含jumonji结构域的蛋白2B和缺氧诱导因子1α在儿童非霍奇金淋巴瘤组织中的表达及意义

刁玉巧 王俭 朱秀丽 陈健 郑钰 江莲 刘月平 戴若恒 闫祎炜

（1.河北医科大学第四医院儿科，河北石家庄 050000；2.河北医科大学第四医院病理科，河北石家庄 050000）

淋巴瘤是儿童第三大常见肿瘤［1］，根据病理形态可分为霍奇金淋巴瘤（Hodgkin's lymphoma,HL）及非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma,NHL），其中NHL 约占儿童淋巴瘤的80%［2］。NHL在儿童中发病大多数为弥漫性、高度恶性，进展快，确诊时临床分期多为晚期。越来越多证据表明，组蛋白去甲基化酶导致的组蛋白甲基化异常在多种生物过程中起着至关重要的作用，这些过程常与癌症的发生有关［3-4］。含jumonji结构域的蛋白（jumonji domain-containing protein, JMJD）2B 是组蛋白去甲基化酶JMJD 家族成员之一，其过度表达与肿瘤恶性增殖相关。研究发现JMJD2B在乳腺癌、胃癌、结直肠癌和肝细胞癌等多种癌症中存在过表达［5-8］。

缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-lα）是在低氧条件下稳定和改变肿瘤细胞代谢的重要成分之一。研究表明，HIF-1α 通过促进肿瘤迁移、侵袭和血管生成，调节pH 和葡萄糖代谢，从而在多种肿瘤中过表达［9］，HIF-lα可能参与淋巴瘤发生、发展过程的调控［10］。目前有关JMJD2B在儿童NHL的研究尚未见报道。本研究通过免疫组化检测JMJD2B 和HIF-1α 在儿童NHL 组织中的表达，分析二者与NHL 患儿临床病理特征和预后的关系以及在NHL 组织中二者表达的相关性，探讨二者在儿童NHL 发生发展中的作用，为该病的诊断、预后判断及靶向治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

回顾性选取河北医科大学第四医院儿科2013—2022 年经病理确诊的46 例NHL 患儿作为观察组，以24 例淋巴结反应性增生患儿作为对照组。观察组和对照组患儿年龄均为0～18岁。

收集患儿性别、年龄、淋巴瘤St.Jude 分期及病理分型、有无B 症状、血清乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH） 水平、 国际预后指数（international prognostic index, IPI）评分等资料。淋巴瘤诊断、St.Jude 分期及分型参照2016 版世界卫生组织造血与淋巴组织肿瘤分类标准进行［11］。B 症状包括：（1）无其他原因6 个月内体重减少＞10%；（2）近30 d 内无原因反复发热＞38.0℃；（3）夜间盗汗。根据患儿年龄、体力状况、临床分期、淋巴结外受侵的部位数目及LDH 水平，将IPI评分分为低度危险（0～2分）和高度危险（3～5分）［10］。本研究已通过河北医科大学第四医院伦理委员会审批（2020ky228）。

1.2 免疫组织化学染色方法检测JMJD2B 和HIF-1α

取观察组和对照组石蜡组织标本进行切片、脱蜡、水化，将切片放入3% 过氧化氢溶液中灭活，置于柠檬酸抗原修复液（10 mM，pH 6.0）中进行抗原修复，滴加封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育，滴加JMJD2B鼠单克隆抗体、HIF-1α兔多克隆抗体（浓度分别为1∶150、1∶200）一抗，湿盒内4℃孵育过夜，加入生物素标记山羊抗兔工作液（浓度1 mg/mL）二抗，37℃孵育1 h，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育1 h。DAB显色，苏木素复染细胞核，脱水、封片，光学显微镜镜检。用磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照。

结果判读：所有病理切片由2位资深病理科专家分别判读。随机选择5个（10×20）视野，每个视野计数100个细胞中阳性染色细胞。根据染色程度评价染色强度：0 分为染色阴性，1 分为轻度染色，2 分为中度染色，3 分为强染色；根据切片中阳性细胞百分比进行评分：无阳性细胞计0 分，≤25%计1 分，26%～50%计2 分，＞50%～100%计3分。最后总评分=阳性强度评分×阳性百分比评分。总评分为0分定为阴性，1～2分、3～4分、6～9分分别标为+、++、+++，并将+、++、+++定为阳性［6，8，10］。

1.3 统计学分析

应用SPSS 27.0 软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均值±标准差（±s）表示，两组间比较采用两样本t检验。计数资料用例数和百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。JMJD2B表达与HIF-1α表达的相关性分析采用Spearman 秩相关分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

观察组46例患儿中，男27例，女19例，平均年龄（8.9±3.6）岁。对照组24 例患儿中，男15例，女9 例，平均年龄（9.1±3.8）岁。两组间性别和年龄的比较差异均无统计学意义（χ2=0.095，P=0.758；t=-0.276，P=0.783）。

2.2 JMJD2B和HIF-1α的表达情况

观察组JMJD2B阳性表达率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.001），见表1 和图1。观察组HIF-1α 阳性表达率亦高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.001），见表1和图2。

图1 对照组和观察组的JMJD2B表达（×200） 对照组（A）及观察组（B）淋巴结石蜡切片的细胞核内均可见JMJD2B 表达，观察组JMJD2B 表达高于对照组。颗粒状浅黄或棕黄色为JMJD2B 阳性表达（箭头所示）。［JMJD2B］含jumonji 结构域的蛋白2B。

图2 对照组和观察组的HIF-1α 表达（×200） 对照组（A）及观察组（B）淋巴结石蜡切片的细胞核内均可见HIF-1α表达，观察组HIF-1α表达高于对照组。颗粒状浅黄或棕黄色为阳性表达（箭头所示）。［HIF-1α］缺氧诱导因子1α。

表1 观察组及对照组JMJD2B和HIF-1α的阳性表达情况［例（%）］

2.3 JMJD2B和HIF-1α在NHL患儿组织中的表达与临床特征的关系

JMJD2B 表达与NHL 患儿血清LDH 水平及IPI危险度相关（均P＜0.05），与患儿性别、年龄、病理分型、St.Jude 分期及有无B 症状无关（均P＞0.05），见表2。

表2 JMJD2B和HIF-1α表达与NHL患儿临床特征的关系［例（%）］

HIF-1α表达同JMJD2B一样，与NHL患儿血清LDH 水平及IPI 危险度相关（均P＜0.05），与患儿性别、年龄、病理分型、St.Jude分期、有无B症状无关（均P＞0.05），见表2。

2.4 JMJD2B与HIF-1α在NHL患儿组织中表达的相关性

Spearman 秩相关分析显示，JMJD2B 与HIF-1α在NHL 患儿组织中的表达呈正相关（rs=0.333，P=0.024）。

3 讨论

淋巴瘤是一组以淋巴结和/或淋巴结外受累为特征的淋巴造血系统恶性肿瘤，儿童NHL 多为高侵袭性、高度恶性肿瘤，往往起病突然，生长迅速，临床进展快，病情重，部分患儿发病早期即可出现死亡［12］。因此，临床需寻找新的生物标志物探讨其发病机制、早期诊断、预后判断及干预。

JMJD2 家族蛋白包含2A、2B、2C、2D 4 个成员，能够识别二甲基化和三甲基化H3K9、H3K36和三甲基化H1.4K26作为底物，引起以上蛋白的去甲基化。大多数JMJD 家族成员已被证实是白血病和实体瘤的致癌基因，在多种肿瘤发生发展、侵袭及转移中发挥重要作用［13］，可促进肿瘤生长、侵袭和转移。Toyokawa 等［14］通过免疫组化方法检测到JMJD2B在肺癌中过表达，且阳性表达主要为核染色。苗晓红［15］研究表明，JMJD2B在宫颈癌组织中表达上调，且与肿瘤直径、肿瘤分化程度、淋巴结转移及浸润程度有关，可作为宫颈癌预后的预测指标。本研究结果显示：观察组JMJD2B阳性表达主要为核染色，其阳性表达率显著高于对照组，提示JMJD2B在儿童NHL发生发展过程中可能发挥重要作用，可作为儿童NHL辅助诊断指标。这与既往国内外研究［13-15］结果一致。

JMJD2B在肿瘤中发挥作用可能通过以下机制。（1） 参与肿瘤细胞凋亡：研究证实通过应用JMJD2B 抑制剂SD49-7，抑制H3K9 的甲基化水平可促进肿瘤细胞凋亡［5］。有研究发现在弥漫性大B细胞淋巴瘤组织中组蛋白H3K9 甲基化表达增高［16］。（2）可调节细胞周期：研究表明，在结直肠癌中，JMJD2B 表达能够通过诱导细胞发生G2/M 或者G0/G1 期阻滞从而导致肿瘤细胞增殖，并促进线粒体膜的破坏，导致来自于线粒体和Caspase-9、Caspase-3 的细胞色素C 的分裂［17］。（3）参与多种信号通路促进肿瘤细胞生长：有研究证实JMJD2B 可通过调节Wnt/β 链、TGF-β、Notch和PI3K通路促进肿瘤细胞生长［7］。上述通路的异常激活在NHL发生发展中亦发挥重要作用［18］。（4）参与肿瘤血管生成：实验表明JMJD2B可以上调HIF-1α 的表达；可以调节血管内皮生长因子A表达，且血管内皮生长因子A作为促进血管生成的特异调节因子，在NHL中呈高表达［19-20］。

LDH 是一种细胞内糖酵解酶，广泛存在于人体组织中。当正常组织恶变后，由于肿瘤细胞损伤及能量代谢障碍机制，肿瘤细胞释放LDH增多，导致血清LDH 增高。研究表明血清LDH 水平在NHL 患者中可明显升高［21］；LDH 水平对NHL 患者生存时间有显著影响，可作为评估NHL 分期及预后的可靠指标［22］。

IPI是由国际NHL预后因素协作组于1993年提出的一个淋巴瘤预后判断模型，可用来指导选择治疗方案，也可用来判断预后，危险度越高，代表预后越差［10］。

本研究结果显示儿童NHL组织中JMJD2B表达与患儿血清LDH 水平及IPI 危险度相关，提示JMJD2B 可判断儿童NHL 病情程度、评估预后。Bur等［23］在对经典HL患者的研究中发现，JMJD2B的表达可能与经典HL的侵袭性亚型有关，且预示较差的无事件生存率。

Lu等［6］在对肝癌患者的研究中发现，JMJD2B表达与性别和年龄无关，与组织学分级和转移分期相关。本研究结果显示：JMJD2B在儿童NHL中的表达与患儿性别、年龄、淋巴瘤病理分型及St. Jude 分期均无关；JMJD2B 表达在儿童NHLⅢ、Ⅳ期的阳性率均高于Ⅱ期，但差异无统计学意义，考虑可能与样本量较少相关。

HIF-1α 已被证实在多种肿瘤中表达上调，如多形性胶质母细胞瘤、黑色素瘤、肝癌、非小细胞肺癌、前列腺癌及甲状腺癌等［24-29］。本研究结果显示，HIF-1α表达在观察组阳性率高于对照组，提示HIF-1α 在儿童NHL 发生发展过程中可能发挥重要作用。蒋洁等［30］研究发现，HIF-1α在NHL中呈高表达。本研究与既往国内研究［24-30］结果一致。

HIF-1α在肿瘤中发挥作用可能通过以下机制。（1）参与多种信号通路；在弥漫性大B细胞淋巴瘤中，HIF-1α可通过所介导的PI3K/AKT等多种信号通路在肿瘤发生发展中发挥重要作用［31］。（2）参与多种靶基因及转录因子的调控；BACH2 是一种B细胞特异性转录因子，在套细胞淋巴瘤中，HIF-1α 通过促进BACH2 转录从而促进肿瘤细胞存活［32］。（3）参与肿瘤血管生成，调节糖酵解：研究发现HIF-1α-VEGF 模式在儿童NHL 病变中起重要作用［33］。（4） 参与肿瘤细胞侵袭、凋亡。（5）增加肿瘤细胞化疗耐药性：抗凋亡蛋白Bcl-xL已被证实与多种药物耐药有关，该蛋白受转录因子HIF-1α 调控。在NHL 细胞中，Bcl-xL 通过HIF-1α的表达可导致患者化疗耐药性的发生［34］。

苏玉璇等［35］发现，在弥漫性大B 细胞淋巴瘤组织中，HIF-1α 表达与Ann Arbor 分期和IPI 相关；胡露露等［36］研究证实，在口腔颌面部淋巴瘤患者中，HIF-1α表达与血清LDH水平相关。蒋洁等［30］研究发现，在NHL中，HIF-1α表达在B细胞型与T细胞型之间无显著性差异。本研究结果显示HIF-1α 在儿童NHL 中的表达与患儿性别、年龄、淋巴瘤病理分型、淋巴瘤St. Jude 分期及有无B 症状均无关；其表达与NHL患儿血清LDH水平及IPI危险度相关，与国内外研究结果［30，35-36］一致。这提示HIF-1α可辅助判断NHL患儿的病情程度和预后。

JMJD2B是HIF-1α下游靶点分子，HIF-1α诱导的JMJD2B表达有助于增强缺氧基因表达和肿瘤生长［37-38］。JMJD2B 可以通过催化启动子H3K9 去甲基化，上调HIF-1α的表达［39］，影响肿瘤细胞增殖或凋亡，在癌症血管生成和肿瘤分化中发挥重要作用。研究发现，在骨肉瘤及喉癌组织中JMJD2B和HIF-1α 表达呈正相关［40-41］；在结直肠癌中，JMJD2B 和HIF-1α 表达呈正相关，且HIF-1α 能通过增强JMJD2B的表达影响结直肠肿瘤细胞增殖活性［42］。本研究显示，JMJD2B 与HIF-1α 在儿童NHL组织中的表达呈正相关，提示JMJD2B及HIF-1α可能在儿童NHL发生、发展中起协同作用。

综上所述，JMJD2B和HIF-1α在儿童NHL组织中表达增高，二者在儿童NHL 发生发展过程中可能起协同作用；JMJD2B 可作为新的生物标志物辅助诊断儿童NHL、评估其病情程度、指导治疗、预测预后，同时也为儿童NHL的治疗提供新靶点。