重组人生长激素治疗对特发性矮小症儿童血清Klotho和成纤维细胞生长因子23的影响

董涵涵 李蒙蒙 孙萌 周冉 张新颖 程亚颖

（河北省人民医院儿科，河北石家庄 050051）

特发性矮小症（idiopathic short stature, ISS）是矮身材儿童最常见的病因，研究表明ISS可能存在生长激素（growth hormone, GH）-胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor, IGF）-1轴损害［1］。成纤维细胞生长因子23 （fibroblast growth factor,FGF23）是一种通过调节钙磷稳态进而促进骨形成的激素，主要由骨细胞和成骨细胞分泌，调节磷酸盐重吸收和1,25-二羟维生素D3［1,25-dihydroxyvitamin D3, 1,25-(OH)2D3］的合成［2］。Klotho是一种在肾脏、脉络丛和垂体前叶中高度表达的跨膜蛋白，在FGF23 对磷酸盐转运和骨化三醇产生中具有重要影响。研究发现敲除FGF23基因和敲除Klotho基因的小鼠均表现出矿物质代谢异常，以及与衰老相关的特征，包括寿命缩短、生长迟缓、性腺功能减退、认知障碍、骨质减少及骨骼肌萎缩等［3］。研究表明，Klotho 和FGF23 与GHIGF 轴密切相关［4］。Efthymiadou 等［5］关于生长激素缺乏症（growth hormone deficiency, GHD）研究显示，Klotho、FGF23 及IGF-1 与血清磷酸盐均呈正相关，且FGF23 与Klotho、IGF-1 均呈正相关。Guarnotta 等［6］研究显示，给予GHD 患儿重组人生长激素（recombinant human growth hormone, rhGH）治疗12 个月后，Klotho、IGF-1 均较前明显增高，Klotho 可与IGF-1、GH 联合作为GHD 的标志物。但国内外ISS 患儿血清Klotho、FGF23 水平改变及其与线性生长的关系鲜有报道。本研究检测rhGH治疗前后ISS 患儿Klotho、FGF23 水平变化，以及其与身高标准差积分（height standard deviation of point, HtSDS）、磷酸盐等的相关性，旨在初步探讨ISS 患儿血清Klotho、FGF23 与GH-IGF-1 轴之间的关系，为ISS患儿的发病机制提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

前瞻性选取2021 年3 月10 日—2022 年12 月1日于河北省人民医院儿科初次就诊并完善相关检查后确诊为ISS 患儿33 例为研究对象，其中男18例，女15 例，年龄4.0～13.1 岁，平均7.6 岁。纳入标准：（1）身高低于同性别、同年龄、同种族的健康儿童2 个标准差或处于第3 百分位数以下；（2）出生时身长及体重均在正常范围内；（3）两种作用机制不同的药物GH 激发试验（胰岛素+左旋多巴）提示GH 峰值≥10 μg/L；（4）伴或不伴骨龄延迟。ISS 诊断依据《基因重组人生长激素儿科临床规范应用的建议》［7］中相关诊断标准。

收集同期在我院儿童保健科健康体检的健康儿童29 例作为健康对照组，其中男14 例，女15例，年龄5.1～13.8 岁，平均9.8 岁。纳入标准：（1）年龄4～＜14岁；（2）身高处于同年龄、性别儿童正常范围内；（3）近3个月内未使用任何激素类或促身高药物；（4）无慢性肝肾病史、骨代谢疾病及近期骨折病史。

两组共同排除标准：（1）临床资料不完整；（2） 治疗期间失访；（3） 存在染色体异常；（4）患有其他基础性疾病，如内分泌系统疾病、骨骼系统疾病、肾脏系统疾病、心血管系统疾病、遗传代谢性疾病、心身障碍性疾病、营养不良等。

本研究已获得儿童家长的同意并签署知情同意书，并且已通过我院医学伦理会审核批准，审批号为（2021）科研伦审第（24）号。

1.2 体格测量和性发育状态评估

身高测量：由同一人在同一时间段（上午8:00—10:00）在同一台仪器上对所有入组儿童进行身高测量。免冠，脱掉鞋子，嘱患儿背向量尺，双脚跟并拢，脚尖分开大约呈45°角站立，双眼平视前方，枕部、背部、臀部及脚跟紧贴测量杆，测量者将测量仪器的水平板移到儿童的头顶，适当地收紧，连续测量2次，取平均值，以cm为单位。

体重测量：由同一人在同一时间段（上午8:00—10:00）在同一台仪器上对所有入组儿童进行体重测量。儿童穿单衣脱掉鞋子站于体重称中间，待指针稳定后方可读数，连续测量2 次取平均值，以kg为单位。

性发育状态：采用Tanner 分期系统，根据乳房、外阴的发育及月经来潮等情况来评估女童，根据睾丸大小、阴茎、有无变声、喉结等来评估男童［8］。

1.3 血清FGF23、Klotho、IGF-1测定及标准

所有受试者于清晨空腹状态下采血，并留取血清冷冻于-80℃冰箱保存。血清FGF23 及Klotho水平均采用ELISA 原理测定。本实验使用的人FGF23 ELISA试剂盒由武汉华美生物工程有限公司生产提供，灵敏度为0.78 pg/mL，精密度为批内变异系数（coefficient of variation, CV）＜8%，批间CV＜10%。人Klotho ELISA 试剂盒由北京四正柏生物科技有限公司生产提供，灵敏度为40.00 pg/mL，精密度为批内、批间CV均＜10%。

血清IGF-1通过化学发光免疫分析法检测，使用的试剂盒及全自动化学发光测定仪来自于深圳市新产业生物医学工程股份有限公司，灵敏度为2.50 ng/mL，精密度为批内CV≤10%，批间CV≤15%，由我院核医学科专业人员协助完成。IGF-1参考范围：1～5 岁为45～305 ng/mL；6～10 岁为50～410 ng/mL；11～15岁为80～900 ng/mL。

1.4 资料收集

收集两组儿童的资料。（1）一般资料：年龄、性别、年生长速率、身高、体重、体重指数（body mass index, BMI）、骨龄、性发育状态、出生史（胎次、胎龄、出生体重、出生身长等）、喂养史、家族史（父母身高及性发育情况）、既往病史等，并计算HtSDS、体重标准差积分（weight standard deviation of point, WtSDS）、体重指数标准差积分（BMI-SDS）。为校正性别、年龄、地区间的差异，对身高、体重及BMI 加以标准化，更加快速准确地判断该组儿童在所在参照人群中所处的位置。SDS=（实际测量值-同种族同年龄同性别人群平均值）/同种族同年龄同性别人群标准差［9-10］。（2）辅助检查：血清磷酸盐、血清钙、25-羟维生素D、FGF23、Klotho、IGF-1等。

1.5 治疗方法

ISS 组患儿均使用rhGH（注射用rhGH，长春金赛药业有限责任公司，规格：4.0 IU/1.33 mg/1 mL）治疗，剂量0.15～0.20 IU/(kg·d)，睡前半小时皮下注射。注意更换注射部位，并根据随访监测结果调整药物剂量。分别在治疗3、6、9个月时进行体格测量和生化指标评估。

1.6 统计学分析

采用SPSS 25.0 软件进行数据分析。正态分布的计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两样本t检验；偏态分布的计量资料采用中位数（四分位数间距）［M（P25，P75）］表示，组间比较采用Wilcoxon秩和检验。多个不同时间点数据符合正态分布及球形性假定采用单因素重复测量方差分析；对于不符合正态分布的数据采用Friedman非参数检验。计数资料采用例数和百分比（%）表示，组间比较采用卡方检验。相关性分析采用Spearman 秩相关检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组的一般资料及血清学指标比较

ISS组HtSDS、WtSDS、BMI-SDS低于健康对照（P＜0.05）。两组年龄、性别、青春期前患儿比例，以及血清磷酸盐、血清钙、25-羟维生素D、IGF-1、Klotho、FGF23 水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 ISS组和健康对照组一般资料及血清学指标比较

2.2 ISS 组不同治疗时间点生长参数及血清学指标变化

ISS 组患儿rhGH 治疗3、6、9 个月时HtSDS、IGF-1、Klotho 及FGF23 均明显升高（均P＜0.001），且治疗后，每个时间点与前一个时间点比较差异有统计学意义（P＜0.05）。每3 个月的△HtSDS、△IGF-1 的变化值呈上升趋势，治疗3 个月时△HtSDS、△IGF-1 增高最为明显（均P＜0.001）。治疗前后BMI-SDS、每3 个月△WtSDS 及△BMISDS 的变化值差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 ISS组不同治疗时间点生长参数与血清学指标比较

2.3 ISS 组血清Klotho、FGF23 水平与相关参数的相关性

ISS 组患儿治疗前Klotho 与FGF23、IGF-1、磷酸盐呈正相关（分别rs=0.462、0.522、0.417，P＜0.05），Klotho 与HtSDS 无相关性（P＞0.05）。治疗前FGF23 与IGF-1、磷酸盐呈正相关（分别rs=0.348、0.360，P＜0.05），FGF23 与HtSDS 无相关性（P＞0.05）。rhGH 治疗3、6、9 个月时，Klotho 与FGF23、IGF-1 呈正相关（分别rs=0.511、0.523、0.523，P＜0.05）， Klotho 与HtSDS 无相关性（P＞0.05）。rhGH 治疗3、6、9 个月时，FGF23 与IGF-1 呈正相关（分别rs=0.365、0.366、0.503，P＜0.05），FGF23 与HtSDS 无相关性（P＞0.05）。见表3～6。

表3 治疗前ISS组血清Klotho、FGF23水平与HtSDS、IGF-1、Klotho及磷酸盐的相关性

表4 治疗3个月ISS组血清Klotho、FGF23水平与HtSDS、IGF-1、Klotho及磷酸盐的相关性

表5 治疗6个月ISS组血清Klotho、FGF23水平与HtSDS、IGF-1、Klotho及磷酸盐的相关性

表6 治疗9个月ISS组血清Klotho、FGF23水平与HtSDS、IGF-1、Klotho及磷酸盐的相关性

3 讨论

Klotho基因在1997 年首次被发现，其表达缺陷与几种过早衰老的表现有关，包括软组织钙化、皮肤萎缩、性腺发育不良、低血糖、严重高磷血症、骨质疏松症及寿命缩短等［11］。Klotho 主要在肾脏的远端和近端肾小管、脑中的脉络丛和甲状旁腺中表达，但也在多种内分泌相关组织中少量表达，包括睾丸、卵巢和垂体［12］。据报道，在大鼠垂体瘤GH3细胞中，Klotho和碱性成纤维细胞生长因子共同作用来激活细胞外调节蛋白激酶1/2途径，进而诱导GH 分泌［13］。在GH3 细胞系、培养的大鼠垂体和培养的人GH 分泌腺瘤中研究显示，经过Klotho 治疗后GH 分泌增加了约2 倍［14］。Rubinek 等［15］首次证明了IGF-1 直接促进Klotho 脱落进而调节Klotho分泌，这种作用是通过蛋白激酶B-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白途径介导的。反过来，有研究证实Klotho能抑制小鼠肝细胞和心肌细胞中的胰岛素和IGF-1 的分泌［16］。Sze 等［17］报道了24例肢端肥大症患者的Klotho水平过高，经蝶窦手术后Klotho 水平恢复正常，GH 和IGF-1 水平也恢复正常。综上所述，Klotho 可能在ISS 患儿的生长发育过程中发挥一定作用。

本研究显示ISS 患儿血清Klotho 水平与正常儿童相比差异无统计学意义，经rhGH 治疗后Klotho水平持续上升，3 个月时升高幅度最明显。同时，IGF-1与Klotho呈现一致性变化，相关性分析显示，治疗前后IGF-1 与Klotho 呈明显正相关，推测Klotho 在ISS 儿童中与GH-IGF-1 轴存在某种关联。本研究中rhGh 治疗后ISS 患儿身高HtSDS 明显改善，同样在前3 个月增高最显著，但治疗前后Klotho 与HtSDS 无相关性，Klotho 与磷酸盐存在明显正相关，提示Klotho 并非直接促进其线性生长，可能通过调节IGF-1 等其他途径参与。Guarnotta等［6］及Rubinek 等［15］研究显示GHD 患者血清Klotho 的倍数增加与IGF-1 的倍数增加相关。Coopmans 等［18］研究亦提示肢端肥大症患者血清Klotho 和IGF-1 增长呈平行变化。在健康儿童中的研究也证实了这一点［19］。但Klotho 与GH-IGF-1 轴的具体机制有待进一步深入研究。

FGF23和Klotho介导的骨肾内分泌轴是磷酸盐稳态的主要调节因子。FGF23是在小鼠的脑中首先被发现的［20］，通过连锁分析发现导致FGF23 功能丧失的基因突变是引起常染色体显性遗传性低磷血症性佝偻病和肿瘤诱导的骨软化症的原因［21-22］。FGF23 由成骨细胞和骨细胞合成并分泌到体循环中，作用于肾脏、甲状旁腺、心脏、骨骼及其他器官［23］。在肾脏中，FGF23 通过下调近端小管的Na+偶联磷酸盐转运体NaPi-Ⅱa 的膜丰度来抑制磷酸盐的重吸收［24］。此外，FGF23 通过抑制肾脏中的25-羟维生素D 及1α-羟化酶来抑制1,25-(OH)2D3的合成［25］。FGF23 通过与FGFR1 受体结合发挥作用，并且需要Klotho作为辅助受体来增强其与受体的结合，从而参与FGF23 介导的信号转导，促进磷酸盐和钙稳态的调节。骨骼生长需要正向的磷酸盐平衡，GH/IGF-1 轴通过促进肾脏磷酸盐的重吸收和骨化三醇的形成来提高血清磷浓度，而FGF23和Klotho通过抑制磷酸盐重吸收而降低血磷水平，从而保持血磷稳定。FGF23、Klotho 与磷酸盐、1,25-(OH)2D3及GH/IGF-1 轴存在紧密联系，均在肾功能和磷酸盐转运中起着重要作用。因此，FGF23/Klotho轴对于正常的线性生长非常重要。

本研究显示，ISS 患儿血清中FGF23 水平与正常儿童相比无明显差异，经rhGH 治疗后FGF23 水平均较前增高，且与Klotho、IGF-1 及血清磷酸盐呈正相关。FGF23 与HtSDS 亦无相关性，这与Meazza 等［26］的研究结果一致。Klotho、FGF23 与HtSDS 无明显相关性，提示Klotho、FGF23 可能并非直接促进ISS患儿的线性生长，而是通过其他途径间接参与其生长发育。一项在98 例肾功能正常的儿童中的研究发现FGF23 与磷酸盐、IGF-1 呈正相关［27］。另一项在健康儿童中的研究也显示，血磷和肾小管最大磷吸收/肾小球滤过率与FGF23、Klotho呈正相关，Klotho与FGF23呈正相关［28］。在肢端肥大症患者中的研究也发现，体内高水平的GH 及Klotho，会导致高水平的血清磷酸盐存在［18］。本研究证实rhGH 治疗可促进血清Klotho、FGF23、IGF-1 水平增高，均存在正相关。因此，Klotho、FGF23与GH/IGF-1轴共同调控磷酸盐，在ISS儿童的线性生长方面发挥重要作用。

总之，rhGH 干预会促进ISS 患儿血清中Klotho、FGF23 水平的升高。血清Klotho、FGF23在ISS 患儿与IGF-1 相互作用，促进其追赶生长。Klotho、FGF23 与IGF-1 的一致变化表明三者在调节ISS线性生长中存在协同关系。

本研究的局限性是未对各组儿童性别、青春期状态与血清Klotho和FGF23水平的相关性进行研究，缺少有关营养和运动的完整信息，且入组例数较少，需要扩大样本量，延长随访监测时间，以获取更多的临床资料，为今后的研究工作提供更多的理论依据。

利益冲突声明：所有作者声明无利益冲突。