基于网络药理学研究茵陈治疗良性前列腺增生症的作用机制

李晓石，李世宾，刘芬

（1.新乡市中心医院，新乡医学院第四临床学院泌尿外科，新乡 453000；2.新乡市中心医院，新乡医学院第四临床学院病理科，新乡 453000）

良性前列腺增生症（benign prostatic hyperplasia，BPH）是泌尿男科门诊最常见的中老年男性疾病之一，是以前列腺移行带和尿道周围腺体增生为主的良性病变，大约有8%的40 岁以上男性以及大约90%的90 岁以上男性出现不同程度前列腺腺体增生。BPH 有两种表现：一种是组织学上的前列腺间质和腺体成分的增生、解剖学上的前列腺增大，另一种是下尿路症状（lower urinary tract symptoms，LUTS）为主的临床症状。增生的腺体挤压尿道并向膀胱突出进而加重尿路梗阻。LUTS 主要包括尿频、尿急、尿失禁、夜尿增多、排尿困难以及尿不尽感等。LUTS 主要由膀胱出口的尿动力学变化引起，如膀胱出口梗阻、逼尿肌过多活动或逼尿肌无力等[1]。在这种情况下，患者可能需要通过药物、手术或其他治疗方法缓解症状。

BPH 具有较高的发病率和较大的社会经济负担，迫切需要探索有效的治疗方法，但其病理生理机制目前尚不清楚，药物治疗方法疗效有限。以往研究提示，尿道移行带和间质增生是产生尿路症状的主要原因，主要依赖于血清和前列腺组织睾酮和双氢睾酮水平，其细胞机制与肾上腺素能受体、毒蕈碱受体和磷酸二酯酶-5 等受体相关[2]。指南中BPH 管理优先考虑药物治疗，短期目标以改善LUTS 症状为主，长期目标是以延缓临床进展为目的，结果是半数以上患者出现药物耐受或者疾病进展。其中，α 受体阻滞剂坦索罗辛是药物治疗BPH的一线选择[3-4]，但会引起头晕、头痛和逆行性射精等不良反应[5]。药物治疗失败后，多数患者进行手术治疗，其疗效显著，但术后患者均出现不同程度的尿控问题，绝大部分患者经过排尿功能锻炼后，尿控得以改善，仍有部分患者持续受到尿控困扰。中医药治疗BPH 历史悠久，疗效显著。现代药理学机制研究发现中医药不仅改善LUTS 症状，提高患者生活质量，同时也能够缩小前列腺体积及抑制前列腺腺体进一步增生。同时，患者可以省去手术费用，也能避免术后尿控问题。

中医学BPH 属“精癃、癃闭”范畴，其病位是膀胱，同时也受肾、肝、脾、肺等影响，众多医家多认为血瘀、湿热、肾虚、痰浊和气滞是其发生的病理基础[6-7]。中药茵陈为菊科植物滨蒿（Artemisia scoparia Waldst.et Kit.）或茵陈蒿（Artemisia capillaris Thunb.）的干燥地上部分，最早记载于《神农本草经》，用于治疗风湿寒热之邪所致黄疸。其味轻微苦辛，性微寒，主要走脾、胃和膀胱经，主要是利湿、利胆和退黄，临床主要用于治疗少尿、黄疸、湿症及闻疮瘙痒等症。现代医学发现茵陈发挥作用的成分主要是黄酮类、香豆素类、有机酸类、挥发油类及萜类等[8]。茵陈在治疗肿瘤、氧化应激、感染和抑制病毒方面疗效显著[9]。茵陈作为治疗BPH 的方剂成分，罕有相关机制研究，故本文利用网络药理学方法探索茵陈治疗BPH 可能的作用靶点，并分析作用机制，利用动物实验验证核心成分与重要靶点间的表达，从基础实验层面揭示茵陈治疗BPH 有效的实验证据。

1 材料与方法

1.1 茵陈成分和对应靶点 在中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）输入“茵陈”并检索出茵陈所有的药物成分，然后将成分对应的靶点一一筛选出，其中筛选药物成分的设置参数：OB≥30%且DL≥0.18，筛选出茵陈的有效成分和对应靶点，然后将药物靶点在uniprot 数据库查找靶点简称。

1.2 疾病靶点和交集靶点 将“benign prostatic hyperplasia”输入GeneCards、OMIM 及DisGeNET 数据库搜索，其中GeneCards 选取的疾病靶点标准（Relevance score≥3.9），然后将3 个数据库所得靶点合并去重，最终所得靶点即BPH 靶点。将茵陈成分靶点和BPH 靶点导入venny2.1 分析，分析处理即可获得交集靶点，即为茵陈治疗BPH 靶点。

1.3 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI） 将筛选出的交集靶点在STRING 中分析靶点PPI，保留得分（combined score）＞0.9 的靶点并隐去游离靶点，将所得数据表格采用Cytoscape3.7.2软件处理，构建PPI 图。

1.4 GO 和京都基因及基因组百科全书（KEGG）分析 交集靶点在Metascape 中分别进行GO 和KEGG 分析，即生物过程、分子功能、细胞组分GO富集分析及KEGG 信号通路分析，选取P＜0.01 的数据。在线构建基因富集图。

1.5 “成分-靶点-通路”网络 Cytoscape 软件构建“成分-靶点-通路”网络图，对网络进行分析，进而探析核心成分、核心靶点。

1.6 动物实验验证

1.6.1 实验动物 购置SPF 级健康性成熟雄性Sprauge-Dawley（SD）大鼠20 只，体重约220～280 g，在常温环境中（温度平均25℃，湿度平均50%，光照12 h/d），自由摄食、饮水，适应实验室环境7 d 后开始实验。

1.6.2 主要药物及试剂 茵陈（购自天津中医药大学第一附属医院）；羧甲基纤维素钠[生工生物工程（上海）股份有限公司，A501427-250g]；芝麻油[生工生物工程（上海）股份有限公司，A502795-0100]；丙酸睾丸素[阿拉丁试剂（上海）有限公司，T101368-25g]。各指标酶联免疫试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.6.3 主要仪器和设备 冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；酶标仪（VARIOSKAN FLASH，Thermo scientific，美国）；其余实验试剂、耗材均由中国医学科学院放射研究所实验室提供。所有实验均按照动物伦理规范进行（动物伦理号：IRM-DWLL-2022230）。

1.6.4 实验分组 采用随机数字表法将雄性SD大鼠随机分为对照组和治疗组，每组各10 只。

1.6.5 造模及给药方法 BPH 大鼠模型依据文献报道丙酸睾酮注射法建模[10]，在大鼠左下腹部位注射浓度4%水合氯醛（3.5 mL/kg）进行全身麻醉，消毒皮肤切除双侧睾丸。清洁环境室温条件下恢复1周，造模大鼠皮下注射丙酸睾酮0.5 mg/（kg·d）（溶于0.1 mL 芝麻油）造模，连续皮下注射4 周（此法为公认的经典BPH 造模方法，不再详细赘述）。28 d 造模成功后，对照组给予羧甲基纤维素溶液灌胃治疗，治疗组予茵陈药物溶于羧甲基纤维素溶液，然后连续灌胃28 d，大鼠每次灌胃量10 mL/（kg·d），药物浓度9.45 g/L。

1.6.6 标本采集及检测方法 在两组大鼠末次给药后第1 天，留取前列腺组织，称重，采两组大鼠静脉血，离心处理后留取血清，分别采用相应酶联免疫试剂盒检测血清肿瘤蛋白p53（TP53）、丝/苏氨酸蛋白激酶（AKT）1、表皮生长因子受体（EGFR）、JUN、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF）、血管内皮生长因子A（VEGFA）蛋白表达。所得正态分布的计量数据以表示，t 检验分析两组差异，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药物成分 数据库及文献共检索出茵陈的成分12 个。分析后得有效药物成分12 个。

2.2 药物、疾病及交集靶点 获取药物靶点共254个，除去重复靶点后得到150 个。BPH 靶点除去重复值后得到960 个。药物与疾病靶点交集得茵陈治疗BPH 的作用靶点67 个（图1）。

图1 中药-疾病靶标图Fig 1 Traditional Chinese medicine-target map of disease

2.3 PPI 网络共同靶点 分析得到67 个节点和369 条边的PPI 网络，靶点间的联系紧密程度高的为关键靶点（图2）。

图2 PPI 网络图Fig 2 PPI network diagram

2.4 GO 富集分析 共同靶点GO BP、GO CC 及GO MF 富集分析，得到生物过程233 个、细胞组分34 个、分子功能88 个。按照Log q 值由小到大排序，分别选取GO BP、GO CC 及GO MF 前10 富集靶点作富集分析图（图3）。

图3 GO 富集分析Fig 3 GO enrichment analysis

2.5 KEGG 富集分析 共同靶点进行KEGG 分析，得到信号通路159 条，按照Log q 值由小到大排列，将前20 条最相关通路作图（图4）。

图4 KEGG 富集分析Fig 4 KEGG enrichment analysis

2.6 网络图制作“成分-靶点-通路”网络图（图5）显示茵陈12 个成分调节多条通路干预67 个靶点治疗BPH。网络中重要有效成分包括槲皮素、茵陈色酮、β-谷甾醇、芫花素、茵陈黄酮、异鼠李素等，提示这些成分是茵陈治疗BPH 的核心成分。网络中重要的靶点包括TP53、AKT1、EGFR、JUN、IL6、TNF、VEGFA 等，提示这些靶点是茵陈治疗BPH 的重要靶点。

图5 成分-靶点-通路网络图Fig 5 Composition-target-pathway network diagram

2.7 动物实验验证

2.7.1 大鼠体重和前列腺湿重 与对照组相比，治疗后，大鼠前列腺重量减轻，差异有统计学意义（表1）。

表1 大鼠体重和前列腺湿重（）Tab 1 The body weight and wet prostate weight of rats（）

表1 大鼠体重和前列腺湿重（）Tab 1 The body weight and wet prostate weight of rats（）

前列腺湿重（mg）1 962.8±42.82 1 717.8±26.15 t 0.11410.919 P 0.912＜0.000

2.7.2 酶联免疫方法检测TP53、AKT1、EGFR、JUN、IL6、TNF、VEGFA 蛋白表达 实验结果显示，与对照组相比，茵陈治疗后TP53 蛋白表达增加，AKT1、EGFR、JUN、IL6、TNF、VEGFA 蛋白表达均降低（表2）。

表2 两组大鼠血清各指标蛋白表达（）Tab 2 The expression of serum index protein in two groups of rats（）

表2 两组大鼠血清各指标蛋白表达（）Tab 2 The expression of serum index protein in two groups of rats（）

注：TP53：肿瘤蛋白p53；AKT1：丝/苏氨酸蛋白激酶1；EGFR：表皮生长因子受体；IL-6：白细胞介素-6；TNF：肿瘤坏死因子；VEGFA：血管内皮生长因子A

组别TP53（pg/L）AKT1（pg/L）EGFR（pg/L）JUN（pg/L）IL-6（pg/L）TNF（pg/L）VEGFA（pg/L）对照组1.36±0.083.34±0.115.21±0.072.78±0.084.13±0.091.76±0.093.31±0.11治疗组2.46±0.152.77±0.084.23±0.091.58±0.083.21±0.081.07±0.072.65±0.08 t 14.419.3019.3824.1417.8414.0010.91 P＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.0001

3 讨论

BPH 是中老年男性LUTS 的常见病因之一，严重影响中老年男性生活质量和家庭和谐，增加社会经济负担和加重患者家庭生活压力[11]。BPH 首选药物治疗，其短期目标以改善排尿症状为主，长期目标以延缓临床进展为主，中医药治疗BPH 疗效显著，能够显著缩小前列腺腺体。茵陈发挥作用的成分主要是黄酮类、香豆素类、有机酸类、挥发油类及萜类等[8]，多用于治疗湿热症，含茵陈方剂能够明显改善BPH 患者临床症状，且不良反应较少。

本研究发现，茵陈中有12 个有效成分，这些有效成分通过干预67 个靶点调节多个分子通路治疗BPH，其中槲皮素、茵陈色酮、β-谷甾醇、芫花素、茵陈黄酮、异鼠李素等是核心成分，TP53、AKT1、EGFR、JUN、IL-6、TNF、VEGFA 是至关重要的靶点。动物实验结果，前列腺重量减轻，酶联免疫方法检测显示血清TP53 蛋白表达增加，血清AKT1、EGFR、JUN、IL-6、TNF、VEGFA 蛋白表达降低。茵陈中槲皮素、茵陈色酮、芫花素、茵陈黄酮、异鼠李素等成分属于黄酮类化合物，黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎和抑菌的作用，因此，茵陈黄酮类化合物在治疗BPH 中发挥重要作用。β-谷甾醇属于萜类化合物，具有抗氧化和抗衰老作用[12]。槲皮素能够通过调节Nrf 和氧化应激，β-谷甾醇能够通过抗雄激素和抗炎等治疗BPH，改善前列腺腺体大小[13]。炎性反应参与BPH 发生和发展过程，茵陈色酮能够调节核因子-κB 通路，从而抑制炎性和氧化应激因子释放，进而抑制炎性反应[14]。还有研究证实，茵陈提取物能够调节IL-6 信号转导与转录激活因子3 通路，抑制肿瘤细胞增殖[15]。胡黄金等[16]研究显示CRYAB 蛋白降低，负性调控PI3K/AKT 信号通路，抑制细胞增殖和促进细胞凋亡，从而发挥对BPH 的治疗作用。TNF在炎症中起关键作用，TNF 拮抗剂抑制前列腺增生小鼠和人前列腺组织上皮细胞增殖和巨噬细胞聚集。这些研究表明TNF 是BPH 患者潜在的治疗靶点[17]。虫草素具有预防睾酮诱导的大鼠前列腺增生的能力，具体机制与抗增殖、抗氧化、抗炎和促凋亡作用以及调节AMP 活化蛋白激酶和AKT 激活相关[18]。

综上所述，茵陈可以用于治疗BPH，主要通过调节PI3K-AKT、IL-17、TNF、MAPK、EGFR、P53 等靶点治疗BPH，具有良好的治疗效果和广泛的作用机制，有望成为治疗BPH 的中成药的重要组分。