木芙蓉花质量标准研究

于 辉 孙鹏鹏 田 真 张秀婷

1.山东药品食品职业学院，山东 威海 264200；2.山东省淄博市食品药品检验研究院，山东 淄博 255000；3.齐鲁医药学院，山东 淄博 255300

木芙蓉花为锦葵科、木槿属植物落叶小乔木或灌木木芙蓉HibiscusmutabilisL.的新鲜或干燥花，又名芙蓉花、木莲、拒霜花、地芙蓉、华木。木芙蓉花主要采摘于夏、秋两季刚刚开放的花朵，晒干或烘干后入药[1]。木芙蓉花主产地在中国山东、河北、安徽等省区，原产于中国湖南，为成都市市花，现东南亚各国和日本也都有栽培[2]。《本草图经》和《本草纲目》有明确记载，木芙蓉花“味辛平，无毒”，主治“一切大小痈疽、肿毒恶疮”[3]。清热解毒、凉血止血、消肿排脓为木芙蓉花的主要功效[4]。木芙蓉花的化学成本一般可以分为黄酮类、苷类成分、香豆素类成分等，其中黄酮类含量最高，种类也最多，大约有25个。同时黄酮类成分也是木芙蓉花的主要药效成分，在抗炎、耐病毒、强心、利胆、止痛和镇定等方面发挥重要功能[5]。

通过对木芙蓉质量标准调查研究发现，现行《中国药典》2020年版只对木芙蓉叶的质量标准进行了收载，木芙蓉花仅有卫生部颁药品标准(中药材第一册)且标准较为粗疏，仅做性状鉴别[6]，目前对木芙蓉花的质量标准鲜有报道。中药材的质量标准关系到药材的采集、炮制、制剂、成分提取等方面，并且对临床使用起着重要指导作用。本试验采集10批产地不同的木芙蓉花，考查其显微特征、薄层色谱特征、水分、水溶性浸出物等方面；此外，木芙蓉花中含有芸香苷等黄酮类化合物[7]，其有较高的药用价值，是治疗糖尿病、高血压、心血管疾病等多种疾病的良药，此外它还有抗菌和抗放射作用[8]。故本研究选择采用高效液相色谱法测定芸香苷含量，为该药材质量标准建立和规范使用提供科学依据。

1 材料、仪器与试药

1.1 材料 木芙蓉花10批，分别采购自浙江省杭州市、广东省清远市、广东省深圳市、河北省安国市、四川省成都市、河南省周口市、云南省昆明市及购自安徽亳州药材市场。经鉴定，十批药材皆为锦葵科植物木芙蓉(HibiscusmutabilisL.)的干燥花。具体信息见表1。

表1 木芙蓉花样品信息表

表2 水分和水溶性浸出物含量测定结果

1.2 仪器设备 U3000高效液相色谱仪(戴安集团公司)、BX-41生物显微镜(日本Nikon公司)WFH-204B紫外分析仪紫外灯(杭州齐威仪器公司)、WT-B天平(杭州万特衡器公司)、KQ-300DA超声波清洗器(深圳市华策技术公司)、HH-S14A恒温水浴锅(郑州市亚荣仪器设备公司)；DHG-9070A烘箱(上海精宏实验设备有限公司)。

1.3 试剂与试药 芸香苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：100080-200707)；甲醇(色谱纯，国药集团生化药物试剂股份公司，批号：20220106)；冰醋酸(色谱纯，国药集团生化药物试剂股份公司，批号：20211206)；娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团股份公司，批号：20220120)；4%CH3COOHNa硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂分厂)；乙酸乙酯(国药集团生化药物试剂公司，批号：20220305)；甲酸(国药集团生化药物试剂公司，批号：20211210)；硫酸(国药集团生化药物试剂公司，批号：20200313)；丙酮(国药集团生化药物试剂公司，批号：20210901)；三氯甲烷(国药集团生化药物试剂公司，批号：20211016)。

2 方法与结果

2.1 性状鉴别 将木芙蓉干燥花置于白色工作台上，轻轻将失水皱缩的花瓣展开，测量花瓣的长和宽，观察花瓣正反面颜色、形状以及表面特征，留意木芙蓉花的气味；将花瓣摘除，观察并测量花柱和雄蕊的性状。

2.1.1 性状特征 如图1所示，本品多呈皱缩团状或钟状，完全展开的花瓣呈倒三角型形，长3.0～5.0 cm，宽1.5～3.0 cm；表面有纵向纹理，呈放射状，为浅黄色，靠近边缘处有分叉；花瓣颜色以紫色为主调，深浅不一，偶见浅黄色，内面基部呈黄绿色，花瓣数15～25瓣；花萼5裂，长1～1.5 cm，表面被星状柔毛覆盖，阔卵形状裂片；雄蕊多数，联合成管状，包裹花柱，长1.0～1.5 cm，花药柄长0.3～0.7 cm。柱头呈黄绿色，柱头头状，子房5室，花柱先端5裂。气微香，味甘淡。注：木芙蓉花外观颜色和形状与花期和品种有关。其中花期决定花瓣颜色，开花初起为白色或淡黄色，花盛开时颜色变深至紫色，采收受花期影响颜色不一致；而花瓣数量与品种相关，药用一般为重瓣木芙蓉。

图1 木芙蓉干燥花图

2.2 显微鉴别 取少许60目过筛的木芙蓉花粉末放置于干燥透明的载玻片上，摊平放置，观察粉末色泽，再滴入1～2滴水合氯醛试液，置于燃烧着的酒精灯上，加热使其透化，反复以上动作1～2次，直至透化完全，然后滴入1～2滴稀甘油使其分散，用盖玻片敷盖好，最后放置于显微镜下，观察其粉末显微特征。结果如图2所示。

1.花冠表皮细胞；2.花粉囊内壁细胞；3.非腺毛；4.薄壁细胞；5.花丝细胞；6.花粉粒

粉末颜色呈紫红或暗紫色，偶见土黄色。花冠水平表皮细胞呈长方形或不规则状，垂直周壁呈微波状扭曲，气孔为直轴式，边缘具有许多以4～7个单细胞非腺毛组成的放射状腺毛，其壁平滑。薄壁细胞呈多边形或矩形，可见螺纹导管。

花粉粒呈球状，外壁有大量尖刺突起。花粉囊内壁细胞加厚，呈棱形，外表面为多角形，呈肋条状壁加厚；花丝细胞呈长条形，具螺纹状导管。

完整的腺毛细长呈圆锥形，腺头略成三角形，2～3细胞，腺柄7～11个细胞，内含大量淡黄色分泌物。草酸钙簇晶较小，呈长方块状、菱形以及多边形状，棱角微尖。

2.3 薄层色谱鉴别 黄酮类成分是木芙蓉花的主要活性成分，本研究以芸香苷作为黄酮类成分的代表性成分对木芙蓉花进行定性质量控制。

2.3.1 对照品溶液的制备 芸香苷对照品10 mg，加15 mL甲醇，放入超声波清洗仪中辅助溶解，放入20 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即为对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备 称取木芙蓉花药材粉末0.5 g放入100 mL锥形瓶中，加入30 mL甲醇，塞紧，放入超声波清洗仪中超声30 min(300 W，40 kHz)，滤过，蒸干滤液，加水15 mL将残渣溶解，加入20 mL氯仿，振摇提取，弃去下部氯仿溶液，水液层加入水饱和正丁醇25 mL，振摇提取，弃去下部水溶液，分取上部正丁醇溶液，放在水浴锅上加热蒸干，最后加2 mL甲醇溶解残渣，即得供试品溶液。

2.3.3 检测方法 依次吸取对照品溶液和10批木芙蓉花供试品溶液 1 μL，点于同一以4%CH3COOHNa为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-丙酮(15∶2∶3∶7)为展开剂，直接展开，取出，晾干，喷以10%的硫酸乙醇液，置于提前预热好105 ℃的烘箱中加热至呈现清晰斑点，置紫外灯(365 nm)下检视。结果如图3所示。由图可知，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的黄绿色荧光斑点。

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

2.4 水分和水溶性浸出物检查 根据2020版《中国药典》[9]四部通则0832水分测定法第二法(烘干法)测定10批样品，主要操作如下：取木芙蓉花供试品3 g，取干燥至恒重的扁形称量瓶，将木芙蓉花药材平铺于中，供试品厚度要低于5 mm，精密称定，将瓶盖打开，用烘箱烘干干燥5 h，温度设为100～105 ℃，盖好瓶盖，移放至玻璃干燥器中，放凉冷却30 min，精密称定，再烘干干燥1 h，温度依旧为上述温度，载放入玻璃干燥器中冷却，称重，当连续两次称重的差异小于5 mg时，实验结束。根据减失的重量，计算供试品中含水量(%)。

按2020年版《中国药典》方法测定，10批木芙蓉花中水含量为8.73%～11.80%，平均值为10.10%；水溶性浸出物含量为 33.17%～49.80%，平均值为41.53%。结果见表1。

2.5 含量测定

2.5.1 系统适应性考察 色谱条件色谱柱：Diamonsil C18(ODS)；柱温：30 ℃；流动相：甲醇-1%冰醋酸溶液(35∶65)；流动速率：1 mL·min-1；检测波长：257 nm；进样量：10 μL。理论板数按芸香苷峰计算应不得低于2000。系统适应性色谱图如图4所示，横坐标为时间(min)，纵坐标为吸收度值(A)。

A

2.5.2 对照品溶液的制备 取对照品芸香苷(芦丁)10 mg，精密称定，至100 mL容量瓶，加入适量甲醇，用超声波清洗仪(功率：300 W，频率40 kHz)溶解，定容至刻度线，摇匀，即得芸香苷对照品溶液。

2.5.3 供试品溶液的制备 分别取不同批次的木芙蓉花粉末1 g，精密称定，至100 mL圆底烧瓶，精密加入50%甲醇溶液50 mL，称定其重量，回流提取(30 min)，放凉，称重，补足失重，滤过，精密量取续滤液2 mL，置于10 mL容量瓶中，50%甲醇定容至刻度线，即得木芙蓉花供试品溶液。

2.5.4 线性关系考查 精密吸取对照品溶液 1 mL、1 mL、1 mL、1 mL、2 mL，分别置于 50 mL、25 mL、10 mL、5 mL、5 mL容量瓶中，加乙醇稀释成不同浓度的对照品溶液，按上述色谱条件进样分析。以芸香苷(芦丁)进样量(X)对峰面积积分值(Y)进行线性回归，得回归方程为Y=2.0×107X-189379(r=0.9996，n=6)。结果表明，芸香苷(芦丁)进样量在0.0188～0.9412 μg 范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.5.5 精密度试验 按上述色谱条件对照品溶液反复进样6次，记录峰面积并计算RSD值。结果显示，芸香苷峰面积RSD=0.677%(n= 6)，表明仪器精密度良好。

2.5.6 稳定性试验 在上述色谱要求条件下，取同一供试品溶液适量，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h时进样测定。测得出芸香苷峰面积积分值的RSD=0.519%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内，其稳定性良好。

2.5.7 重复性试验 分别精密称取同一批木芙蓉花样品对其进行重复性试验(购自安徽亳州药材市场，样品4号)适量，按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液，照上述色谱条件的要求测定。结果，RSD= 0.859%(n= 6)，表明方法重复性良好。

2.5.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的木芙蓉花药材样品(芸香苷含量为0.0373 mg·g-1)适量，共10份，分别精密加入一定量的芸香苷对照品，按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液，照上述色谱条件测定芸香苷含量，并计算加样回收率。结果见表3。

表3 木芙蓉花中芸香苷加样回收率试验结果 (n=6)

2.5.9 样品含量测定 取适量各个批次木芙蓉花样品，精密称定，按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液，照上述色谱条件测定，计算出每批木芙蓉花药材中的芸香苷含量。经计算10批样品中，芸香苷(芦丁)含量最高为38.9 μg·g-1，最低为11.9 μg·g-1，平均值为27.38 μg·g-1。结果见表4。

表4 木芙蓉花十批样品中芸香苷含量结果

3 讨论

3.1 薄层鉴别 试验发现，药材本身色素等成分大极性成分以及其他各种非极性成分会影响实验结果，因此需要适当对药材进行进一步脱色、分离处理，查阅相关研究[10]发现甲醇相比乙醇对芸香苷的溶解效果更好，故将提取溶剂换为甲醇。超声提取和回流提取对供试品制备基本无差别，但超声提取较方便，故选择超声提取。

3.2 含量测定 比较了超声提取法和热回流法两种供试品溶液制备方法，热回流法效率明显高于超生提取法，因此选择回流法作为供试品提取方法。通过查阅文献[11-12]，同时测定木芙蓉花的芸香苷含量有多种流动相选择，通过试验，最终确定了在该条件下测定二者含量，其分离效果好，基线平稳，重复性好，达到了含量测定的目的。本法重复性好、操作简便，可为木芙蓉花质量控制提供依据。

3.3 不同批次木芙蓉花质量比较 通过对不同产地批次的木芙蓉花的外观形状、显微、薄层色谱、水分、灰分、芸香苷(芦丁)含量进行研究发现，各产地的木芙蓉花基原一致，定性鉴别、一般杂质等质量检查结果较为统一。但是花作为入药部分，在外观鉴别、含量测定方面会出现差异。通过对10批次的药材研究发现，9号木芙蓉花的外观形状，显微粉末特征、芸香苷(芦丁)含量均与其他批次有明显差异，初步分析其原因，主要是该批次花朵颜色整体较浅，查阅文献，发现木芙蓉花的花期决定其颜色，而颜色深浅恰好与木芙蓉花中的黄酮成分(黄酮醇苷及花色素)含量有关，因此在对木芙蓉花采集方面建议在花盛开时采收。

此外，研究木芙蓉花中芸香苷(芦丁)含量明显少于木芙蓉叶中其含量，但是也有文献表明，木芙蓉花中总黄酮的含量高于叶，因此在木芙蓉花的含量测定指标方面是否需要增加其他的有效成分指标，尚需进一步研究。