市政污泥中抗生素检测方法研究进展

郑昌萍，马继平

（青岛理工大学环境与市政工程学院，山东青岛 266525）

随着我国城市化进程的快速推进，污水处理行业取得了迅猛的发展。伴随着这一发展趋势，污泥作为污水处理的副产物，其产量也在逐渐增加[1]。数据显示，截至2019 年我国污泥产量已超过6 000万t (以含水率为80%计)[2]。预计至2025年，污泥年产量将突破9 000 万t。近年来，我国对污泥无害化处理的重视度不断提高，然而污泥成分十分复杂，除含有大量重金属、有机物、细菌、病毒和寄生虫卵外，还检测出了多种新污染物。新污染物是指环境中未被列入常规监测系统，但具有危害生态环境和人类健康的化学或生物污染物。常见的新污染物虽然在环境中的浓度较低，但具有多种危害性，包括生殖和发育毒性、免疫毒性、内分泌干扰效应、致癌性和致畸性等。此外，这些污染物还表现出明显的生物富集性、难以监测等特征，对人体健康和生态环境都带来了风险。常见的新污染物有内分泌干扰物、药物和个人护理品、全氟化合物、新型消毒副产物和微塑料。其中，药物和个人护理品中的抗生素近年来受到人们的广泛关注。

抗生素是保护人类和动物免受细菌引起的感染和疾病的常用药物，其使用范围已扩展至医疗护理[3]、水产养殖[4]、畜牧业[5]和兽药[6]等领域。据报道，从2000 年到2015 年，全球抗生素的消费量增加了65%，如果以同样的消费趋势继续下去，到2030 年其消费量将比2015 年高出200%[7]。进入体内的抗生素仅有一小部分发挥作用，超过一半的抗生素会被人类和动物以尿液和粪便的形式排出体外进入污水处理厂[8]。

市政污泥中检测出的抗生素主要有四环素类[9]、氟喹诺酮类[10]、磺胺类[11-12]和大环内酯类药物，因为它们广泛用于家庭、农场和水产养殖。氟喹诺酮类药物的检出浓度(以质量分数表示，下同)最高，偶尔达到数百mg/kg。四环素类和大环内酯类药物的浓度变化超过4 个数量级，最高浓度达到几mg/kg。磺胺类药物和其它抗生素的浓度较低，最高浓度在数百µg/kg的范围内[13]。若污泥处置不当，其中的抗生素可能会进入环境土壤中，并且可以通过径流进入地表水，浸出到地下水中，或者被植被和其它生物体吸收，从而可能引起细菌耐药性等一系列问题[14]，降低人类和动物对病原体的治疗潜力。近年来，关于抗生素的毒性研究不断增加。例如，抗生素可以改变细菌的结构、组成以及功能特性[15]；四环素可以诱导鲤鱼胚胎致畸，90 µg/L的含量致畸率就达到了43.3%[16]；抗生素还可以通过母乳传播给婴儿，对婴儿肠道微生物群的发育产生负面影响[17]。因此，检测和分析污泥中的抗生素水平对于评估抗生素暴露和潜在风险，选择最佳的污泥资源化方法至关重要。

市政污泥基质十分复杂，在环境分析中通常需要严格的样品制备以获得可检测的目标分析物。目前，污泥处理方法主要包括超声辅助提取(UAE)、加速溶剂萃取(ASE)、基质固相分散法(MSPD)、固相萃取(SPE)、分散固相萃取法(DSPE)以及在线固相萃取(Online SPE)等，抗生素的仪器检测方法主要是液相色谱法(HPLC)和液相色谱质谱联用法(HPLC-MS/MS)，其中，HPLC-MS/MS 应用更为广泛。近几年关于抗生素相关综述多侧重报道抗生素的耐药性[18]，抗生素的抗性基因[19]以及水体[20]、畜禽粪便中[21]抗生素的空间分布[22]和抗生素的风险控制[23]。笔者对市政污泥中抗生素的样品处理方法和仪器检测方法进行综述，并对该领域未来发展进行展望。

表1 列出了文献报道的污泥中主要抗生素种类、样品处理方法、检测方法及检出限、精密度和加标回收率。

表1 污泥中抗生素的分析方法、样品处理方法、检测方法及检出限、精密度和加标回收率

1 样品处理方法

污泥样品中污染物的种类很多，组成十分复杂，有些待测物质浓度往往很低，难以直接测定，因此在仪器检测之前往往需要对污泥进行一系列处理，以达到污泥中抗生素的提取、净化和富集。

1.1 提取

1.1.1 超声辅助提取(UAE)

超声辅助提取应用广泛，它能够缩短提取时间并提高提取效率。影响提取效率的主要因素是萃取溶剂和提取时间。在酸性和碱性条件下具有不同极性、溶解度、酸度系数(pKa 值)、正辛醇-水分配系数(Kow值)和稳定性的多类化合物可能严重影响萃取效率和后续分析。因此，从固体基质样品中提取抗生素的溶剂应根据化合物的理化性质进行选择。Tian等[24]在检测活性污泥中3种磺胺类、2种氟喹诺酮类和2 种四环素类抗生素时，优化了超声辅助提取的关键步骤，萃取剂为15 mL 有机萃取剂(甲醇-乙腈-乙酸乙酯，体积比为1∶1∶2)和15 mL水萃取剂(含有0.001 mol/L Na2EDTA 的0.2 mol/L NaH2PO4，pH=3)，超声时间为20 min，提取液通过固相萃取净化富集后检测，优化后的方法回收率为82.8%～130.1%。此方法所需样品量少(0.1 g 污泥)，回收率高，准确度和精密度较好，适合污泥一类较为复杂的基质。

1.1.2 加速溶剂萃取(ASE)

加速溶剂萃取是通过在较高压力下使溶剂的温度超过其常压下的沸点，以提高提取效率。萃取温度的增加可以提高分析物的溶解度和传质速率，提高萃取效率。在ASE 中，要考虑的主要参数是温度、压力、提取时间和循环次数。污泥中抗生素的萃取温度通常为50～110 ℃，最常用的温度为100 ℃。温度过高可能导致目标分析物热降解，并导致基质组分提取率更高，影响分析过程中方法的准确性和灵敏度。一般情况下提取压力为10.34 MPa，静态提取时间通常设定为5～15 min，研究的周期数为2～5个周期。例如Ezzariai[25]等在检测初级污泥堆肥产物中的大环内酯类、四环素类和氟喹诺酮类化抗生素时最终确定在100 ℃，6.89 MPa下萃取15 min，循环3 次。与超声辅助提取相比，两者所需浸提溶剂体积相当，但ASE 提取效率更高。此外，ASE 还具有高水平的自动化和同时提取多个目标分析物的能力。

1.1.3 基质固相分散法(MSPD)

MSPD 是将固相吸附材料直接加入样品基质中，使用机械混合后的材料填充柱子，洗脱后的溶液直接进行浓缩检测的方法。该方法操作简单，既可以提取也可以净化目标分析物。在MSPD提取过程中最重要的是吸附剂和洗脱剂的选择。Ⅴosoµgh等[26]为获得最佳的提取效果，对比了多壁碳纳米管作分散剂、二氧化硅作吸附剂以及纳米二氧化硅作分散剂、C18作吸附剂两种MSPD 提取方式，发现纳米二氧化硅颗粒易导致液相色谱柱前堵塞，所以最终选择了多壁碳纳米管-二氧化硅的方法提取污泥中的3 种磺胺类抗生素。李明月等[9]对比了UAE、ASE和MSPD提取污泥中4种磺胺类、3种氟喹诺酮类、1种四环素类抗生素的方法，结果显示MSPD表现出最佳的抗生素回收率，其中氧四环素的回收率为114.73%。虽然MSPD 技术具有快速、简便和灵敏的优点，但目前用其提取净化污泥样品的相关文献较少，因为它可能无法有效地去除干扰物，并且可能会导致目标化合物的损失或降解。

1.2 净化富集

净化和富集是污泥中抗生素定量研究的必要步骤。污泥中干扰物多，药物浓度低，净化和富集可以降低干扰物的影响，减小基质效应，提高目标分析物的浓度和检测灵敏度。

1.2.1 固相萃取(SPE)

固相萃取是一种常用于污泥中抗生素净化富集的方法，它基于液相色谱的选择性吸附和选择性洗脱原理进行分离。该方法具有高选择性、良好的重复性以及简单的样品处理过程，是一种较好的分离干扰物净化富集样品的方法。选择合适的萃取柱是净化富集样品的关键。Oasis HLB小柱是一种基于亲水性和疏水性材料混合而成的高效固相萃取材料，具有极好的萃取特异性。由于抗生素在污泥中的含量较低，而且受复杂基质干扰严重，因此使用Oasis HLB 小柱可以提高方法的灵敏度和精确度。该方法与液体基质的固相萃取步骤相同，稀释的萃取液通过Oasis HLB 小柱后，抗生素被富集到小柱上，再用溶剂清洗小柱以去除杂质，弃去流出液，萃取柱真空干燥后用洗脱剂洗脱目标分析物，洗脱液浓缩后用于检测分析。宋淑敏等[29]采用该方法净化富集污泥中的3种磺胺类、3种四环素类、3种氟喹诺酮类和3 种大环内酯类抗生素，并考察了不同体积(6、8、10、12 mL)的甲醇作洗脱液时对净化效果的影响。结果表明，不同体积的甲醇对不同种类抗生素洗脱作用不同，当甲醇体积大于8 mL 时，洗脱液中的杂质洗脱量增大。这可能是因为甲醇作为洗脱液时，其极性相对较强，能够与样品中的极性物质发生较强的相互作用，使得这些物质在柱上停留时间较长，难以被洗脱。而甲醇体积较大时，其溶解能力也相应增强，可以更好地溶解样品中的杂质物质，并将其带出色谱柱。

1.2.2 在线固相萃取(Online SPE)

在线固相萃取与HPLC-MS 结合，使整个分析过程能够在封闭系统中进行，减少样品损失，精度高且可重复性好。该分析方法的分析效率高，一般30分钟内即可完成。Sun等[11]建立了在线SPE-HPLCMS 与ASE 相结合的方法用于检测污泥中的1 种β-内酰胺类、2 种氟喹诺酮类、2 种大环内酯类、3 种磺胺类抗生素。实验中提取液直接通过Oasis HLB固相萃取小柱(SPE1 和SPE2)净化富集后进行在线分析。SPE-HPLC-MS 系统包括萃取和解吸两个过程，样品溶液首先由泵C的上样溶剂驱动进入SPE1柱，目标分析物被吸附，同时杂质被泵C输送的洗涤溶剂去除。随后十通阀切换，SPE1柱与HPLC系统连接，SPE1 柱转变为解吸状态，SPE2 柱开始萃取。泵A 和泵B 通过梯度流动相从SPE1 柱中解吸分析物，同时将分析物输送到HPLC 柱中。该方法检出限为1.8～7.9 µg/kg，精密度为70%～130%。

1.2.3 分散固相萃取法(DSPE)

不同于SPE，DSPE是一种将吸附剂直接添加到样品中，使其均匀分散提高吸附效率，该方法不需要使用专用的萃取柱装置，从而简化了样品处理过程。开发高效的吸附剂是提高净化效率的关键，但新材料的应用目前主要集中在液体中的抗生素检测。N-丙基乙二胺(PSA)吸附剂作为一种弱阴离子交换剂，有去除污泥中的脂肪酸、糖、脂质和色素的能力。C18吸附剂是一种疏水反相吸附剂，可通过非极性相互作用去除长链脂肪族化合物和其他非极性干扰物。Ajibola 等[27]比较了PSA 吸附剂和C18吸附剂净化污泥中的3种磺胺类、3种氟喹诺酮类、3种大环内酯类和2 种四环素类抗生素的差异，结果显示用PSA和C18净化污泥中的杂质，大多数抗生素呈现相似的回收率，但磺胺类抗生素的回收率都比较低(小于30%)。Park 等[30]基于快速、简单、廉价、有效、可靠、安全的原则与在线固相萃取联用开发了一种一次测定污水污泥中27种药物和激素的方法，其中包括11种抗生素。该方法可以大大缩短总分析时间，提高预富集效率。实验时，他们对比了添加醋酸钠和不添加醋酸钠对抗生素回收率的影响，结果发现不添加醋酸钠时的回收率更高，这是因为在低pH值下，磺胺类抗生素会被质子化，导致它们之间产生静电排斥，从而有利于磺胺类抗生素与萃取剂结合。

目前，污泥中的抗生素检测通常采用UAE/ASE-SPE 的样品处理方法。对于目标物的萃取要多考虑萃取剂、时间和温度的影响，对于样品的净化富集则主要关注吸附剂和净化柱的选择。

2 检测方法

2.1 高效液相色谱-荧光法

荧光分析作为高效液相色谱的检测器是比紫外检测器灵敏度更高的检测方法，通常高两个数量级。但能够发出荧光的物质很少，因此判断分析物有没有荧光特性并优化荧光检测器参数是荧光检测方法开发过程的重要内容。荧光检测方法优化的最重要的两个参数是确定激发波长和发射波长。戴晓虎等[9]在用荧光检测器检测污泥中4 种氟喹诺酮类抗生素时，因选择某一确定的激发波长和发射波长，会对其它物质检测造成很大影响，所以根据物质出峰时间最终确定了梯度扫描波长。作为高效液相色谱的荧光检测器与紫外检测器相比，选择性更好，测定用的试样量更少。

2.2 液相色谱-质谱法

由于污泥基质复杂，抗生素含量通常是痕量级，因此抗生素的检测通常选用灵敏度很高的液相色谱串联质谱法。研究显示，液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)成为鉴定和定量环境样品中痕量药物的最有效工具，因为与常规液相色谱法(带有紫外或荧光检测器)相比，其具有更高的灵敏度和确定化合物的能力。

2.2.1 液相色谱-三重四极杆-质谱法

液相色谱-三重四极杆质谱仪可以提高方法的灵敏度，已有多项国家标准使用此方法检测化妆品中的抗生素[31-32]，但至今还没有检测污泥中抗生素残留的国家标准。Guironnet 等[33]使用混合三重四极线性离子阱光谱仪对5种痕量β-内酰胺类抗生素进行分析，方法中使用五氟苯基色谱柱，0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸酸化的乙腈作流动相，定量限为0.8～14.7 ng/g。该仪器本质为三重四极杆，其中第三个四极杆可以作为四极杆或离子阱运行，所以灵敏度更高，可以在与传统离子阱相同的离子密度条件下，提取提高一个数量级的检测信号。

2.2.2 液相色谱-飞行时间-质谱法

飞行时间质谱仪分辨率较高，具有连续全谱采集的优势，与四极杆质谱仪相比数据采集效率更高，但线性响应范围不如四极杆质谱仪，目前主要用于定性分析。Nikolopoulou[34]等通过液相色谱-飞行时间-质谱分析法对尼日利亚污水处理厂中的污泥进行了新污染物可疑筛查，其中抗生素在所有检测样品中显示出最高水平，而氧氟沙星的浓度达到了28.4 mg/kg。

2.2.3 液相色谱-静电场轨道阱-质谱法

静电场轨道阱（Orbitrap）检测器与三重四极杆相比灵敏度和分辨率更高，特别是在进行多反应监测和结构鉴定时更具有优势。线性离子阱质谱耦合可对基质中的各种分析物进行灵敏和选择性的靶向分析，即使在具有相似质量的内源性基质组分可能共洗脱的情况下，也可以提供高分辨率和高质量精度。Miserli 等[12]采用超声-DSPE-HPLC-Orbitrap-MS/MS 法检测了污泥中含量为ng/g 级的5 种痕量磺胺类抗生素和1种β-内酰胺类抗生素。实验中使用C18液相色谱柱，流动相由溶剂A[含0.1%(体积分数)甲酸的水]以及溶剂B[含0.1%(体积分数)甲酸的甲醇]组成。方法回收率为71%～90%，其中抗生素卡马西平检出限为0.3 ng/g，回收率为74%～88%。

现阶段，可以根据不同的样品处理方法选择合适的仪器对污泥中的抗生素进行测定。对于能够发出荧光的物质，可以选择液相色谱-荧光法；对于抗生素的定性鉴定及定量分析通常选择液相色谱-质谱法。选用质谱作检测器时，三重四极杆可以提高方法的灵敏度，但当它无法精确区分靶标和干扰物时，可能会出现假阳性；飞行时间线性响应范围相对较窄，主要用于定性分析；Orbitrap灵敏度和分辨率较高，但设备维护和背景校正要求高。因此，可以根据抗生素的含量、性质和干扰物等因素综合选择合适的检测器。

3 结语

抗生素作为一种抗菌性药物使用广泛，但因其大部分不能被人体和动物体吸收利用而排出体外，导致市政污泥的无害化处理面临挑战。因此，建立污泥中抗生素的分析方法对选择最佳的污泥处置方式具有重要意义。目前新方法新技术的应用还未在污泥中实现，例如基于新型吸附材料开发的磁性固相萃取技术主要用于液体基质中抗生素的检测，基于分子印迹的固相萃取技术实现了在固体基质中的抗生素检测。所以在此基础上，开发具备高富集能力和高选择性的吸附材料用于构建分析复杂固体基质的高效、绿色、低成本、操作简单的样品处理方法是未来这一领域的发展方向。除此之外，抗生素的处理过程需要先从污泥中提取再进行净化，步骤繁琐而且分析效率低，所以开发集提取、净化、浓缩和检测的自动一体化设备是未来设备研发的一个发展方向。液相色谱能够用于测定抗生素的总含量，而液相色谱-质谱技术有助于多种抗生素的定性定量分析。将新型样品处理方法和适当的仪器检测方法结合，构建快速、高效、准确的抗生素分析方法对研究污泥一类复杂基质中抗生素的迁移规律提供理论支撑，为评估抗生素的健康风险、改善污泥中抗生素的管控效果和污泥资源处置化方案提供参考。