高效液相色谱-串联质谱法同时测定婴幼儿化妆品中12种防腐剂

2023-12-07邢海艳李超鲁素雅刘洋

化学分析计量 2023年11期

邢海艳，李超，鲁素雅，刘洋

［1.淮安市食品药品检验所，江苏淮安 223005； 2.凯莱英生命科学技术（天津）有限公司，天津 300457］

为了延长使用期限，化妆品中通常会添加防腐剂以抑制微生物的生长。《化妆品安全技术规范》(2015年版，以下简称“规范”)中明确规定了51种可供使用的防腐剂及其最大使用量，同时还规定了限用物质[1]。卡松是甲基氯异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮与氯化镁和硝酸镁的混合物，其中甲基氯异噻唑啉酮与甲基异噻唑啉酮的质量比为3∶1，规范中规定甲基异噻唑啉酮的限量(质量分数，下同)为0.01%，卡松只能用于淋洗类产品，使用限量为0.015%，并且与甲基异噻唑淋酮不能同时使用。甲基氯异噻唑啉酮与甲基异噻唑啉酮均有较强的致敏性，超量使用会导致接触性皮炎[2]。有研究表明，卡松与对羟基苯甲酸酯类配合使用效果更佳[3-4]，对羟基苯甲酸酯类化合物是化妆品中使用率前三位的防腐剂之一[5]，对羟基苯甲酸酯类防腐剂复合使用抑菌能力明显高于单酯[6]，但也有文献报道此类化合物有类似雌激素作用[7-10]。规范中规定4-羟基苯甲酸甲酯和4-羟基苯甲酸乙酯的使用限量为0.4%，4-羟基苯甲酸丙酯和4-羟基苯甲酸丁酯的使用限量为0.14%(质量分数，均按4-羟基苯甲酸计，下同)，联合使用总限量为0.8%。

有报道婴幼儿化妆品的标签与实际检出防腐剂不符合的情况和甲基异噻唑啉酮和卡松使用不符合规定等问题[11-13]，这两类化合物的常见检测方法有高效液相色谱法[1]、气相色谱-质谱法[14]、高分辨率质谱法[15]，同时检测卡松及对羟基苯甲酸酯类的报道较少[16-17]，规范的液相色谱检测的灵敏度较低，其中甲基氯异噻唑啉酮定量限与限度值接近，未能避免检测不准或假阳性的现象，因此笔者建立灵敏度更高的超高效液相色谱-质谱联用法，同时测定甲基氯异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉啉酮、4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯甲酸乙酯、4-羟基苯甲酸丙酯、4-羟基苯甲酸丁酯、4-羟基苯甲酸异丙酯、4-羟基苯甲酸异丁酯、4-羟基苯甲酸戊酯、4-羟基苯甲酸苯酯、4-羟基苯甲酸苄酯等12 种防腐剂，为市场监管提供技术与数据支持。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Waters acquity型，美国Waters公司。

质谱仪：AB QQQ 4000+型，上海爱博才思分析仪器贸易有限公司。

超声清洗仪：KQ-250DⅤ型，昆山市超声仪器有限公司。

超纯水机：美国密理博公司。

有机系针筒式微孔滤膜：0.45 μm，上海安谱公司。

电子天平：XS205D 型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

乙腈、甲醇、甲酸：均为色谱纯，德国默克公司；

化妆品样品：均为市售的儿童化妆品。

12种防腐剂标准物质：基本信息见表1。

表1 12种防腐剂标准物质信息

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱仪

色谱柱：飞诺美Kinetex®C18色谱柱(100 mm ×2.1 mm，1.7 μm，天津博纳艾杰尔科技有限公司)；流动相：A 相为0.1%(体积分数)甲酸溶液，B 相为乙腈，按表2 程序进行梯度洗脱，流量为0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样体积：2 μL。

表2 梯度洗脱程序

1.2.2 质谱仪

电喷雾离子(ESⅠ)源；多反应监测(MRM)模式；碰撞气：氮气，压力68.95 kPa；气帘气：氮气，压力206.85 kPa；雾化气：氮气，压力379.225 kPa；辅助气：氮气，压力379.225 kPa；毛细管电压：5 000 Ⅴ；雾化温度：500 ℃；12种目标物质谱分析参数见表3。

表3 12种防腐剂质谱分析参数

1.3 溶液配制

分别称取12 种防腐剂标准物质各10 mg，加入甲醇溶解并稀释，制成质量浓度均为0.1 mg/mL 的标准溶液。再分别取各标准溶液1 mL，置于同一100 mL容量瓶中，用甲醇稀释、定容，制成各组分质量浓度均为1 μg/mL的混合标准溶液。依次移取上述混合标准溶液0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1 mL，分别置于7 只10 mL 容量瓶中，用甲醇配制成各目标物质量浓度均分别为1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/L的系列混合标准工作溶液。

1.4 样品处理

取化妆品样品0.20 g，置于25 mL 具塞试管中，加入甲醇20 mL，超声提取20 min，放冷，稀释至25 mL，混匀后，用0.22 μm 有机滤膜过滤，取续滤液待测。

1.5 样品测定

取1.4处理的样品溶液与1.3处理的系列混合标准工作溶液注入高效液相色谱-串联质谱仪，按照1.2仪器工作条件检测，建立各化合物的线性方程并对样品中的化合物进行含量计算。

2 结果与讨论

2.1 溶剂的选择

分别比较乙腈、甲醇、50%乙腈水溶液、50%甲醇水溶液和先用1 mL 饱和氯化钠溶液分散后再加入甲醇等作为提取溶剂时12种目标物的回收率，每种提取溶剂均进行6次平行试验，结果见表4。

表4 不同提取溶剂时的回收率(n=6) %

由表4可知，甲基异噻唑啉酮不易溶于乙腈，回收率仅为16.62%，因此乙腈不宜作为提取溶剂；使用饱和氯化钠溶液分散后再加入甲醇作为提取溶剂时，甲基氯异噻唑啉酮回收率为69.47，回收率较低；使用甲醇、50%甲醇水溶液、50%乙腈水溶液等3种溶剂提取时，各化合物的回收率均大于75.0%，比较理想，因此选取以上三种溶剂开展基质效应研究。

2.2 基质效应

选取洗护类、膏霜类两种不同基质的阴性样品，按照1.4 方法分别制备空白基质溶液。用空白基质溶液配制基质匹配的系列混合标准溶液，按仪器工作条件测定，并绘制校准曲线。将基质匹配的校准曲线的斜率(k1)与相对应的甲醇、50%甲醇水溶液、50%乙腈水溶液配制的标准曲线的斜率(k2)进行比较，斜率的比值见表5。斜率比值越接近1，说明基质效应越小。由表5 可知，不同溶剂提取洗护类样品中的基质均对4-羟基苯甲酸戊酯的影响有抑制作用，且抑制较强，其它组分影响较小；甲醇提取时，除了4-羟基苯甲酸戊酯外，各组分斜率比值为0.81～1.11，说明该处理方法在测定膏霜类质地样品中12种防腐剂时基质效应较小，可不予考虑，因此可直接采用不含基质的混合标准溶液进行定量分析，在检测洗护类产品时可使用配制相对应的基质标准溶液。

表5 使用不同溶剂时校准曲线斜率与标准曲线斜率的比值

不同溶剂时混合标准溶液色谱图见图1。由图1 可知，用50%乙腈溶解时甲基异噻唑啉啉酮色谱峰形较差，响应较低。

图1 不同溶剂时混合标准溶液的提取离子流色谱图

综合考虑溶剂对各组分溶解的出峰情况和基质效应，选取提取溶剂为甲醇。

2.3 提取时间选择

选取含有甲基氯异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮、4-羟基苯甲酸丙酯和4-羟基苯甲酸甲酯的阳性样品，以甲醇为溶剂分别测试了超声提取5、10、15、20、30 min 时的提取率，结果见图2。由图2 可知，提取20 min后即提取完全，因此选择提取时间为20 min。

图2 不同提取时间目标物的提取率

2.4 取样质量选择

试验比较了取样质量分别为0.10、0.20、0.50、1.0 g时阳性样品的质量分数，结果见图3。由图3可知，不同取样质量时各目标物的检测差异不明显，故取样质量对样品提取效率影响较小。为避免取样质量过大污染色谱与质谱系统，试验选择取样质量为0.20 g，如遇不同样品可以调整取样质量或稀释样品。

图3 不同取样质量时目标物质量分数

2.5 线性方程、检出限与定量限

在1.2 液相色谱与质谱条件下，对1.3 中的系列混合标准工作溶液进行测定，以待测防腐剂的质量浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性方程、相关系数。以3倍信噪比(S/N)时样品中待测防腐剂含量为检出限，以10倍信噪比(S/N)时样品中待测防腐剂含量为定量限。12 种防腐剂的线性关系、相关系数、检出限及定量限见表6。

表6 12种防腐剂的线性关系、相关系数及检出限、定量限

2.6 加标回收与精密度试验

分别取洗护类、膏霜类阴性样品各0.2 g，分别加入0.125、0.25、1.25 mL 各目标物质量浓度均为1 μg/mL 的混合标准溶液，按1.4 方法处理样品，制备成12 种防腐剂质量分数均分别为0.625、1.25、6.25 μg/g的加标样品溶液，每个浓度点平行制备6份，在1.2条件下进行测定，空白样品及加标样品色谱图见图4，测定结果见表7。由表7 可知，12 种防腐剂的平均回收率为72.97%～106.53%，测定结果的相对标准偏差为1.13%～9.67%，表明该方法具有良好的准确度和精密度，可满足实际检测需要。