人着丝粒蛋白E 在人肾透明细胞癌中的表达及对细胞增殖的影响

刘芬，李世宾，李晓石

（1.新乡市中心医院，新乡医学院第四临床学院病理科，新乡 453000；2.新乡市中心医院，新乡医学院第四临床学院泌尿外科，新乡 453000）

肾细胞癌（RCC）是较常见的恶性肿瘤之一，包括多种组织病理类型及遗传相关亚型。肾透明细胞癌（ccRCC）是肾细胞癌中最常见的组织病理类型，占肾恶性肿瘤的80%以上，也占RCC 相关死亡的大部分。局限性和局部进展性RCC 患者的治疗方法是手术切除或消融，但晚期患者的治疗选择受到限制[1-2]。近年来，靶向治疗对于ccRCC 的治疗显示出巨大优势，多种靶向治疗药物对于ccRCC 患者的预后具有显著改善作用[3-4]。然而，靶向治疗对ccRCC肿瘤抑制和个体患者的生存有不同的影响，这意味着需要更新的治疗靶点来改善患者的预后。

人着丝粒蛋白E（centromere protein E，CENPE）大小为312 kD，是维持稳定的动点与微管连接、保持纺锤体检查点功能的一个重要分子马达蛋白[5]。目前发现，CENPE 具有多种细胞生物学功能，如调节动粒组装、驱动染色体运动等，进而影响细胞分裂[6]。已有研究表明，CENPE 在很多肿瘤中均显著高表达，如肺癌、乳腺癌、骨肉瘤等，且CENPE 表达与肿瘤患者的不良预后及药物的抗药性相关[7-9]。

许多研究表明CENPE 与多种类型肿瘤的发生和发展密切相关。例如，CENPE 与骨肉瘤的发生有关[10]。CENPF 的表达与乳腺癌的临床病理参数、分子亚型、临床结果以及内分泌治疗的疗效有关[11]。虽然CENPE在ccRCC 中的作用尚不明确，但鉴于其在肿瘤中的潜在作用，推测CENPE 与ccRCC 进展相关。

1 材料和方法

1.1 临床资料 收集2014 年9 月—2021 年8 月新乡市中心医院77 例ccRCC 患者手术切除的癌组织及癌旁组织标本，分析其临床病理资料特征。全部病例均经过病理证实，具有完整的病例资料。收集患者的一般临床资料，包括年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤分化等。患者平均年龄（52.5±3.75）岁；男性43 例，女性34 例；肿瘤直径＜4 cm 的34 例，＞4 cm的43 例；肿瘤低分化的38 例，高分化的39 例。

1.2 试剂 CENPE 的抗体为兔抗人单克隆抗体，购自英国abcam 公司（ab133583，abcam，Cambridge），免疫组化稀释浓度为1∶100，免疫印迹稀释浓度为1∶1 000；β-肌动蛋白（β-actin）抗体（免疫印迹1∶1 000 稀释，ab8226，abcam）。免疫组化二步法检测试剂盒购于北京中衫金桥生物技术有限公司（PV-6001），DAB 显色试剂盒购自北京中衫金桥生物技术有限公司（ZLI-9018）；CCK-8 试剂盒购自北京碧云天公司。

1.3 方法及免疫组化染色结果的评分标准 ccRCC 的肿瘤及癌旁组织进行福尔马林固定，常规取材，石蜡包埋，将蜡块行切片及免疫组化染色，切片二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，行二步法行免疫组化染色，抗体1∶100 稀释，CENPE 抗体37℃孵育2 h，DAB 染色，苏木素复染。切片于蔡司显微镜下观察拍照。CENPE 染色评分标准：阳性细胞数<15%为0 分；阳性细胞15%～50%记1 分；阳性细胞50%～80%记2 分；阳性细胞＞80%则为3 分；同时对阳性着色细胞的染色强度进行评分：阴性表达记0 分，弱表达记1 分，中等2 分，强阳性记为3 分；最终计分结果为阳性细胞比例分数加染色强度分数，范围为0～6 分。分数0～2 分为CENPE 低表达，3～6 分为CENPE 高表达。

1.4 细胞培养及转染 HTB-47 和CRL-1932 细胞购自美国模式菌种收集中心（ATCC）。shRNA 质粒购自Addgene。HTB-47 和CRL-1932 细胞均于含有10%胎牛血清（FBS，美国Gibco 公司）的RPMI-1640 培养基（美国Gibco 公司）中进行培养。细胞转染采用脂质体转染法进行，分别加入质粒或Lipo 2000 和1.5 mL Opti-MEM 培养基，室温孵育5 min。随后两者混合后孵育20 min，加入细胞培养基中，6 h 后换液，24 h 后进行功能实验。CENPE shRNA靶向序列：AAGAATCACTTGGAGAAACTGCC。

1.5 Western 印迹实验 利用RIPA 细胞裂解液提取细胞总蛋白，使用BCA 法测量蛋白浓度。总蛋白进行8%SDS-PAGE 电泳，随后转膜至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%脱脂奶粉进行室温固定2 h，室温条件下一抗孵育2 h，随后Tris-HCL 缓冲液（TBST）洗脱未结合抗体，共洗5 次，每次5 min；随后室温山羊抗兔二抗（1∶1 000）孵育45 min，随后TBST洗脱未结合抗体，共洗5 次，每次5 min，加入ECL增强显影底物后在曝光仪中检测信号，所得信号使用Image J 7.0 软件进行分析。

1.6 实时定量荧光PCR 通过TRIzol 试剂提取细胞内总RNA，并进行两步法反转录，条件为42℃，1 h，cDNA 使用SYBR 荧光探针进行实时定量聚合酶链式反应（PCR），并使用GAPDH 作为内参，检测相关mRNA 的表达水平。实验结果采用2×δCT 法进行定量。CENPE 正向：5'-CCAAGGCTGTGGCAAACG-3'，反向：5'-GGATTAGGGATTCGGTGGTAC-3'。GAPDH：正向：5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'，反向：5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'。

1.7 CCK-8 实验 细胞铺于96 孔板中，进行质粒转染处理后于48 h 时间点加入20 μL 的CCK-8 试剂（购自北京碧云天公司），37℃培养箱孵育4 h，随后在450 nm 波长下使用多功能酶标仪检测其吸光度值。每组实验设3 个重复，统计结果。

1.8 集落形成实验 细胞进行质粒转染处理后于48 h 时间点铺于6 孔板中，每孔800 个细胞，37℃培养箱培养14 d，随后使用0.1%的结晶紫染色30 min，使用4%多聚甲醛室温固定20 min，流水缓慢冲洗，随后奥林巴斯荧光显微镜下观察拍照，使用Image J 7.0 软件分析图片。

1.9 统计学处理 所有细胞实验重复3 次。使用Graphpad 7.0 软件（Graphpad software，LaJolla，CA，USA）进行数据分析。采用Spearman 相关分析。细胞实验中，利用Mann-Whitney U 检验进行两组之间的比较，正态分布的计量数据采用表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生信分析揭示CENPE 在ccRCC组织的表达及与预后的关系 通过GPEIA 数据库（http：//gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene=CENPE）分析CENPF的mRNA 水平在523 例ccRCC 癌组织及100 例癌旁组织中的差异，发现在癌组织中CENPE 的mRNA显著上调（图1A，P<0.05）。生物信息学分析结果证实，ccRCC 患者癌组织CENPE 的表达与患者无病生存期与总生存期显著相关（图1B，P=0.035、0.029）。

图1 CENPE mRNA 水平在ccRCC 中显著增加并与患者不良预后相关Fig 1 mRNA levels of CENPE were significantly increased in ccRCC and were significantly associated with poor prognosis in patients

2.2 CENPE 蛋白在ccRCC 患者肿瘤组织的表达及与患者临床病理特征的相关性 免疫组织化学染色检测结果发现，相对于癌旁组织，CENPE 蛋白在ccRCC 癌组织中呈显著高表达（图2）。

CENPE 的表达水平与ccRCC 患者的肿瘤直径（P=0.021）显著相关，而与其他临床特征如年龄（P=0.429）、性别（P=0.670）、肿瘤分化（P=0.575）等无显著相关性（表1）。

表1 77 例肾透明细胞癌CENPE 表达与临床病理特征的关系Tab1 Relationships of CENPE and clinicopathologicalcharacteristics in 77 patients with ccRCC

2.3 下调CENPE 蛋白抑制ccRCC 细胞增殖 与对照组shRNA 质粒相比，转染CENPE 的shRNA 质粒的HTB-47 和CRL-1932 细胞24 h 后，CENPE 的mRNA 水平及蛋白水平均显著下降（图3A，P=0.013 8、0.010 9；图3B，P=0.010 9、0.014 4）。

图3 CENPE 的shRNA 在肾透明细胞癌细胞系HTB-47 和CRL-1932 中的沉默效率Fig 3 shRNA silencing efficiency of CENPE in ccRCC cell lines HTB-47and CRL-1932

集落形成实验结果表明，在HTB-47 和CRL-1932 细胞中，CENPE 蛋白的下调会导致集落数量下降（图4A，P=0.013 5、0.015 4）。CCK-8 实验结果表明，HTB-47 和CRL-1932 细胞中，CENPE 蛋白敲低后导致450 nm 处吸光度值显著下调（图4B，P=0.009 1、0.013 3）。

图4 CENPE 下调抑制肾透明细胞癌细胞增殖Fig 4 CENPE down-regulation inhibited the proliferation of ccRCC cell

3 讨论

RCC 是一种常见的泌尿系统恶性肿瘤，在我国居第2 位，仅次于膀胱癌，过去近30 年RCC 发病率在逐年上升[12]。而ccRCC 是其中主要的组织学类型[3]。目前RCC 的治疗仍以根治性手术为主，但术后复发有一定比例，且放、化疗效果不佳[3]。研究显示，肿瘤分子靶向治疗的出现，为解决这一问题提供了可能[4]。PBRM1、BAP1 和SETD2 是其中常见的高频突变基因，这些突变基因的检出往往与不同的预后和临床疗效相关[13]。多种靶向治疗药物，如舒尼替尼、培唑帕尼、卡博替尼等，在治疗晚期ccRCC 中发挥一定的作用。然而为了进一步提高生存率，仍需开发更有效的治疗靶点。本研究发现并证实了CENPF在ccRCC组织中的高表达，并与患者的不良预后密切相关，因此可作为一个潜在的治疗靶点。

在本研究中，发现CENPE 在ccRCC 中的异常表达，表明其与ccRCC 的进展密切相关。进一步利用两种ccRCC 的细胞系开展体外实验。通过CENPE的shRNA 质粒转染的手段，下调CENPE，并通过集落形成实验和CCK-8 实验检测对细胞增殖的影响，结果表明CENPE 的下调显著抑制ccRCC 细胞增殖。因此，本研究初步揭示了CENPE 在ccRCC 中的功能。CENPE 也可作为一种新的生物标志物和视网膜母细胞瘤的潜在治疗靶点[7]。另有研究表明，CENPE 抑制导致髓母细胞瘤细胞有丝分裂突变和DNA 损伤[9]。CENPE 的表达也与骨肉瘤和肺癌的进展有关[10]。这些结果均表明CENPE 可作为肿瘤的潜在治疗靶点。

染色体的非整倍性与有丝分裂的异常往往会导致肿瘤的发生。CENPE 基因敲除小鼠的肿瘤发生概率显著增加[15]。而CENPE 定位在着丝粒上，与染色体功能和有丝分裂进程均密切相关[15]。有研究证实，CENPE 也参与了有丝分裂后期着丝粒对于微管的捕捉。CENPE 蛋白是一种重要的着丝粒定位的蛋白，其主要存在于着丝粒外部，是有丝分裂中期所必需的蛋白。多项研究证实CENPE 的表达与定位均受到严格控制。也有研究证实，CENPE 在纺锤体检查点组装与行使功能的机制中至关重要[16]。CENPF 在着丝粒上的定位受到多种因素的影响，如受到着丝粒组装的上游蛋白的影响。CENPE 主要通过自身结构改变影响BubR1 蛋白的功能，因而影响纺锤体检查点[17]。CENPE 蛋白在细胞的有丝分裂S期高表达，而在细胞间期基本不表达，进一步揭示其在有丝分裂与肿瘤进展中的重要作用[18]。然而，CENPE 对于肿瘤，特别是ccRCC 进展的影响及分子机制尚需进一步研究。

综上，本研究首次发现CENPE 蛋白在ccRCC 中显著高表达，并与患者的无病生存期与总生存期显著相关。CENPE 表达水平与ccRCC 患者的肿瘤直径密切相关，且下调CENPE 能够抑制ccRCC 的细胞增殖。因此证实CENPE 对ccRCC 进展的影响，表明其可作为ccRCC 治疗的潜在靶点。