多囊卵巢综合征关键基因的筛选及其与疾病进展和预后的相关性分析

孙奎奎，杨微微，王文靖，郝颖新，郭波，任晨春，鞠明艳

（1.天津医科大学研究生院，天津 300070；2.天津市中心妇产科医院检验科，天津 300100）

多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是育龄妇女最常见的妇科内分泌疾病之一，临床表现多为排卵障碍/无排卵、多囊卵巢、高雄激素血症[1]，临床发病率可达4%～21%[2]。PCOS 不仅影响生殖内分泌功能，还可能增加代谢综合征、糖尿病、心血管疾病等并发症的长期风险，严重威胁女性健康[3]。此外，伴随严重的月经减少、闭经而发生的雌激素水平的破坏也会增加子宫内膜增生和子宫内膜癌（UCEC）的发生风险[4]。PCOS 是由遗传、内分泌、环境等多种因素引起的[5]，然而，PCOS 的发病和进展机制尚不清楚[6]。因此，临床医生必须及时掌握预测、诊断和评估PCOS 患者康复状态的方法，以控制病情进展，改善预后。

近几年，生物信息学分析和公共数据库的蓬勃发展[7]，为发现PCOS 潜在的分子靶点和制定新的诊断治疗策略提供了基础。在本研究中，笔者使用生物信息学工具分析了基因表达综合（gene expression om nibus，GEO）数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中的数据集，以确定PCOS 患者和匹配对照组之间的差异表达基因，为进一步的临床应用和实验研究提供客观依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 从GEO 数据库[7]中检索和下载GSE34526 数据，从TCGA 数据库中下载卵巢癌（ovarian cancer，OC）、乳腺癌（breast cancer，BRCA）、子宫内膜癌UCEC 的临床和表达数据[8]，分析差异基因对女性肿瘤的影响。

1.2 研究方法

1.2.1 差异基因分析 使用R/Bioconductor 的软件及Limma 包分析基因表达数据[9]。对GSE34526 数据集中的7 例PCOS 患者和3 例对照样本的基因表达进行limma 归一化，分析差异表达基因，校正后P＜0.05 和|log2FC|＞1 被认为差异有统计学意义。使用ggplot2 包绘制火山图，pheatmap 包绘制热图。

1.2.2 KEGG 和GO 富集分析 使用R 软件中的clusterProfiler 4.4.4 包[10]对差异基因进行京都基因与基因组百科全书（KEGG，http：//www.kegg.jp/）和基因本体论（GO，富集分析http：//www.geneontology.org）[11-12]，校正P＜0.05 为差异有统计学意义。并将结果可视化，利用ggplot2 包绘制KEGG 气泡图和GO条形图。

1.2.3 单样本基因富集分析（single-sample gene set enrichment analysis，ssGSEA） 为了进一步研究PCOS 的炎症微环境，从表达数据推断免疫细胞浸润的相对水平，本研究整合了免疫相关变量的方法进行计算。使用这种方法，将PCOS 表达数据转换为标准化分数，以表示特定免疫细胞类型的相对丰度。为了在免疫图谱上可视化免疫表型，将来自PCOS患者和对照组的10 个样本分类为免疫“热”和“冷”位点，根据其评分进行比较。使用ssGSEA 评分[13]量化每个PCOS 样品中29 个免疫信号的富集水平，收集免疫细胞基因集，进行抗肿瘤免疫和促肿瘤抑制评分[14]。免疫评分通过R 包gsva 的“ssgsea”方法进行富集，热图和线性图由pheatmap 和ggplot2 包绘制。

1.2.4 人类蛋白质图谱 利用人类蛋白质图谱数据库在（The Human Protein Atlas，HPA）（https：//www.proteinatlas.org/）收集肿瘤组织和正常组织的蛋白表达谱[15]，分析差异基因在BRCA、OC 和UCEC 中的蛋白表达水平。

1.2.5 生存分析 采用Kaplan-Meier 图分析差异基因在BRCA、OC 及UCEC 预后中的表达，利用survival和survivalROC 软件包，基于受试者工作特征（ROC）曲线分析3 年、5 年和10 年癌症生存率。

2 结果

2.1 与PCOS 患者相关的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）的鉴定 结合TCGA女性癌症临床数据和GEO 数据库RNA 阵列数据的分析，筛选PCOS 潜在标志物（图1A）。最终共筛选出16 个校正P 值有显著差异的基因，分别为CD163、MRC1、MAFB、EPB41L3、ITGAM、FCGR1B、TGFBI、EMB、HMOX1、CD93、LILRB3、VSIG4、HLADPA1、SIGLEC10、HAS2、MMP9（图1B）。其中，HAS2在对照组中表达，而在PCOS 患者中不表达；与PCOS进展高度相关的基因MMP9 在PCOS组中高表达；在PCOS组中，巨噬细胞标志物MRC1 高表达（图1C）。差异表达基因的相关性分析表明，ITGAM 和HMOX1 与其他基因具有强相关性（P＜0.05，图1D）。

2.2 ITGAM 和HMOX1 是与PCOS 患者疾病进展相关的关键基因 对上述16 个DEGs 分别进行GO和KEGG 富集分析。KEGG 通路富集结果显示细胞黏附分子（cell adhesion molecules，CAMs）、补体和凝血级联与PCOS 的进展相关（图2A）。GO 富集结果显示为生物学进程中上皮细胞迁移和创面炎症反应的正向调控（图2B），尤其是MHC Ⅱ类受体活性和免疫受体活性在GO 功能分析中富集。这些失调的信号通路可能导致PCOS 患者卵巢功能受损。最终在这些通路中富集得到ITGAM 和HMOX1 两基因，二者在本研究中被定义为与PCOS 进展高度相关的基因。

图2 DEGs 的功能和通路富集情况Fig 2 Functional and pathway enrichment of DEGs

2.3 ITGAM、HMOX1 与PCOS 患者免疫浸润异质性的相关性 在PCOS 患者中，免疫抑制细胞类型如骨髓来源的抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）、中性粒细胞、巨噬细胞、浆细胞样树突状细胞和调节性T 细胞评分较高（图3A）。免疫细胞分为促肿瘤抑制和抗肿瘤免疫，PCOS组的样本更接近于促肿瘤抑制（图3B）。ITGAM 和HMOX1基因的表达相关性分析显示，ITGAM 与HMOX1 表达呈正相关（r=0.69，P=0.028，图3C）。

图3 ITGAM、HMOX1 与PCOS 免疫细胞的相关性分析Fig 3 Correlation analysis of ITGAM，HMOX1 and immune cells in PCOS

ITGAM、HMOX1 与促炎免疫细胞的相关性分析显示，ITGAM 与巨噬细胞（r=0.86，P=0.001）、MD－SCs（r=0.93，P＜0.001）、中性粒细胞（r=0.63，P=0.051）、浆细胞样树突状细胞（r=0.65，P=0.04）、调节性T 细胞（r=0.94，P＜0.001）呈正相关。HMOX1 与巨噬细胞（r=0.92，P＜0.001）、MDSCs（r=0.87，P= 0.001）、中性粒细胞（r=0.91，P＜0.001）、浆细胞样树突状细胞（r=0.92，P＜0.001）、调节性T 细胞（r=0.86，P=0.001）呈正相关（图4）。

图4 ITGAM、HMOX1 与促炎免疫细胞的相关性分析Fig 4 Correlation analysis of ITGAM，HMOX1 and pro-inflammatory immune cells

2.4 差异基因在BRCA、OC 和UCEC 中的蛋白表达水平 免疫组织化学结果显示，在BRCA、OC 和UCEC 中，ITGAM 和HMOX1 蛋白水平较高，而正常对照组中无表达（图5）。

图5 BRCA、OC 和UCEC 3 种肿瘤中ITGAM 和HMOX1 蛋白表达情况Fig 5 ITGAM and HMOX1 protein expression in BRCA，OC and UCEC tumors

2.5 ITGAM 和HMOX1 在女性肿瘤患者中的预后分析 对TCGA 数据库分析表明，作为不良预后因素，ITGAM 显著影响OC 患者的生存（P=0.004 6），而在BRCA 和UCEC 中影响不显著，HMOX1 对3 种肿瘤的预后无明显影响，但有不良预后因素的趋势（图6A）。ITGAM 与HMOX1 对肿瘤患者3、5、10 年生存率的影响的分析结果表明，ITGAM 在OC中生存预测率ROC 曲线下面积（AUC）均＞0.5，其中10 年AUC ＞0.59。HMOX1 在BRCA、OC 和UCEC 中的3 年AUC＞0.5，其中在BRCA 中的10年AUC＞0.6（图6B）。

在BRCA 中，ITGAM+HMOX1 在3、5、10 年联合预测的ROC 曲线下AUC 分别为0.51、0.498、0.606，在OC 中分别为0.563、0.537、0.481，在UCEC中分别为0.556、0.479、0.472（图7A）。用TIME2.0 可视化预测MDSCs+ITGAM+HMOX1 对肿瘤患者生存的影响，分析结果显示，在大多数肿瘤中，MDSCs 是预后不良的因素（图7B），其中BRCA 和UCEC 中为显著不良预后（P＜0.05），OC 不显著（P＞0.05）。

图7 ITGAM+HMOX1 联合预测对肿瘤患者生存率的影响Fig 7 The impact of combined ITGAM+HMOX1 prediction on survival of patients with tumor

3 讨论

近年来，多项研究报道了PCOS 患者的潜在标志物和核心通路[16-18]。然而到目前为止，还没有明确的生物标志物有效评价PCOS 的进展和预后。在本研究中，笔者使用生物信息学分析来识别PCOS 的诊断标志物，通过GSE34526 队列筛选出16 个DEGs，GO 和KEGG 分析发现ITGAM 和HMOX1 在CAMs、补体和凝血级联、上皮细胞迁移和炎症反应的正向调控相关通路中显著富集，是与PCOS 患者进展高度相关的关键基因。

慢性炎症在PCOS 的发病过程中具有重要作用，慢性炎症导致内皮功能障碍和氧化应激增加[19]，抗炎治疗已被证实可有效减轻颗粒细胞凋亡，改善卵巢功能[20]。本研究鉴定的关键基因ITGAM 编码CD11b 蛋白，属于整合素家族，是介导细胞间和细胞外基质黏附的重要跨膜蛋白家族[21]。研究证实，ITGAM 可促进白细胞跨内皮细胞迁移，破坏内皮屏障功能[22]。HMOX1 是血红素分解代谢的关键酶，其分解代谢产物CO 可调节AMPK、VEGF、NF-κB 等炎症信号通路，影响多种细胞因子的产生[23]。为了研究PCOS 中的炎症微环境，本研究通过ssGSEA 分析数据集GSE34526 的免疫细胞浸润，ITGAM 和HMOX1 的表达符合显著协同共表达的特征，且二者的表达与促炎免疫细胞亚型评分呈正相关，说明在PCOS 的进展中，ITGAM 和HMOX1 的高表达可能起到促进炎症发生的作用。

既往研究显示，由于PCOS 患者存在代谢和内分泌异常，容易发展成为某些肿瘤，如BRCA、OC 和UCEC[16，24]。多项研究发现，高水平的HMOX1 与多种妇科肿瘤相关[25-26]。MDSCs 可以抑制机体免疫细胞发挥正常的稳态和适应性免疫功能，既往对MDSCs的研究阐明了它与肿瘤发生和发展的密切关系。例如，Sun 等[27]分析了结肠癌患者肿瘤组织中MDSCs促进远处转移的作用。本研究结果显示，ITGAM 和HMOX1 基因的水平与免疫抑制细胞（如MDSCs）的评分有更强的相关性。在PCOS组中，促炎细胞较对照组高表达，这意味着在PCOS 的发生、发展中，免疫细胞可能发挥着促炎，而不是抑炎作用，存在一些机制待探索。对促肿瘤抑制和抗肿瘤免疫分析结果显示，对照组的3 个样本更相关于抗肿瘤免疫，而PCOS组的7 个样本更相关于促肿瘤抑制，即促炎反应，表明PCOS 患者的卵巢颗粒细胞可能处于免疫紊乱的微环境中，反过来加速PCOS 向多种肿瘤的演变。此外，ITGAM 和HMOX1 激活异常与肿瘤患者预后不良有关。联合ITGAM+HMOX1 的表达对3 种肿瘤3 年总体生存率有较好的预测准确性（AUC＞0.5），这对PCOS 不良进展的早期筛查具有一定的指导作用。因此推测，ITGAM 和HMOX1 可能是PCOS 发展为肿瘤的新的风险标志物，但这一假设尚需要进一步的研究来验证。

综上所述，ITGAM 和HMOX1 在PCOS 中的表达升高可能代表炎症异常状态或机体的代偿性保护机制，对疾病的早期筛查具有一定的指导作用。当发生失代偿时，高水平的ITGAM 和HMOX1 可能意味着不良结果，发展为肿瘤的风险更大。有针对性的治疗方案有望降低ITGAM 和HMOX1 的表达，二者的水平可作为治疗效果的评价因素。本研究对PCOS 的诊断和治疗可能有一定的临床意义。