳洲坚果青皮少部分用作饲料,大部分作为废弃物丢弃,青皮中蕴藏的大量活性化合物基本未得到合理开发利用,导致资源浪费。

澳洲坚果果仁化学成分[5-7]、果壳利用[8-9]是目前国内外研究热点。在果皮研究方面,张汉周等[3]测定果皮中P、K、Ca、Mg等矿质元素含量发现,变异幅度最大为P元素,最小为Ca元素;张明楷等[5]测定6个品种澳洲坚果果皮中的主要功能成分含量发现,自选品种“南亚2号”果皮中的粗蛋白、可溶性总糖和单宁含量最高;张明等[4]优化了超声辅助提取澳洲坚果青皮总酚工艺条件等。有研究表明,澳洲坚果青皮中含有丰富的酚酸类物质。酚酸类化合物是一种以碳为基础经苯丙烷类代谢途径合成的仅含1个苯环的次生代谢物[11],主要分为羟基苯甲酸类和羟基肉桂酸类两类[12],广泛存在于植物中。随着对酚酸类化合物的研究深入,发现其中的阿魏酸具有抗氧化、抗肿瘤、消炎杀菌等多种药理学作用[13],豆腐果苷具有抗抑郁、安神、镇痛等作用[14];熊果苷可通过抑制人体内络氨酸酶形成来阻止黑色素生成,是当今流行的较安全的美白原料,也是理想的皮肤美白祛斑活性剂,主要用于高级化妆品制备[15]等。酚酸类化合物不能由人和动物体自身合成,只能从植物中提取,对澳洲坚果果皮中酚酸类物质组分及含量的研究鲜见报道。本研究以O.C.澳洲坚果为试材,探究不同发育时期其果皮酚酸类物质组分及含量的变化情况,以期对澳洲坚果果皮活性物质开发和利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

在云南省永德县大雪山乡澳洲坚果种植基地,北纬24°02′,东经99°44′,O.C.澳洲坚果选长势良好,叶片无病虫害植株,分别采集花后30、60及90 d果实,每个时期采集3株,即重复3次,用0 ℃冰盒带回实验室,洗净并剥取果皮(青皮),分别标记为S1、S2和S3样品,液氮速冻后保存于-80 ℃超低温冰箱备用。试剂包括甲醇Merck、乙腈Merck、标准品BioBioPha等,均为色谱纯。仪器包括冻干机,Scientz-100F;孔径0.22 μm微孔滤膜;研磨仪,MM400,Retsch;色谱柱,Waters ACQUITY UPLC HSST3 C18( 1.8 μm,2.1 mm×100 mm);超高效液相色谱,Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A;串联质谱,pplied Biosystems 4500 QTRAP等。

1.2 方法

S1、S2和S3样品分别冻干机处理后,在研磨仪(30 Hz)中研磨1.5 min成粉末状后称取样品(100±0.1) mg,在70%甲醇1.2 mL提取液中溶解,每间隔30 min涡旋1次,每次30 s,共6次后,放置于4 ℃冰箱中过夜;设置离心机转速为12 000 rpm,离心过夜样品10 min,提取上清液使用微孔滤膜过滤后,保存于样瓶中备用。

利用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)方法分析备用样品代谢产物。液相条件:色谱柱,Agilent SB-C18 1.8 μm,2.1 mm×100 mm;A相,超纯水+0.1%甲酸;B相,乙腈+0.1%甲酸;洗脱梯度,A相在0.00 min时比例为95%;0.00～9.00 min时比例从95%降至5%;在10.00～11.10 min时,A相比例从5%升至95%;在11.10～14.00 min以95%平衡;流速0.35 mL/min;柱温40 ℃;进样量4 μL。质谱条件:电喷雾离子源(ESI),温度550 ℃,电压(IS)4 500～5 500 V,离子源气体I(GSI)50,气体II(GSII)60,帘气(CUR)25.0 psi,碰撞诱导电离参数高。

1.3 数据分析

基于自建数据库MWDB(metware database)和公共数据库鉴别代谢物,在得到不同样本的代谢物质谱分析数据后,用主成分分析(PCA)、聚类热图以及火山图初步探析3个发育时期果皮的代谢特征,运用多元分析处理软件对差异代谢物进行筛选和分析。

2 结果与分析

2.1 果皮差异代谢物的PCA图及聚类热图

由图1看出,样本S1-3分布于第一象限,S3-2、S2-1、S2-2、S1-1分布于第二象限,S2-3、S3-3分布于第三象限,S3-1、S1-2分布于第四象限。其中S3样本组内分离较大,且S3样本与前两个时期样本均出现聚拢现象,说明不同时期产生的代谢物有关联性也有差异性。利用图2聚类热图进一步分析发现,S3-1与S1-2、S3-3与S2-3、S3-2与S2-1样本中的代谢物质关联性较大,因此在S1与S3及S2与S3两组处理中筛选差异代谢物。

注:S1、S2、S3分别表示花后30、60及90 d果实果皮(青皮)样品。图2至图4同。图1 不同发育时期澳洲坚果果实果皮样本代谢物主成分分析

注:深色表示含量高,浅色表示含量低。图2 不同发育时期澳洲坚果果实果皮样本代谢物聚类

2.2 差异代谢物质筛选

从3个不同发育时期果皮中共检测到酚酸类差异代谢物114种,有56种物质差异表达显著。由图3看出,将3个不同发育时期果皮样品进行两两分组试验,样品S1和S2对比,显著差异代谢物有32种;相对S1而言,S2有25种成分呈下调表达,7种成分呈上调表达。样品S2和S3对比,显著差异代谢物有32种,相对S2而言,S3有2种成分呈下调表达,30种成分呈上调表达。样品S1和S3对比,显著差异代谢物有23种,相对S1而言,S3中有5种成分呈下调表达,18种成分呈上调表达。说明花后30～60 d,呈下调表达的代谢物质种类多,上调表达的代谢物质种类较少;而花后60～90 d,上调表达的代谢物质种类增多。

注:a为S1与S2对比,b为S2与S3对比,c为S1与S3对比。图3 不同发育时期澳洲坚果果实果皮差异代谢物火山图

2.3 差异代谢物质分析

2.3.1 共有显著差异代谢物 由图4看出,3个时期果皮样品中共有显著差异代谢物质1种,根据韦恩图各处理中差异代谢物分布发现该物质为绿原酸(3-O-咖啡酰奎宁酸)。该物质S1中含量最高,达到188 328.50 μg/g,S2中含量最低。说明花后30～90 d,共同差异物--绿原酸 (3-O-咖啡酰奎宁酸)含量呈先下降后上升。

注:3个圈重叠部分表示各处理间共有显著差异代谢物数量,无重叠部分表示各处理特征差异代谢物数量。图4 不同发育时期澳洲坚果果实果皮代谢物差异韦恩图(左)及绿原酸 (3-O-咖啡酰奎宁酸)含量比较(右)

2.3.2 特征代谢物分析 由表1看出,基于OPLS-DA模型所得VIP值≥1.0和FC值≥2.0 (上调)或≤0.5 (下调),筛选不同处理间差异代谢物,得到主要功能物质18种,它们在不同时期果实果皮中的相对含量不同。S1处理中1-O-对香豆酰-β-D-葡萄糖、绿原酸(3-O-咖啡酰奎宁酸)、3,4,5-三甲氧基苯基-1-O-葡萄糖苷等含量最高。S3处理中熊果苷、水杨酸、龙胆酸、豆腐果苷、红景天苷、3,4-二没食子酰莽草酸、6′-咖啡酰熊果苷、原儿茶酸等含量最高;其中6′-咖啡酰熊果苷和3,4-二甲氧基肉桂酸为S3中标志性物质。熊果苷、熊果苷衍生物、水杨酸等物质具有祛除黑色素,美白的作用,可作为美妆产品的加工原料;肉桂酸衍生物、龙胆酸、绿原酸、莽草酸及其衍生物等可用于抗菌、抗炎药物开发;豆腐果苷及其衍生物可作为抗抑郁的新型药物原料;阿魏酸及其衍生物可用于开发制作保护大脑神经元类药物。

表1 不同发育时期澳洲坚果果实果皮特征代谢物比较

3 讨论与结论

本试验通过代谢组学对花后3个时期的澳洲坚果果实果皮酚酸类物质进行分析比较,共检测到酚酸类代谢物114种,筛选出主要功能物质18种。共有差异代谢物中,绿原酸 (3-O-咖啡酰奎宁酸)、1-O-对香豆酰-β-D-葡萄糖、3,4,5-三甲氧基苯基-1-O-葡萄糖苷等含量在整个发育时期均较高,在不同样品中含量从高到低依次为S1>S3>S2。熊果苷、豆腐果苷、6′-咖啡酰熊果苷、6′-对香豆酰熊果苷、没食子苯乙酮、3,4-二甲氧基肉桂酸等在S3中含量较高;其中6′-对香豆酰熊果苷和3,4-二甲氧基肉桂酸为S3的标志性化合物。

酚酸类物质透过细胞膜进入植物机体,从而改变某些酶活性和功能。绿原酸、咖啡酸、儿茶酚等能抑制植物磷酸化酶活性[37]。随着果实发育,绿原酸等物质含量降低,有利于其各种生理活动,如呼吸作用和光合作用等。1-O-对香豆酰-β-D-葡萄糖、3,4,5-三甲氧基苯基-1-O-葡萄糖苷在整个发育时期均为高含量,为生长发育提供代谢原料。

本试验结果表明,不同发育时期澳洲坚果果实果皮所产生的酚酸类代谢种类及含量不同,检测到多种具有药理作用的物质,而且含量较高,如熊果苷及熊果苷衍生物、豆腐果苷、豆腐果醇苷等。刘晓婷[19]等综述了熊果苷的药理作用及其机制,发现熊果苷有抑制黑色素、镇痛抗炎抑菌、抗癌等药理作用。刘萍等[51]研究表明,豆腐果苷及其衍生物具有止痛、镇静、抗炎、安眠、抗抑郁等药理活性作用。有望从澳洲坚果果实果皮中提取这些物质并加以应用,这为澳洲坚果果皮的开发利用提供了新思路。