兰坪乌骨绵羊和普通绵羊血浆代谢组学比较分析

2023-12-04黄代涛张锦标和晓明高振东赵东祥种玉晴邓卫东

动物营养学报 2023年11期

黄代涛王波陆颖张锦标和晓明高振东王楷李雯赵东祥种玉晴邓卫东

(云南农业大学动物科学技术学院,昆明 650201)

兰坪乌骨绵羊作为世界上珍稀的遗传资源品种之一,于2009年被列入《国家畜禽遗传资源名录》。从外貌特征来看,兰坪乌骨绵羊的毛色与兰坪本地普通绵羊非常相似,需通过内部明显的“乌骨乌肉”特征进行区分。邓卫东等[1]报道,屠宰后的兰坪乌骨绵羊的内皮、肌肉、骨膜、肾脏、心脏、肺脏和气管等组织器官呈现乌黑色,与兰坪本地普通绵羊的鲜红色有所不同,这是因为兰坪乌骨绵羊体内存在大量的黑色素沉积[2]。通过对兰坪乌骨绵羊的遗传性能杂交试验证实了其乌质性状是可以遗传的,且红外光谱定性分析表明兰坪乌骨绵羊的黑色素与乌骨鸡相似,都属于真黑色素[3]。乌骨鸡在我国清代已有相关论述证明,其作为一种药食两用的滋补品,具有益气、滋阴和延缓衰老的功效[4],引起乌骨鸡和乌骨绵羊乌质性状的黑色素具有抗氧化和抗病性等作用[5]。兰坪乌骨绵羊因其肉质细腻、鲜美而不膻以及富含蛋白质、天然黑色素等极高的营养保健价值,具有学术研究价值,在中国享有“黄金羊”“药羊”等独特美誉,食用可延缓衰老、抑制肿瘤细胞形成、保护视力以及预防阿尔茨海默症等慢性炎症性疾病的发生[3],因此备受众多养殖户和消费者的青睐。邓卫东等[3]对兰坪乌骨绵羊和普通绵羊的血液生理生化指标进行了分析,结果显示兰坪乌骨绵羊的总抗氧化能力为(10.02±7.77) U/mL,显著高于普通绵羊的(5.30±1.68) U/mL;此外,兰坪乌骨绵羊的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和抗超氧阴离子(O2-·)水平显著低于普通绵羊,说明兰坪乌骨绵羊相对于普通绵羊具有更强的抗氧化能力。尽管代谢组学技术的应用越来越先进,但关于解决这一现象的代谢机制的信息仍然非常有限。

目前,对于兰坪乌骨绵羊血浆的非靶向代谢组学方面的研究较少,可用于分析的数据匮乏。因此,本研究旨在通过代谢组学剖析兰坪乌骨绵羊和普通绵羊血浆代谢物差异,探究兰坪乌骨绵羊和普通绵羊之间的种间差异带来的代谢机制变化,以期为中国特有的稀有乌质畜禽资源兰坪乌骨绵羊的繁殖育种和应用提供相关的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验设计及样品采集

试验动物来自云南省怒江州兰坪县,选择体重30～40 kg、年龄2.5岁、健康体况良好的兰坪乌骨绵羊(WG组)和兰坪本地普通绵羊(PT组)各12只,在相同饲养管理条件下(放牧加补饲),采集血液样品,静置20 min后,4 000 r/min离心15 min获取血浆样本,低温储存,用于后续的非靶向代谢组学检测。兰坪乌骨绵羊和普通绵羊血浆黑色素指标[酪氨酸酶(TYR)活性及真黑色素、总黑色素、褐黑色素]比较见表1,WG组血浆TYR活性显著高于PT组(P<0.05),WG组血浆褐黑色素浓度极显著高于PT组(P<0.01);WG组血浆真黑色素和总黑色素浓度高于PT组,但差异不显著(P>0.05)。

1.2 测定方法

采用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术进行非靶向代谢组学的分析,所检查的代谢物范围涵盖100～1 500 m/z。采用酶联免疫吸附测定方法测定兰坪乌骨绵羊和普通绵羊血浆黑色素指标。

1.3 数据分析

对代谢物进行多元统计分析,包括主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)、应用层次聚类(HCA)、代谢物相关性分析、受试者工作特征(ROC)曲线和曲线下面积(AUC),以确定标志性代谢物,并对这些标志性代谢物的生物学意义进行分析和解释。

2 结果与分析

2.1 PCA

如图1所示,通过PCA模型得分散点图分析表明,兰坪乌骨绵羊和普通绵羊样品之间明显分离。样品在主成分1(PC1)上的贡献率为20.59%,在主成分2(PC2)上的贡献率为9.89%,所有样品均在95%的置信区间内。基于这些结果,可以进一步对代谢组学数据进行分析。

图1 兰坪乌骨绵羊和普通绵羊样品的PCA模型得分散点图Fig.1 Scatter plot of PCA model scores of Lanping black-boned sheep and conventional sheep samples

2.2 PLS-DA

为了分析兰坪乌骨绵羊和普通绵羊样品之间的相似性和差异性,并筛选出差异的标志物,本研究以24个样品的峰面积值作为变量,建立了PLS-DA模型(图2)。结果显示,PLS-DA模型提取了2个主成分,其中R2Y(模型稳定性参数)为0.97,Q2Y(预测能力参数)为0.80,R2Y大于Q2Y表示模型不仅具有较高的稳定性和预测能力,同时该模型建立良好,能真实地反映客观事实。因此,本研究可以进一步探讨2组之间的差异。

WG_PT代表比较对,Intercepts:R2=(0.0,0.79),Q2=(0.0,-0.52)代表R2与Q2与Y轴交点的坐标。WG_PT represents comparison, and the Intercepts: R2=(0.0,0.79), Q2=(0.0, -0.52) represents the coordinates of the intersection of R2 and Q2 with the Y-axis.图2 PLS-DA得分散点图(A)和排序验证图(B)Fig.2 PLS-DA score scatter plot (A) and ranking verification plot (B)

2.3 差异代谢物筛选

依据变量投影重要性(variable importance in projection,VIP)>1、P<0.05以及|log2差异倍数(FC)|>1为筛选标准,确定了在2组之间存在着181种具有显著差异(P<0.05)的代谢物。在2组的比较中观察到48种代谢物表达上调,以及133种代谢物表达下调,上调和下调前12差异代谢物名称、分子质量、保留时间、log2FC、P值、VIP见表2。通过层次聚类分析热图显示,筛选出的181种差异代谢物能明显区分2组(图3),说明该差异代谢物可靠性高且能真实反映2组的情况。

图下方的代码代表羊只的编号。The code below represents the sheep’s number.图3 兰坪乌骨绵羊和普通绵羊显著差异代谢物的层次聚类分析热图Fig.3 Hierarchical clustering analysis heat map of significantly different metabolites between Lanping black-boned sheep and conventional sheep

表2 兰坪乌骨绵羊和普通绵羊差异代谢物(前12)Table 2 Differential metabolites of top12 between Lanping black-boned sheep and conventional sheep (top 12)

不同代谢物之间存在协同或拮抗关系,即某些代谢物在变化趋势上呈正相关,而另一些代谢物则呈负相关。通过对差异代谢物的相关性进行分析(图4),结果显示共有139种代谢物关系呈正相关,36种代谢物关系呈负相关。如2-(叔丁基)-1,3-噻唑烷-4-羧酸和N6-(2-呋喃甲基)-9H-嘌呤-6-胺呈正相关,但与其他18种代谢物呈负相关。此外其他18种代谢物之间存在正相关或无相关性。

相关性最高为1,为完全的正相关(红色);相关性最低为-1,为完全的负相关(蓝色);没有颜色的部分表示P值>0.05,图中展示的是按P值从小到大排序的前20的差异代谢物的相关性。The highest correlation is 1, which is completely positive correlation (red); the lowest correlation is -1, which is completely negative correlation (blue); the part without color indicates P-value>0.05, and the figure shows the correlation of the differential metabolites of the top 20 sorted by P-value value from smallest to largest.图4 差异代谢物相关性图(前20)Fig.4 Differential metabolites correlation diagram (top 20)

2.4 相关网络和代谢途径分析

差异代谢物间的相互作用关系网络分析结果显示,差异代谢物在完整通路分析中主要富集于20条生物化学通路(图5)。在这些富集通路中,观察到9条差异代谢物数量多且富集程度高的通路,即胆汁分泌、药物代谢-细胞色素P450、醛固酮调节钠的重吸收、癌症表达相关通路、前列腺癌、初级胆汁酸生物合成、α-亚麻酸代谢、泛醌和其他萜类醌生物合成以及类固醇激素生物合成;其余11条代谢通路差异代谢物数量较少。

图中横坐标为相应代谢通路中差异代谢物的数目/该通路中鉴定出总代谢物数目,值越大,表示该通路中差异代谢物富集程度越高。点的颜色代表超几何检验的P值,P值越小,说明检验的可靠性越大、越具统计学意义。点的大小代表相应通路中差异代谢物的数目,数目越大,代表该通路内差异代谢物就越多。The abscissa in the figure is the number of differential metabolites in the corresponding metabolic pathway/number of total metabolites identified in the pathway, the higher the value, the higher the degree of differential metabolite concentration in the pathway. The color of the dots represents the P-value of the hypergeometry test, and the smaller the P-value, the greater and more statistically significant the reliability of the test. The size of the dot represents the number of differential metabolites in the corresponding pathway, and the larger the number, the more differential metabolites within that pathway.图5 显著差异调节代谢物的代谢途径Fig.5 Significant differences regulate metabolic pathways of metabolites

这9条高度富集的代谢通路中,有的代谢物涉及了多条代谢通路。具体而言,胆汁分泌通路涉及了牛磺鹅去氧胆酸、吗啡-3-葡糖苷酸、尿酸、胆酸、石胆酸等10种差异代谢物;吗啡-3-葡糖苷酸和丙戌酸富集于药物代谢-细胞色素P450通路;醛固酮调节钠重吸收、癌症途径以及前列腺癌均涉及了可的松和氢化可的松;牛磺鹅去氧胆酸、胆酸和鹅去氧胆酸富集于初级胆汁酸生物合成通路;α-亚麻酸代谢通路中涉及了9S-羟基-10E,12Z,15Z-十八碳三烯酸[9(S)-HOTrE];泛醌和其他萜类醌生物合成通路中涉及了L-酪氨酸;最后,可的松、雌三醇、氢化可的松以及16-葡萄糖醛酸雌三醇富集于类固醇激素生物合成通路。

2.5 标志代谢物的筛选

在兰坪乌骨绵羊和普通绵羊的血浆代谢组学中,发现以下14种代谢物(牛磺鹅去氧胆酸、尿酸、胆酸、石胆酸、鹅去氧胆酸、哇巴因、可的松、氢化可的松、脱氧胆酸、丙戌酸、9(S)-HOTrE、L-酪氨酸、雌三醇和16-葡萄糖醛酸雌三醇)在2个羊种中具有较好的识别能力,其AUC大于0.5。其中去氧胆酸、胆酸、石胆酸、鹅去氧胆酸、氢化可的松和雌三醇的AUC超过0.8,表明这6种代谢物可以作为主要指标来识别兰坪乌骨绵羊的血浆代谢组学特征(图6)。

Specificity:特异性;Sensitivity:灵敏度。图6 兰坪乌骨绵羊标志代谢物ROC曲线Fig.6 ROC curve of marker metabolites in Lanping black-boned sheep

3 讨论

由于兰坪乌骨绵羊在食用和药用方面具有高度的价值,人们对该物种的兴趣和需求大大增加,这引发了许多研究人员对兰坪乌骨绵羊和普通绵羊之间差异的生物学机制的兴趣。在过去的十多年中,家畜代谢组学研究取得了显著的进展。然而相对于牛、猪等其他家畜物种的研究,绵羊代谢组学的研究仍处于相对滞后的状态。一项由Goldansaz等[6]利用LC-MS/MS技术对受孕前7 d到受孕后70 d的131份母羊血清样本进行了检测,发现与受孕率和产仔数相关的L-精氨酸、尿素、蛋氨酸、L-乳酸和缬氨酸5种生物标志物。此外Zhang等[7]发现过度放牧可显著降低绵羊增重速度和与免疫反应、营养代谢相关的血清生化指标,包括免疫球蛋白G、白蛋白、葡萄糖和非酯化脂肪酸含量。

目前对于兰坪乌骨绵羊血浆非靶代谢组学的研究还非常有限。本研究旨在通过兰坪乌骨绵羊和普通绵羊的血浆代谢组学分析,并确定2组之间的14种关键代谢物。通过识别这些代谢物,成功确定了6种可作为识别兰坪乌骨绵羊血浆代谢组学的主要指标的标志代谢物。其中4种代谢物(脱氧胆酸、鹅去氧胆酸、胆酸、石胆酸)表现出上调的趋势,而另外2种代谢物(氢化可的松、雌三醇)则呈现下调的变化。

3.1 胆酸类标志代谢物对兰坪乌骨绵羊营养物质消化吸收及抗病的影响

脱氧胆酸是一种与胆汁酸家族相关的胆酸类似物。在动物体内由肝脏合成,并通过胆囊储存和释放到小肠中,发挥重要的生理功能。一方面脱氧胆酸作为胆汁的主要成分之一,在小肠中促进脂肪的消化和吸收;另一方面脱氧胆酸还参与胆固醇(CHOL)代谢过程,并通过刺激胆囊收缩来调节胆囊功能。研究表明,高浓度的脱氧胆酸能够促进肝脏中CHOL的分泌。CHOL是机体重要的营养物质,作为细胞膜的主要组成成分,它在细胞膜的形成、维持细胞膜完整性和稳定性以及信号传导等方面发挥着重要的作用[8]。有研究显示,脱氧胆酸对由金黄色葡萄球菌引起的小鼠乳腺组织病理性损伤具有剂量依赖性的缓解作用,不仅降低乳腺组织中髓过氧化物酶(MPO)的活性和炎症评分,而且能有效保护乳腺腺泡结构的完整性,并抑制炎性细胞的浸润[9]。在本研究中,观察到兰坪乌骨绵羊血浆代谢中脱氧胆酸上调,表明兰坪乌骨绵羊在脂肪消化、CHOL代谢和抗炎能力方面强于普通绵羊。

鹅去氧胆酸是动物胆汁中最主要的天然初级胆汁酸[10],也是最丰富的亲水性胆汁酸之一。它在肠道中具有增强脂类物质和维生素的吸收能力,并在预防肝脏、肠道等器官疾病方面发挥重要作用。因此,鹅去氧胆酸是调节生命活动的重要因子之一[11]。Song等[12]研究显示,补充鹅去氧胆酸可以提高断奶仔猪的终生体重和平均体重,同时降低腹泻发生率,这表明鹅去氧胆酸能够改善仔猪的生长性能。在本研究中,观察到兰坪乌骨绵羊血浆代谢中鹅去氧胆酸上调,表明相比普通绵羊,兰坪乌骨绵羊在脂类吸收能力、肠道屏障功能以及幼龄时期的生长性能等方面具有更强的优势。

胆酸是一种存在于动物胆汁酸中的化合物,主要由肝脏通过直接合成CHOL而形成。早期的研究已证实胆酸具有抑菌和抗炎的特性[13]。进一步的研究表明,胆酸具有乳化脂肪、辅助CHOL的分解和脂肪吸收的作用,通过增大脂肪与胰脂酶接触的表面积,促进脂肪的消化。将胆酸添加到高脂饲粮中可以有效抑制小鼠的肥胖发展[14-15]。胆酸在不同的组织器官中发挥多样化的功能。在神经系统中,胆酸具有镇静和镇痛的作用;在呼吸系统中,胆酸能够平喘镇咳,并舒张平滑肌[16];在肌肉组织中,胆酸具有解痉的作用;在循环系统中,胆酸能够降低血压并调节心脏搏动。此外,胆酸还表现出抗病毒、抗真菌和解热的特性[17]。在肌肉组织中,胆酸具有解痉的作用;在循环系统中,胆酸能够降低血压并调节心脏搏动。此外,胆酸还表现出抗病毒、抗真菌和解热的特性。在本研究中,观察到兰坪乌骨绵羊血浆代谢中胆酸相比于普通绵羊上调,表明兰坪乌骨绵羊在脂肪的消化吸收能力、抑菌抗炎抗病等方面要强于普通绵羊。

石胆酸是哺乳动物排泄的一种重要胆汁酸之一,具备多种生理活性,包括抗菌和抗肿瘤等特性[18-19]。研究表明,胆汁酸与糖、脂代谢密切相关,并在调节糖、脂代谢过程中发挥重要作用[20]。石胆酸不仅延长了酵母在时间上的老化进程,还降低了来自不同组织和生物体的培养癌细胞的活力和增殖。这些有关CHOL衍生生物活性脂质的强大抗衰老和抗肿瘤作用的分子和细胞机制已被揭示[21]。在本研究中,兰坪乌骨绵羊血浆代谢中石胆酸上调,说明兰坪乌骨绵羊在抗菌、抗衰老和抗肿瘤等方面具有更强的能力。

3.2 激素类标志代谢物对兰坪乌骨绵羊健康和食用价值的影响

氢化可的松属于糖皮质类激素,对动物机体免疫过程的多个环节均具有抑制作用。它抑制巨噬细胞和其他抗原递呈细胞的功能,减弱它们对抗原的反应,从而削弱机体的体液免疫能力。此外,氢化可的松还可破坏淋巴细胞和效应B细胞,对机体的非特异性免疫和特异性免疫反应产生抑制作用[22]。先前的研究表明氢化可的松能够抑制软骨细胞和成纤维细胞的增殖能力,以及抑制成纤维细胞分泌胶原的过程[23]。另外,氢化可的松在一定范围内有利于奶牛乳腺上皮细胞合成乳蛋白,随着氢化可的松剂量的增加,该能力逐渐减弱甚至抑制奶牛乳腺细胞的增长[24]。本试验中,兰坪乌骨绵羊血浆代谢中氢化可的松下调,表明与普通绵羊相比,兰坪乌骨绵羊在机体免疫和乳蛋白合成等方面的能力较强。

雌三醇是一种属于天然雌激素的化合物[25],在畜禽养殖业中广泛使用。然而,由于食物链中存在残留的天然雌激素,对人体健康可能产生危害,可能通过改变人内分泌系统的活动,对神经系统和免疫系统造成损害[26]。过量摄入雌三醇可能导致多种不良效应,其中包括增加乳腺和子宫癌的风险、对生殖健康产生影响(过量雌三醇可能导致生殖系统不平衡和功能紊乱)、增加血栓形成的风险以及引发激素依赖性副作用。本试验中,兰坪乌骨绵羊的血浆中雌三醇含量低于普通绵羊,表明兰坪乌骨绵羊在食用价值和生殖健康方面优于普通绵羊。