GC-MS法测定舒更葡糖钠中基因毒性杂质二甲氨基甲酰氯

丁倩倩 唐新茹 张昌浩▲ 黄晓光 王 雪 孙 雪 杨 慧

1.延边大学药学院，吉林延吉 136200；2.吉林省博大伟业药物研究有限公司，吉林长春 130000

舒更葡糖钠（sugammadex sodium）是一种改良的新型γ-环糊精，是首个可以在全身麻醉期间逆转神经肌肉阻滞的选择性松弛结合剂，其作用机制是通过包裹罗库溴铵的环戊烷过氢菲环使其失活，从而发挥神经肌肉阻滞的逆转作用[1-3]。2005年，荷兰的Organon Biosciences公司首次报道了有关舒更葡糖钠的临床使用；2008年7月，由默沙东公司研发的舒更葡糖钠注射液（商品名：Bridion）宣布在欧洲批准上市，而中国也在2017年4月获批准上市，并在临床开始应用[4-5]。

二甲氨基甲酰氯是在合成舒更葡糖钠的工艺中由所参与的主要原料氯化剂（如草酰氯、磷酰氯、亚硫酰氯）和N，N-二甲基甲酰胺（N，N-Dimethylformamide，DMF）经Vilsmeier反应形成的一种基因毒性杂质，属于2A类致癌物[6]。基因毒性杂质是一种可使DNA被直接或间接破坏导致突变、重组及染色体断裂，最终致癌变及致突变性的物质，具有较低的安全阈值，低浓度时便可产生严重的致癌风险[7-11]。因此，建立一种能对舒更葡糖钠中的二甲氨基甲酰氯残留量进行准确检测的方法是必要的。根据人用药品注册技术要求国际协调会（International Conference on Harmonization，ICH）M7指南[12]来确定二甲氨基甲酰氯的限度，得到二甲氨基甲酰氯的TD50数值为0.625 mg/（kg·d），而舒更葡糖钠的最大日剂量（以舒更葡糖钠活体计）为16 mg/（kg·d），经计算后得到舒更葡糖钠中遗传毒性杂质二甲氨基甲酰氯的限度为0.000 07%。根据其限度较低，对仪器的灵敏度要求更严格，常规的气相色谱、液相色谱等难以准确检测，故本研究采用灵敏度高、定量分析准确、检测限较低、选择性高的气相色谱-质谱联用技术（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）对舒更葡糖钠中的二甲氨基甲酰氯进行检测，可以较好地达到基因毒性杂质痕量分析的要求，以便降低生产成本及提高药品的质量[13-16]。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

7010B-8890气相色谱-质谱联用仪（Agilent公司）；VF-624ms毛细管色谱柱（Agilent公司）；BT-125D型电子天平（Sartorius公司）。

1.2 试剂

乙醚（色谱纯，成都科隆化工公司）；二甲氨基甲酰氯（批号：16-Nov-LD17-1-06，Lovan Research chermical 公司）；舒更葡糖钠（批号：2206001、2206002、2207001，吉林省博大伟业制药有限公司）。

2 方法与结果

2.1 GC-MS条件

2.1.1 色谱条件 毛细管柱为VF-624ms（30 m×0.25 mm，1.4 μm），载气为氦气，柱流量为1.5 ml/min；进样口温度200℃，进样体积为1 μl；初始柱温为40℃，维持2 min；以20℃/min升至250℃，维持8 min。

2.1.2 质谱条件 采用电离源EI，离子源温度250℃，传输线温度250℃，四级杆温度150℃，电离电压70 ev，碰撞器为氮气，溶剂延迟 5 min，采集模式为SIM模式，二甲氨基甲酰氯的采集离子为107。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取二甲氨基甲酰氯20 mg，用乙醚稀释成每1 ml中含二甲氨基甲酰氯约0.2 mg的溶液，摇匀后即可得到二甲氨基甲酰氯对照品母液。量取母液40 μl置100 ml容量瓶中，用乙醚稀释至刻度，摇匀后即可得到80 ng/ml的二甲氨基甲酰氯对照品储备液。取储备液适量，用乙醚稀释成每1 ml中含二甲氨基甲酰氯40 ng的溶液即为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取舒更葡糖钠575 mg于10 ml量瓶中，加乙醚稀释至刻度，振摇并用玻璃离心管离心，作为供试品溶液。

2.2.3 混标溶液的制备 精密称取舒更葡糖钠575 mg于10 ml量瓶中，加入二甲氨基甲酰氯对照品储备液适量，用乙醚稀释成每毫升中含二甲氨基甲酰氯40 ng的混合溶液，振摇并用玻璃离心管离心即可。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性考察 分别精密量取配制好的供试品溶液、二甲氨基甲酰氯的对照品溶液、混标溶液及乙醚各1 μl进样测定，得到色谱图（图1～4）。结果表明，采用上述色谱条件测得的二甲氨基甲酰氯，其保留时间为7.636 min，分离度好，相邻杂质峰不对其干扰，且空白溶剂、舒更葡糖钠不干扰二甲氨基甲酰氯的检测，故方法的专属性较好。

图1 空白溶剂乙醚的GC-MS色谱图

图2 二甲氨基甲酰氯对照品溶液的GC-MS色谱图

图3 供试品溶液的GC-MS色谱图

图4 混标溶液的GC-MS色谱图

2.3.2 检测限和定量限试验 取二甲氨基甲酰氯对照品储备液适量，用乙醚稀释成合适的浓度，按规定的色谱条件测定，当主成分信噪比约为10∶1的进样浓度为定量限，信噪比约为3∶1时的进样浓度为检测限，测定结果表明二甲氨基甲酰氯的检测限为4.04 ng/ml，定量限为8.08 ng/ml。

2.3.3 线性关系考察 取对照品储备液，精密量取1.0、2.5、4.0、5.0、6.0和7.5 ml各置于10 ml量瓶中加乙醚稀释至刻度，再分别精密量取稀释后的溶液及对照品储备液各1 μl进样测定，得到色谱图，横坐标为二甲氨基甲酰氯的浓度，纵坐标为其峰面积，进行线性回归，得到二甲氨基甲酰氯的线性回归方程为：Y=49 368X-41 838，相关系数r=0.9999。所得结果表明当进样量为1 μl时，二甲氨基甲酰氯在8.08～80.80 ng/ml的范围内，其浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.4 精密度试验 取对照品溶液，按照设定的色谱条件连续测定6次，记录色谱图，测得二甲氨基甲酰氯峰面积的RSD值为3.30%（n=6）。

2.3.5 重复性试验 取舒更葡糖钠约575 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加乙醚稀释至刻度，振摇后用玻璃离心管离心，配置6份为供试品溶液；另取对照品溶液，分别精密量取1 μl进样测定，记录谱图，按外标法计算舒更葡糖钠中二甲氨基甲酰氯的残留量，结果显示，经6次测定均未检出二甲氨基甲酰氯。

2.3.6 回收率试验 取舒更葡糖钠约575 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，分别加入对照品储备液2.5、5.0、7.5 ml，用乙醚稀释至刻度，振摇后用玻璃离心管离心，各制备3份，作为低、中、高三种浓度的溶液（分别为限量浓度的50%、100%、150%），另按上述方法制备对照品溶液，各1 μl进样测定，计算回收率。测定结果见表1，结果表明，通过9份样品测定所得二甲氨基甲酰氯的平均回收率为100.91%（RSD=2.92%），故回收率符合要求。

表1 二甲氨基甲酰氯回收率试验结果（n=9）

2.3.7 稳定性考察 取供试品溶液置于室温下，分别放置0、2、4、6、8 h后，精密量取1 μl测定，按外标法以峰面积计算供试品溶液中二甲氨基甲酰氯的含量。结果表明，经8 h的测定二甲氨基甲酰氯均呈未检出的状态，故溶液稳定性良好。

2.3.8 耐用性试验 变动色谱条件各参数[初始温度（40±2）℃、柱流速（1.5±0.1）ml/min]，分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各1 μl测定，记录色谱图。结果显示，供试品溶液在各参数条件下均未检出二甲氨基甲酰氯，故色谱参数的微小变化对二甲氨基甲酰氯的检出不影响，耐用性良好。

2.3.9 样品测定 取3批舒更葡糖钠，配成供试品溶液，按规定的色谱条件进样，结果见表2，表明3批舒更葡糖钠中均未检出二甲氨基甲酰氯，符合二甲氨基甲酰氯限度不超过0.000 07%的要求。

表2 3批样品二甲氨基甲酰氯测定结果

3 讨论

在摸索色谱条件时，发现采用预设的5∶1的分流比进样，色谱峰的响应值达不到要求，而不分流进样时其质谱峰的响应值高，故本研究最终不采取分流进样。此外本研究还考察了不同的毛细管柱（VF-624ms、VF-WAXms）对二甲氨基甲酰氯检测的影响，结果发现VF-WAXms毛细管柱检测出的二甲氨基甲酰氯峰型不好，响应值也较低，而VF-624ms型毛细管柱检测出的峰型对称且分离度好，故最终采用该毛细管柱。

实验操作过程中，本研究发现塑料制品（塑料滴管、塑料离心管）的使用会导致检测时色谱图的主峰附近出现杂峰且分离度不符合要求，从而干扰检测结果，故实验全程使用玻璃制品（玻璃滴管、玻璃离心管）以避免干扰。

溶剂的确定，预实验时筛选了舒更葡糖钠与二甲氨基甲酰氯都能溶解的水溶剂，但其结构中的酰氯键（-COCl）遇水不稳定易断裂，又考察了乙醚、乙腈、醇类等有机溶液，结果表明二甲氨基甲酰氯在乙醚中的溶解度较好且稳定性最佳，同时由于采用的GC-MS较灵敏，故优先选择色谱纯的乙醚。

本研究采用GC-MS建立了有效测定舒更葡糖钠中基因毒性杂质二甲氨基甲酰氯的方法，并经方法学验证，相较于单一的气相色谱，灵敏度得到提高、专属性和耐用性更好以及检测时无干扰，可以较好地达到基因毒性杂质痕量分析的要求，可为舒更葡糖钠中有关基因毒性杂质及其他药物中二甲氨基甲酰氯的测定提供借鉴。但由于GC-MS仪器较贵，无法在药厂车间普及，且对仪器使用人员的要求较高，故存在一定的局限性。