蜜制枇杷叶炮制工艺研究

何晶晶 蒋贵瑜 骆沁羽 刘绍欢，3*

1.贵州中医药大学药学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州医科大学药学院，贵州 贵阳 550025；3.贵州医科大学 天然药物优效利用重点实验室，贵州 贵阳 550025

枇杷叶为蔷薇科植物枇杷Eriobotryajaponica(Thunb.)LindL.的干燥叶[1]，始载于《名医别录》，列为中品，归肺、胃经，具有清肺止咳、降逆止呕等功效，用于治疗肺热咳嗽、气逆喘气、胃热呕逆及烦热口渴等症[2]。枇杷叶不同炮制方法对其功效及作用部位差异较为明显[3]。研究发现，枇杷叶水提物有抗炎、祛斑等作用[4-5]，其叶浸液具有抗炎和镇痛的潜力[6]。枇杷叶三萜酸能有效减轻小鼠内脏中心性肥胖、脂异常和炎症反应等[7]。

查阅文献[8-10]发现，少见关于枇杷叶不同切制规格、不同料蜜比进行炮制工艺优化相关研究。故本实验从切制规格、料蜜比入手，优化蜜炙枇杷叶最佳炮制工艺，为枇杷叶炮制品的优化生产提供数据参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 FA2204N电子分析天平(上海菁海仪器有限公司)；SX-10-12箱式电阻炉(天津市泰斯特仪器有限公司)；UV-2700紫外分光光度计(岛津仪器有限公司)；Ultimate3000高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)等。

1.2 材料 乙醇(纯度95%，批号20200309，国药集团化学试剂有限公司)；亚硝酸钠(批号20150115，重庆江川化工有限公司)；硝酸铝(批号20140421，天津市科密欧化学试剂有限公司)；芦丁(纯度≥98%，批号180604，广州分析测试中心科力技术开发公司)；齐墩果酸(纯度91.1%，批号110709-201808，中国食品药品检定研究院)；熊果酸(纯度99.9%，批号110742-201823，中国食品药品检定研究院)；乙腈(批号20200924，天津市科密欧化学试剂有限公司)；甲醇(批号20201111，天津市科密欧化学试剂有限公司)等。乙腈、甲醇为色谱纯，其他均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 炮制工艺流程图 如图1所示。

图1 炮制工艺优化流程图

2.2 样品的制备 实验用枇杷叶由笔者采集，由贵州医科大学刘绍欢老师鉴定为蔷薇科植物枇杷Eriobotryajaponica(Thunb.)LindL.的叶。枇杷叶采摘后，对其进行清洗，刷去绒毛，晾晒至表面水分干燥，切成2～3 mm的细丝(编号为Y0～Y7)、5～10 mm 的宽丝(编号Y10～Y17)、10～15 mm的段(编号Y20～Y27)3种规格。分别取熟蜜，加适量水稀释，加入枇杷叶细丝/宽丝/段内拌匀，闷润至透，置炒制容器内，用文火加热，炒至不粘手为度，取出晾凉；干燥粉碎后备用。见表1。

表1 枇杷叶样品信息表

2.3 水分、灰分、浸出物测定

2.3.1 水分测定 参照2020年版《中国药典》四部[1]水分测定法(通则0832)项下的烘干法。由表2可知：蜜炙枇杷叶水分符合2020年版《中国药典》一部炙枇杷叶【检查】项下规定；相同料蜜比、不同切制规格中切段的水分值最高；相同切制规格、不同料蜜比，水分值随着料蜜比的增加而降低；生品水分值最高。

表2 不同炮制工艺枇杷叶水分测定结果

2.3.2 总灰分、酸不溶性灰分测定 参照2020 年版《中国药典》第四部灰分测定法(通则2302)项下的总灰分、酸不溶性灰分测定法进行。由表3可知：结果显示不同炮制工艺枇杷叶Y(1～4、11～13、21～24)总灰分超过《中国药典》一部炙枇杷叶【检查】项下限度要求，超出的原因可能与产地、加工方法、贮藏条件有关[11]。枇杷叶不同切制规格、相同料蜜比，细丝、宽丝、段的总灰分值相近；相同切制规格、不同料蜜比，总灰分值随着料蜜比的增加而降低；生品总灰分值最高。不同炮制工艺枇杷叶酸不溶性灰分值无明显变化。

表3 不同炮制工艺枇杷叶总灰分、酸不溶灰分测定结果

2.3.3 浸出物测定 参照2020年版《中国药典》四部醇溶性浸出物测定法(通则2201)项下的热浸法进行操作。由表4可知：蜜炙枇杷叶醇溶性浸出物符合2020年版《中国药典》一部炙枇杷叶【浸出物】项下规定；枇杷叶不同切制规格、相同料蜜比，浸出物值相近；相同切制规格、不同料蜜比，浸出物值随着料蜜比的增加而增加；生品浸出物值最低。

表4 不同炮制工艺枇杷叶醇溶性浸出物测定结果

2.4 UV-Vis法测定总黄酮含量

2.4.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品6.50 mg至25 mL容量瓶，加入80%乙醇制成浓度为254.8 μg/mL的对照品溶液，备用。

2.4.2 供试品溶液的制备 分别称取样品粉末0.5 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入80%乙醇15 mL，在40 ℃下提取1 h，放冷，称重，加80%乙醇补足重量，摇匀，过滤，取续滤液，备用。

2.4.3 显色条件 分别取对照品、供试品溶液 1 mL，加入蒸馏水4 mL，摇匀，加入5%亚硝酸钠0.5 mL，摇匀，静置6 min，再加入10%硝酸铝0.5 mL，摇匀，静置6 min，最后加入4%氢氧化钠4 mL，摇匀，静置15 min，在510 nm处测定吸光度[12]。

2.4.4 方法学考察

2.4.4.1 线性关系考察 取适量芦丁对照品溶液于10 mL容量瓶中分别配成0 μg/mL、25.48 μg/mL、38.22 μg/mL、50.96 μg/mL、63.70 μg/mL、76.44 μg/mL 6种不同浓度，按“2.4.3”项下的显色条件进行显色，以蒸馏水作为空白对照，在510 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)，进行线性回归，得到线性回归方程：Y=0.0101X-0.0053，R2=0.9997。结果表明，芦丁在0～76.44 μg/mL范围内线性关系良好。

2.4.4.2 精密度试验 精密称取样品粉末0.5 g，按“2.4.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.4.3”项下的显色条件进行显色，连续测定6次，记录吸光度并计算RSD值，结果显示RSD值为0.04%，表明仪器精密度良好。

2.4.4.3 重复性试验 精密称取样品粉末6份，每份0.5 g，按“2.4.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.4.3”项下的显色条件进行显色，测定吸光度并计算RSD值，结果显示RSD值为2.39%，表明方法重复性良好。

2.4.4.4 稳定性试验 精密称取样品粉末0.5 g，按“2.4.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.4.3”项下的显色条件进行显色，分别于显色后的0 min、10 min、20 min、30 min、40 min测定吸光度并计算RSD值，结果显示RSD值为2.87%，表明样品在40 min内稳定。

2.4.4.5 加样回收试验 取已知总黄酮含量为8.7692 mg/g的药材粉末6份，每份0.25 g，精密称定，分别加入浓度为2.1952 mg/mL芦丁溶液1 mL，按“2.4.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.4.3”项下的显色条件进行显色，测定吸光度并计算回收率。结果显示加样回收率均值为101.77%，RSD为1.93%，表明该方法准确度较高。

2.4.5 总黄酮含量测定 精密称取样品粉末0.5 g，按“2.4.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.4.3”项下的显色条件进行显色，测定吸光度并代入回归方程计算总黄酮含量。由表5可知：生品总黄酮含量最高。枇杷叶不同切制规格、相同料蜜比，切段的总黄酮含量略高；相同切制规格、不同料蜜比，总黄酮含量随着料蜜比的增加而降低。

表5 不同炮制工艺枇杷叶总黄酮含量测定结果

2.5 HPLC法测定齐墩果酸、熊果酸含量

2.5.1 对照品溶液的制备 取齐墩果酸、熊果酸对照品适量，置于同一容量瓶中，加95%乙醇溶解并定容至刻度线，配置成浓度为50.47 μg/mL、206.29 μg/mL的混合对照品溶液，备用。

2.5.2 供试品溶液的制备 精密称取样品粉末0.5 g，置于150 mL锥形瓶中，加入95%乙醇25 mL，称重，超声30 min，再次称重，补足减失重量，滤过，取续滤液，再过0.45 μm微孔滤膜，备用。

2.5.3 色谱条件 采用Shim-Pack GIS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；流动相为乙腈(A)-甲醇(B)-0.5%醋酸铵(C) (67∶12∶21)；流速为1 mL/min；检测波长为210 nm；柱温为 23 ℃；进样量为10 μL。

2.5.4 方法学考察

2.5.4.1 系统适用性考察 精密称取样品粉末0.5 g，按“2.5.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.5.3”项下的色谱条件进样测定，记录色谱图(图2)，结果说明方法专属性良好、分离度良好。

(a)对照品溶液

2.5.4.2 线性关系考察 取适量的齐墩果酸、熊果酸对照品分别配制成0 μg/mL、5.2327 μg/mL、8.7212 μg/mL、14.5354 μg/mL、24.2256 μg/mL、40.3760 μg/mL、50.4700 μg/mL与0 μg/mL、21.3885 μg/mL、35.6475 μg/mL、59.4125 μg/mL、99.0209 μg/mL、165.0348 μg/mL、206.2935 μg/mL 7种不同浓度。按“2.5.3”项下的色谱条件进行测定。以峰面积为纵坐标(Y)，浓度为横坐标(X)，得到线性回归方程：Y(齐墩果酸)=0.0815X+0.0005，R2=0.9999；Y(熊果酸)=0.0724X-0.0265，R2=0.9999。结果表明齐墩果酸、熊果酸分别在0～50.4700 μg/mL、0～206.2935 μg/mL范围内线性关系良好。

2.5.4.3 精密度试验 取上述两种对照品混合溶液，按“2.5.3”项下的色谱条件连续测定6次，记录峰面积并计算RSD值，结果显示RSD值分别为1.6%、1.0%，表明仪器精密度良好。

2.5.4.4 重复性试验 精密称取样品粉末6份，每份0.5 g，按“2.5.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.5.3”项下的色谱条件进样测定，记录峰面积并计算RSD值，结果显示RSD值分别为1.49%、1.41%，表明方法重复性良好。

2.5.4.5 稳定性试验 精密称取样品粉末0.5 g，按“2.5.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.5.3”项下的色谱条件，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样测定，记录峰面积并计算RSD值，结果显示RSD值为0.99%、0.46%，表明样品在24 h内稳定。

2.5.4.6 加样回收试验 取已知齐墩果酸、熊果酸含量的枇杷叶药材粉末9份，每份0.25 g，加入对照品混合溶液后，制备成供试品溶液(第1～3份，加入已知含量的50%；第4～6份加入已知含量的100%；第7～9份加入已知含量的150%)，按“2.5.3”项下的色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示齐墩果酸、熊果酸的加样回收率均值分别为98.18%(RSD=1.93%)、98.75%(RSD=2.20%)，表明该方法准确度较高。

2.5.5 齐墩果酸、熊果酸含量测定 由表6可知：枇杷叶不同切制规格、相同料蜜比，齐墩果酸、熊果酸含量相近；相同切制规格、不同料蜜比，齐墩果酸、熊果酸含量随着料蜜比的增加而降低；生品齐墩果酸、熊果酸含量最高。

表6 不同炮制工艺枇杷叶齐墩果酸、熊果酸含量测定结果

2.6 炮制工艺指标优化 以齐墩果酸、熊果酸、总黄酮、醇溶性浸出物等含量及外观性状评分为评价指标，采用单因素考察对蜜炙枇杷叶工艺进行全面评价。

2.6.1 外观形状评价标准参照 2020 年版《中国药典》第一部炙枇杷叶【性状】项下规定，确定性状评分标准。见表7。

2.6.2 内在指标评价标准 根据评价指标的重要程度，将指标分为3个层次，按齐墩果酸=熊果酸>总黄酮>浸出物=水分=总灰分=酸不溶性灰分>外观性状的优先顺序，利用yaahp v10.3应用软件构建各指标成对比较的优先判断矩阵，给予齐墩果酸、熊果酸的权重均为0.2918，给予醇溶性浸出物、水分、总灰分、酸不溶性灰分的权重均为0.0607，分别给予总黄酮含量的权重为0.1462、外观性状为0.0274，并对矩阵进行归一化处理，计算出一致性比(CR)=0.0161<0.10，表明该指标成对比较的优先判断矩阵具有满意的一致性，求得的权重系数有效。

将以上得到权重的各指标加权综合评分，得出综合评分OD=(0.2918A/Amax+0.2918B/Bmax+0.1462C/Cmax+0.0607D/Dmax+0.0607E/Emax+0.0607F/Fmax+0.0607G/Gmax+0.0274H/Hmax)×100。见表8。其中A～H分别表示齐墩果酸含量、熊果酸含量、总黄酮含量、浸出物值、水分值、总灰分值、酸不溶性灰分值及外观性状得分。其中Amax-Hmax分别表示上述各数值的最大值，综合评分越高表示样品质量越好。

2.6.3 料蜜比考察 基于上述结论可知，切段炮制品的水分值、总黄酮含量高于细丝、宽丝，其余指标相近，故称取切制成段后枇杷叶7份，每份100 g，在不同料蜜比(料蜜比分别为100∶5、100∶10、100∶20、100∶40、100∶60、100∶80、100∶100)下按照前述炮制要求进行炮制、测定；考察不同料蜜比下对综合评分的影响，结果显示(图2)料蜜比=100∶10时炮制品综合评分最高。

2.6.4 切制规格考察 称取生枇杷叶3份，每份100 g，切制成不同规格(细丝、宽丝、段)，在料蜜比为100∶10时按照前述炮制要求进行炮制、测定；考察不同切制规格下对综合评分的影响，结果显示(图3)切制成段的炮制品综合评分最高。

3 结论与讨论

枇杷叶中的三萜类成分具有镇咳、抗炎等作用[13-14]，研究[15-16]发现在不同炮制品中总三萜含量有较大差异，其中蜜炙品总三萜含量最高，且齐墩果酸和熊果酸(五环三萜类化合物)性质稳定、含量较大。

实验通过对3种提取溶剂(95%乙醇、无水乙醇、甲醇)进行考察，发现95%乙醇更稳定，故选择95%乙醇作为供试品的提取溶剂；通过对3种不同色谱柱(Shim-Pack GIST、Shim-Pack GIS、Diamonsil)在不同检测波长、柱温、流速、进样量条件下进行考察，根据峰数目、基线平稳度、信号响应值、分离度，确定色谱柱为Shim-Pack GIS C18，检测波长为210 nm，柱温为23 ℃，流速为1 mL/min，进样量为10 μL。

齐墩果酸和熊果酸互为同分异构体，均为弱酸性五环三萜类化合物，两者极其相似，故在同时含有齐墩果酸和熊果酸的植物中很难分离两者[17]。2020年版《中国药典》中所用流动相含有醋酸铵盐，而通过查阅相关文献[18]发现，水相是醋酸铵时，峰型和分离度都得到提高和改善，但其在210 nm处存在紫外吸收，从而使基线呈现波浪状，影响成分检查的结果，故将流动相进行混匀后使用。

本实验过程中相同切制规格、不同料蜜比样品的水分值、灰分值、总黄酮含量、齐墩果酸和熊果酸含量随着料蜜比的增加而呈现降低趋势，浸出物值随着料蜜比的增加呈现上升趋势；通过单因素考察分析结果可知枇杷叶最适宜切制规格为段，最佳料蜜比为100∶10。