添加饲料桑对围产期奶牛生产性能、免疫和抗氧化功能及瘤胃微生物区系的影响

黄军鹏 赵卫国 杨赵军 厉成敏*

(1.江苏科技大学生物技术学院,镇江 212100;2.山东美事达农牧科技有限公司,济南 251400)

围产期是指奶牛产前3周到产后3周的生理阶段,其饲养管理的水平直接影响奶牛的健康及产后生产性能的发挥。在此时期,奶牛能量需求增加,但干物质的采食量下降,分娩后需进行大量泌乳活动,导致所需要的能量超过了干物质采食量所提供的能量,造成奶牛处于能量负平衡状态。能量负平衡不仅影响产奶量,严重情况下可导致奶牛代谢性和感染性疾病(如生产瘫痪、乳房炎、酮病、子宫内膜炎、胎衣滞留等疾病)的发生,使得奶牛在整个分娩过程中免疫力降低,增加奶牛发病机率[1]。

饲料桑作为一种新型饲料原料,适口性好,桑叶中营养成分丰富而均衡,含有多种维生素、矿物质以及多种天然活性物质,又称蛋白桑,誉为“天然营养库”,其活性物质主要有黄酮类、多糖类、生物碱、植物甾醇类等,具有降血脂、降血压、降血糖、抗癌、抗氧化、消炎杀菌等生理功能。贾亚洲等[2]研究发现,在绒山羊饲粮中添加桑叶,不仅可以提高蛋白质营养水平,而且改善生长育肥羊的生产性能及肉品质。郭建军等[3]研究表明,在奶牛精料中添加5%的桑叶效果最好,可以提高乳蛋白和干物质的含量。宋敏等[4]研究发现,在饲粮中添加桑叶提取物,不仅降低腹泻率,而且提高断奶仔猪机体的抗氧化能力及免疫力。李胜利等[5]研究报道,在饲粮中添加饲用桑叶,可以提高乳蛋白率,有效降低牛乳中的体细胞数。叶添梅等[6]报道,生长猪饲粮中添加发酵桑叶粉,可以降低血清中葡萄糖、甘油三酯含量,增强机体的抗氧化能力。李莉等[7]在饲粮中添加15%的干桑叶,可以有效增加郏县红牛肌间粗脂肪和粗蛋白质含量,同时提高总氨基酸和不饱和脂肪酸含量,有助于优质牛肉生产。然而,饲料桑在围产期荷斯坦奶牛的应用效果鲜见报道。因此,本研究以围产期荷斯坦奶牛为研究对象,探讨饲料桑添加对荷斯坦奶牛生产性能、免疫和抗氧化功能及瘤胃微生物区系的影响,为饲料桑在围产期荷斯坦奶牛饲粮中的生产实践及科学添加提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2021年12月至2022年1月在镇江市长江乳业有限公司示范牧场进行。

1.2 主要试剂

试验所用饲料桑为发酵颗粒,购自江苏省某农业产业园,含有干物质90.05%,干物质中粗蛋白质含量为22.65%、粗灰分含量为5.99%。

1.3 试验设计

试验选取胎次(2～3胎)、体重[(600±50) kg]和产奶量相近的荷斯坦奶牛18头,采用单因素随机分组设计,分成3组,每组6头。对照组饲喂基础饲粮,试验组饲喂在基础饲粮中分别添加5%、10%饲料桑的饲粮。试验期42 d,包括预试期14 d(产前2周)和正试期28 d(产后4周)。

1.4 饲养管理

在试验期内,试验组和对照组奶牛进行分组饲喂。基础饲粮为全混合日粮(TMR),每日08:00和16:00各投料1次,自由饮水。基础饲粮参照NRC(2001)奶牛饲养标准配制,饲粮组成及营养水平见表1。

1.5 样品采集

1.5.1 产奶量与乳成分的测定

在奶牛产后第1、7、14、21、28天,采集奶样50 mL,按早∶中∶晚=4∶3∶3的比例混合采取,取50 mL加入溴硝丙二醇防腐剂,储存在4 ℃冰箱中,测定的指标包括乳蛋白、乳脂肪含量和体细胞数,样品送至南京农业大学(江苏省奶牛生产性能测定中心),采用Foss乳成分分析仪进行测定。

1.5.2 血样的采集与测定

于产后第1、7、14、21、28天,晨饲前通过尾静脉采血,血液样本采用肝素钠抗凝剂管收集,每头牛采集血液10 mL,在4 ℃静止30 min,静置后3 000×g离心15 min,分装至2 mL Eppendorf管中,-80 ℃冰箱保存,待测血浆免疫和抗氧化指标。

血浆免疫指标的测定:白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)含量均采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定。

血浆抗氧化指标测定:超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量均采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定。

1.5.3 瘤胃液样品的采集与测定

根据乳成分、血浆免疫及抗氧化指标的分析结果,选取对照组与10%饲料桑试验组进行瘤胃液采样和分析。在试验期最后1 d晨饲前经口腔进行瘤胃液样品采集,采集100 mL,并现场测定pH变化,瘤胃液经4层纱布过滤,其中20 mL转移至冻存管先进行液氮冷冻,然后放置-80 ℃保存,用于瘤胃微生物区系的测定。样品送至广州基迪奥生物科技有限公司进行瘤胃16S rRNA测序处理分析。

1.6 数据统计与分析

试验数据先采用Excel 2013进行初步整理,再通过GraphPad Prism 9.5.0软件进行分析,结果以“平均值±标准差”表示,使用Omicsmart进行16S rRNA基因组学数据信息分析,以P<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结 果

2.1 添加饲料桑对围产期奶牛乳成分的影响

根据图1-A可以发现,添加饲料桑对奶牛乳蛋白含量的影响没有显著差异(P>0.05),但是由图1-B可知,与对照组相比,添加饲料桑显著提高了奶牛产后第28天的乳脂率(P<0.05)。如图1-C所示,与对照组相比,饲粮添加饲料桑可降低牛乳中体细胞数,其中添加10%的饲料桑可以显著降低产后第21、28天牛乳中的体细胞数(P<0.05)。

Con:对照组 control group;Con+M5:5%饲料桑组 5% feed mulberry group;Con+M10:10%饲料桑组 10% feed mulberry group。下图同 the same as below。与对照组相比,*为差异显著(P<0.05)。图2和图3同。Compared with control group, * mean significant difference (P<0.05). The same as Fig.2 and Fig.3.图1 添加饲料桑对围产期奶牛乳成分的影响Fig.1 Effects of forage mulberry addition on milk composition of perinatal dairy cows

2.2 添加饲料桑对围产期奶牛血浆抗氧化指标的影响

由图2-A可知,与对照组相比,饲粮中添加10%的饲料桑可在产后第14、21天显著提高奶牛血浆中的GSH-Px活性(P<0.05);饲粮添加5%、10%的饲料桑可在奶牛产后第14天显著提高血浆中SOD活性(P<0.05)(图2-B),显著降低血浆中MDA含量(P<0.05)(图2-C)。

图2 添加饲料桑对围产期奶牛血浆抗氧化指标的影响Fig.2 Effects of forage mulberry addition on plasma antioxidation indexes of perinatal dairy cows

2.3 添加饲料桑对围产期奶牛血浆免疫指标的影响

由图3-A可知,与对照组相比,饲粮中添加5%饲料桑可在产后第14、21天显著降低奶牛血浆中IL-1β含量(P<0.05);添加10%的饲料桑在产后第14天可以显著降低血浆中IL-1β含量(P<0.05)。由图3-B可知,与对照组相比,饲粮中添加10%的饲料桑可在奶牛产后第21天显著降低血浆中IL-6含量(P<0.05)。饲粮中添加5%的饲料桑在产后第14天显著降低了血浆中TNF-α含量(P<0.05)(图3-C)。

图3 添加饲料桑对围产期奶牛血浆免疫指标的影响Fig.3 Effects of forage mulberry addition on plasma immune indexes of perinatal dairy cows

2.4 添加饲料桑对围产期瘤胃微生物区系的影响

通过对16S rRNA基因的V3～V4区域进行测序,由表2可以看出,测序覆盖度达到0.99,说明样品测定合理。本研究中2组共鉴别出1 400个操作分类单元(OTU),其中,875个OTU是2个组共有,占OTU总数的62.50%(图4)。由表2可知,10%饲料桑组Sobs指数、ACE指数和Chao1指数有高于对照组的趋势,但差异不显著(P>0.05)。另外,由图5-A可知,本研究中主要检测到10个差异瘤胃菌门,其中厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)是瘤胃中主要的优势菌门,并且对照组和10%饲料桑组的结果中优势菌门占总门类的85%以上。在门水平上,与对照组相比,10%饲料桑组拟杆菌门和厚壁菌门相对丰度有增加趋势,变形菌门相对丰度有下降趋势。由图5-B可知,在属水平上,2组中优势菌属均为普雷沃菌属-1(Prevotella_1)、琥珀酸弧菌科UCG-001(Succinivibrionaceae_UCG-001)、普雷沃菌属-7(Prevotella_7),对上述优势菌属的相对丰度进行组间差异性分析,2组差异均不显著(P>0.05)。通过LEfSe多级物种差异判别分析方法,共鉴别出12个物种为标志物,其中11个位于对照组,1个位于10%饲料桑组(图6)。

图4 OTU分布韦恩图Fig.4 Venn graph of OTU distribution

Bacteroidetes:拟杆菌门;Firmicutes:厚壁菌门;Proteobacteria:变形菌门;Spirochaetes:螺旋体门;Patescibacteria:骸骨细菌门;Fibrobacteres:纤维杆菌门;Kiritimatiellaeota:圣诞岛菌门;Cyanobacteria:蓝藻门;Tenericutes:软壁菌门;Planctomycetes:浮霉菌门;Unclassified:未分类;Other:其他;Prevotella_1:普雷沃氏菌属_1;Succinivibrionaceae_UCG-001:琥珀酸弧菌科_UCG-001;Prevotella_7:普雷沃氏菌属_7;Succiniclasticum:解琥珀酸菌属;Treponema_2:密螺旋体属_2;Succinivibrionaceae UCG-002:琥珀酸菌科_UCG-002;Fibrobacter:纤维杆菌属;Ruminococcus_1:瘤胃球菌属_1; Ruminococcaceae_UCG-014:瘤胃球菌科_UGG-014;Rikenellaceae RC9_gut_group:理研菌科_RC9肠道群。图5 瘤胃微生物门和属水平的群落分布Fig.5 Rumen microbial community distribution at phylum and genus levels

Favabacteriales:蚕豆属;Lactobacillus:乳杆菌属;Lactobacillaceae:乳酸杆菌科;Weissella:魏氏菌属;Lactobacillales:乳酸杆菌;Bacilli:杆菌纲;Bacteroidetes_bacterium_ADurbBinA104:拟杆菌门_细菌_ ADurbBinA104;Ruminococcus_sp_FC2D18:瘤胃球菌属_FC2D18;Selenomonas_ruminantium_subsp_lactilytica_TAM6421:月形单胞菌属_反刍动物_亚种_乳酸杆菌_TAM6421;Rhodocyclaceae:玫瑰茄科;Pseudomonadaceae:假单胞菌科;Treponema_saccharophilum_DSM_2985:密螺旋体_嗜糖菌_DSM_2985。图6 多级别物种差异判别分析结果Fig.6 Results of multi-level species difference discriminant analysis

表2 瘤胃液菌群α-多样性指数Table 2 Rumen microflora alpha-diversity indexes

3 讨 论

3.1 添加饲料桑对围产期奶牛乳成分和体细胞数的影响

随着现代农业的发展,奶牛场养殖水平不断提高,牛奶质量的检测指标主要包括乳蛋白、乳脂率和体细胞数[8],这些指标受环境、饲粮等因素的调控[9]。添加桑叶粉饲喂奶牛,不仅可以在一定程度上降低牛乳中体细胞数,同时有效提高乳蛋白率[3],采用青贮桑树枝饲喂奶牛可以显著提高乳脂含量[10]。与上述研究结果一致,本研究表明,饲粮中添加10%饲料桑可显著提高奶牛乳脂率,推测与饲料桑中主要活性成分有关。有关研究表明,桑叶黄酮可以提高奶牛乳腺上皮细胞的抗氧化性能,调节瘤胃菌群,影响瘤胃发酵[11-12],从而影响乙酸和β-羟丁酸为底物的脂肪酸的从头合成。另外,研究表明,在奶牛饲粮中添加棕榈酸对乳脂率的合成起到一定促进作用[13]。此外,在本研究中,饲粮中添加10%饲料桑也可以显著降低乳中体细胞数。体细胞数能够衡量乳腺内部感染程度,是保证奶牛健康和改善其生产性能的主要指标[14-15]。饲料桑的抗炎效果同样与其活性成分有关,如黄酮类化合物具有抑菌抗炎的作用,其有效基团硫代葡萄糖苷可以有效去除自由基,进而降低自由基对乳腺上皮细胞的损害,增强奶牛免疫力来减少牛乳中体细胞数[16-18]。综上所述,饲粮中添加饲料桑,可以有效降低牛乳中体细胞数,升高乳脂率,进而降低围产期奶牛乳腺炎症的发生,提高奶牛产奶性能。

3.2 添加饲料桑对围产期奶牛血浆抗氧化指标的影响

研究表明,围产期奶牛机体在经历妊娠、产犊和泌乳引起的生理负荷时,进行合理的饲养管理及环境调控,将降低奶牛能量负平衡被打破的风险,不易引起氧化应激的发生[19]。正常情况下,动物机体内的抗氧化系统是动态平衡状态,当机体被多种应激原刺激时,产生自由基不能及时清除,将会导致机体内抗氧化酶合成能力下降,同时内源性抗氧化水平降低,微妙的平衡被破坏,易导致机体的氧化损伤[20-21]。MDA是脂质过氧化的最终产物,通常用作生物标志物,其含量可以间接反映自由基的水平和指示氧化应激的程度[22]。研究表明,机体初级抗氧化系统由GSH-Px、SOD、CAT等组成[23]。据报道,桑叶可以通过提高血清中SOD、CAT和GSH-Px活性,降低血清中MDA含量,进而改善羔羊的抗氧化能力[24]。在本研究中,奶牛饲粮中添加饲料桑提高了血浆抗氧化指标GSH-Px和SOD活性,表明细胞外酶系统的抗氧化能力增强。该结果与桑葚青贮饲料作为功能性饲料在育肥后期的韩牛中研究结果[25]一致。有关研究发现,苜蓿黄酮可以通过增加抗氧化酶的活性来提高抗氧化能力,并缓解氧化应激,同时降低MDA的含量[26]。这种效果主要归因于饲料桑中的活性物质,例如黄酮类物质,其可以作为还原剂和供氢体,中和氧自由基,发挥抗氧化作用[27-28]。最近有关研究发现,饲粮添加桑叶黄酮不仅可以显著提高血清抗氧化酶的活性,还能同时降低水牛血清中MDA含量,从而有效缓解高温诱导的氧化应激[29]。万荣等[30]研究发现,饲粮中添加发酵桑叶可以降低荷斯坦犊牛血清MDA含量,调节抗氧化功能,从而促进动物健康。与上述研究结果大致相同,王嘉琦[31]研究发现,青贮桑枝叶替代部分饲粮,可以提高奶牛抗氧化能力,改善泌乳性能。综上所述,在饲粮中添加饲料桑可以提高奶牛血浆的抗氧化酶活性,降低围产期奶牛机体的氧化应激水平。

3.3 添加饲料桑对围产期奶牛血浆免疫指标的影响

围产期是奶牛生理情况的特殊时期,机体生理和环境的改变都会使得机体免疫力下降[32]。细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经过刺激产生的具有多功能的蛋白质分子,TNF-α、IL-6和IL-1β是巨噬细胞产生的主要促炎因子,在免疫防御和炎症过程中发挥着重要的作用[33-35]。王祖文等[36]报道,灌胃桑叶生物碱,可以在一定程度上降低肝纤维化小鼠机体血清中IL-6、TNF-α等炎性因子含量。Wang等[24]研究发现,添加桑叶青贮饲喂羔羊可以降低血清中IL-6和IL-1β的含量,表明饲料桑能够调节反刍动物免疫功能。崔艺燕等[37]研究发现,发酵桑叶饲喂商品育肥猪,可以改善血浆细胞因子[TNF-α、IL-6、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-22(IL-22)、干扰素-γ(INF-γ)]含量,提高育肥猪的免疫功能。与上述研究结果一致,本研究同样发现,饲粮中添加饲料桑显著降低血浆中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量,可以预防疾病对机体免疫反应过程中的应激反应,调节机体的免疫活性。以上结果说明,饲料桑可在一定程度上改善围产期奶牛机体的免疫功能,有利于改善动物机体的健康,但其对奶牛免疫调节具体作用机制尚未明确,还有待进一步研究。

3.4 添加饲料桑对围产期奶牛瘤胃微生物区系的影响

本试验对瘤胃液进行16S rRNA测序发现,10%饲料桑组共有1 143个OTU,饲料桑组独有268个OTU。与对照相比,10%饲料桑组瘤胃菌群α-多样性指数没有显著差异,表明饲料桑对瘤胃微生物区系丰度没有显著影响。本试验中,奶牛瘤胃中优势菌门为厚壁菌门、拟杆菌门和变形杆菌门,与之前的研究结果[38-39]一致。10%饲料桑组厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度有所提高,分别与结构性碳水化合物和非纤维性碳水化合物降解有关[40],表明饲喂饲料桑可能会通过调控微生物结构来改善动物健康,提高其生产性能。原因可能是本试验所用的试验奶牛品种、饲粮和基础饲粮的粗精比较接近,可能导致在瘤胃结构上未形成较大影响。本研究在属水平上发现,普雷沃菌属-1、琥珀酸弧菌科UCG-001为泌乳奶牛瘤胃优势菌群,这与Bowen等[41]、逄宾宾等[42]和Petri等[43]的研究结果一致,普雷沃氏菌属于拟杆菌门,在瘤胃中分布广泛,数量多,可以消化利用淀粉,并且降解植物性半纤维素、蛋白质、非纤维多糖,还可以参与多种微生物代谢[44]。琥珀弧菌属与瘤胃内琥珀酸的产生有关[45],主要代谢终产物是琥珀酸、乙酸及乳酸,琥珀弧菌可以把琥珀酸转化为丙酸,进而增加丙酸含量,从而提高乳糖含量和产奶量[46]。同时,Li等[10]研究发现,桑树枝和桑叶青贮饲料可以改善瘤胃菌群,增加纤维消化、丙酸合成及乳脂相关微生物的丰度,提高奶牛的产奶量。本试验添加饲料桑后,奶牛瘤胃液中普雷沃氏菌属相对丰度增加,说明添加饲料桑可能在一定程度上促进奶牛瘤胃内蛋白质的分解利用,还可能参与瘤胃内总挥发性脂肪酸的代谢[47]。综上可知,添加饲料桑可以在一定程度上改善瘤胃微生物相对丰度,进而促进瘤胃发酵,提高奶牛机体免疫性能和产奶量。

4 结 论

在本试验条件下,饲粮中添加适宜比例饲料桑对围产期荷斯坦奶牛瘤胃微生物区系无明显不良影响,且能够在一定程度上提高围产期奶牛机体的抗氧化水平和免疫功能,并可以显著提高乳脂率和降低牛乳中的体细胞数,进而提高乳品质。本研究结果可为饲料桑在奶牛生产中的推广应用提供一定参考价值,但饲料桑用作围产期奶牛饲料原料的适宜添加水平仍需进一步研究。