斑马鱼模型在神经退行性疾病研究中的应用进展

刘延英

（青岛黄海学院医学院基础医学教研室，山东青岛 266427）

斑马鱼（zebrafish，Danio rerio）是原产于印度东部、巴基斯坦、尼泊尔等地的一种热带淡水硬骨鱼，属于辐鳍亚纲（Actinopterygii）、鲤科（Cyprinidae）、短担尼鱼属（Danio），因其体侧有类似斑马样条纹而得名。 斑马鱼成鱼体长一般约为3 ～5 cm，寿命约为2 ～3 年。 19 世纪70 年代，美国俄勒冈大学著名遗传学家George Streisinger 研究小组对斑马鱼进行了系统研究，为斑马鱼日后能够成为一种模式动物奠定了基础。 后来，随着斑马鱼基因突变体筛选成功、测序技术和相关遗传操作技术的发展，斑马鱼以其独特的优势成为一种能够将胚胎学、遗传学和分子生物学有机结合在一起的模式动物被用于神经发育、遗传学和毒理学等相关研究领域。 由于斑马鱼的基因序列、信号传导通路与人类保持高度相似性，被用于某些疾病模型制备及药物筛选、器官发育与再生、生物安全等方面的研究［1-2］。 研究表明，斑马鱼神经系统的基本解剖结构、包含的细胞群和化学成分与人类神经系统在整体上相似且在进化上保守［3］，已成为研究人类神经系统疾病发病机制的理想模式动物。 本文就近年来，斑马鱼作为模式动物用于神经退行性疾病以及与神经系统相关疾病的研究进行综述。

1 斑马鱼

斑马鱼的生物学特性及特点包括：（1）体外发育、胚胎透明和强大的器官再生能力。 随着活体成像技术和遗传学操作技术的发展，斑马鱼已为研究器官发育和再生及某些疾病的发病机制和病理过程提供了理想的操作平台。 （2）极强的繁殖能力、成熟周期短和廉价的饲养成本等特点使斑马鱼在用于大规模遗传筛选、化合物筛选和小分子化合物的高通量筛选时优于小鼠等其他哺乳类动物。 （3）与细胞培养时忽略内环境的影响不同，斑马鱼在被用于药物筛选时能够提供活的生物有机体整体的毒理信息，增加了获得信息的可靠性。 此外，在斑马鱼早期胚胎中，其血脑屏障的不完整性有利于药物进入中枢神经系统，为研究人员进行大规模药物筛选提供了一个既经济又有效的筛选工具［4］。 总之，与其他脊椎模式动物相比，斑马鱼的上述优势，使其成为研究疾病发病机制的可靠动物模型，在人类某些疾病尤其是神经退行性疾病的发病机制等研究中经常应用。

2 斑马鱼与神经退行性疾病

中枢神经系统常见的神经退行性疾病主要有阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症等。 此外，由运动神经元损伤导致的运动系统疾病包括脊髓性肌萎缩、遗传性痉挛性截瘫和肌萎缩性侧索硬化症等患者最终也发生神经退行性病变。 神经退行性疾病的发病机制至今不明。 为了明确此类疾病的发病机制，研究者以不同类型的模式动物开展了大量研究。 斑马鱼因具有上述不同于其他模式动物的特点，在神经退行性疾病模型的选择上，备受研究者青睐。 已被广泛用于阿尔茨海默病等多种常见的神经退行性疾病的研究（图1）。

图1 斑马鱼模型用于神经退行性疾病的研究Figure 1 Zebrafish models used in the study of neurodegenerative diseases

2.1 阿尔茨海默病

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种起病隐匿、进行性发展的神经系统退行性疾病［5］。 在疾病早期，患者仅表现为老年性健忘，随着病情的进展，患者逐渐出现认知能力损害、人格与性情改变等精神症状，最终死亡。 尽管AD 的发病机制不明确，但是，现已证明AD 的发病与某些蛋白编码基因的改变密切相关［6］。 这些蛋白包括淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP），早老素1（presenilin 1，PSEN1）、早老素2（presenilin 2，PSEN2）、Tau 蛋白和载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）等。

迄今为止，不同的实验室用斑马鱼模式动物开展了上述与AD 发病密切相关基因的研究，并取得了一些研究成果。 在斑马鱼体内存在appa和appb两种基因。Appa基因突变的斑马鱼表现为朊病毒依赖的惊厥反应性增强［7］。Appa和appb的基因敲除导致反常的室管膜纤毛和小脑室的形成［8］。 通过原位杂交证明两种淀粉样蛋白前体蛋白分别与不同的神经细胞外黏附分子结合，为脊椎动物感觉回路的形成奠定了基础［9］。 此外，纳米药物在斑马鱼体内对Aβ 毒性抑制作用的发现，为AD 的治疗提供了新思路［10］。 近期研究证明，在含有高度磷酸化Tau 蛋白的斑马鱼模型中，Surfen 和oxalyl surfen 可以降低Tau 的磷酸化和减少神经元的丢失［11］。 另外，利用斑马鱼模型探讨药物通过血脑屏障通透性及对Tau 蛋白聚集影响的研究，对AD 治疗药物的靶向传递和提高疗效具有意义［12］。 最近，Kiper等［13］对利用斑马鱼基因模型研究AD 的病理进展进行了详细归纳和总结。

在斑马鱼体内，psen1 突变对机体的影响与年龄相关。 例如，在年龄为7 d 的斑马鱼，psen1 基因突变可影响机体内的氧化磷酸化、细胞外基质和铁离子稳态等［14］；而在成年斑马鱼（年龄：6 ～24 月）psen1 基因突变虽然改变了斑马鱼对低氧的反应［15］，但是其脑血管结构并未发生变化［16］。Psen2是斑马鱼体内的另外一种psen基因。 据报道，在正常的成年斑马鱼中，psen2 基因是黑色素性皮肤色素沉着所必需的［17］。Psen2 基因敲除的斑马鱼幼鱼表现为对刺激的过度运动反应和自噬作用的增强［18］。将人类PSEN2 基因（K115fs）表达在斑马鱼体内，斑马鱼的大脑则快速衰老［19］。

斑马鱼除了作为上述基因模式动物研究AD 的发病机制，也被用于研究其他因素对AD 发病的影响。 例如，以冈田酸（okadaic acid）诱导的AD 斑马鱼模型发现了镧硫烯酮亚胺-5-乙酯（lanthionine ketimine-5-ethyl ester）的神经保护作用［20］。 上述研究从不同的角度对AD 的发病机制进行了探讨，证明了斑马鱼用于AD 研究的可靠性和可行性。

2.2 帕金森病

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种常见的进行性发展的神经系统退行性疾病。 PD 的发生是由于中脑黑质-纹状体多巴胺能神经元通路的破坏，引起多巴胺能神经元的大量死亡，导致多巴胺的合成和分泌减少所致。 现已证明与PD 的发生密切相关的基因包括SNCA（α-synuclein）、DJ-1、PRKN（parkin）、PINK1（PTEN-induced kinase 1）和LRRK2（leucine-rich repeat kinase 2）［21］等。 据报道，在胚胎期，将突变A30P 或A53T 的α-synuclein mRNA 注射入斑马鱼体内能够导致幼鱼体内嗅觉纤毛的数量减少和长度缩短［22］。 某些基因敲除或缺失导致斑马鱼出现一些类似PD 的病理改变。Pink1 基因敲除阻碍了多巴胺能神经元的再生［23］；敲除park7（dj-1）基因影响氧化磷酸化过程尤其是对脑转录组中铁反应元件（iron responsive element，IRE）基因表达的影响，引起线粒体功能失常［24］；缺失parkin基因引起线粒体功能障碍和多巴胺能神经元丢失［25］等。 关于lrrk2 基因的作用，至今备受争议。 有报道称lrrk2 基因敲除导致斑马鱼胚胎发育畸形，酪氨酸羟化酶阳性神经元数目的减少［26］。 后来，Ren等［27］在相同的实验条件下，未能重复出此实验结果。 因此，关于lrrk2 在斑马鱼中的作用需要进一步研究与探讨。

PD 的发生除了和上述基因因素有关，与环境因素也密切相关［28］。 这些因素包括1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP ）、 6-羟基多巴胺（ 6-hydroxydopamine，6-OHDA）、鱼藤酮（rotenone）、百草枯（paraquat）和其他重金属离子如铁和锌等。 近期，利用MPTP 诱导的斑马鱼PD 模型，研究者们分别探讨了银杏内酯B（Ginkgolide B）［29］和前花青素（procyanidins）［30］的作用；以6-OHDA 诱导的斑马鱼PD 模型，不同的实验室分别研究了酪氨酸磷酸酶1B［31］和岩藻黄素的作用［32］；以鱼藤酮诱导的斑马鱼PD 模型被用于探究益生菌的作用［33］；以百草枯制备的斑马鱼PD 模型则被用于研究了黏附分子L1激动剂模拟物的作用［34］等。 近期的一篇综述对各种神经毒素分别诱导斑马鱼胚胎或幼鱼成为PD 模型的神经行为功能进行了系统分析和比较，这将对研究者如何选择合适的神经毒素诱导理想的PD 模型提供借鉴和参考［35］。 上述这些研究证明，环境毒素作用于斑马鱼可以成功地模拟出PD 的某些临床症状和/或病理学特征，为进一步明确PD 的发病机制开辟了一条新途径。

2.3 亨廷顿舞蹈症

亨廷顿舞蹈症（Huntington’s disease，HD）是一种常染色体显性遗传性疾病，大多数患者的临床症状主要表现为进行性运动异常，不自主的舞蹈样动作，伴随智力的衰退和精神症状，最终患者活动能力完全丧失直至死亡。 亨廷顿舞蹈病基因同源染色体的成功克隆，使明确该疾病的病理生理学成为可能。 遗传学检查表明，患者位于第4 号染色体上的亨廷顿（Huntingtin，HTT）基因有不稳定且数目大于42 的CAG 重复序列。 因为斑马鱼对亨廷顿舞蹈症基因同源物缺失的反应不同于小鼠［36］，所以更适合用于HD 发病机制的研究。 以往研究证明，在发育期的htt基因缺陷将导致斑马鱼形态学异常和中枢神经系统坏死［37-38］。 最近研究显示，htt在斑马鱼胚胎发育的早期可有可无，而在斑马鱼后期的发育中发挥重要作用［39］。 斑马鱼模型的应用，为明确HD 的发病机制和有效防治HD 的发生及降低该病的发病率带来希望。

2.4 肌萎缩性侧索硬化症

肌萎缩性侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一个发生在脊髓、脑干和运动皮层的运动神经元选择性丢失和颅脑神经核及脊髓前角运动神经元受损的渐进性神经退行性疾病。 患者主要表现为肌肉进行性萎缩，肌张力减退和混合性瘫痪，晚期可能出现吞咽困难，最终因呼吸衰竭而死亡。 家族遗传性ALS 与超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）基因SOD1 的突变有关［40］。 近期研究表明，一种合成的SOD/过氧化氢酶模拟化合物可以将SOD1G93R突变斑马鱼ALS模型的运动能力提高30%［41］。 除了SOD1 基因，其他基因如FUS（fused in sarcoma）、TARDBP和C9orf72 等也与ALS 的发病有关。 据报道，斑马鱼fus基因突变模型已经成功构建［42］。 斑马鱼体内tardbp编码的TDP-43 寡聚体的形成加速了ALS 的病理进程［43］。 最近，通过综合遗传分析ALS 遗传的可能性，研究者提供了核孔缺陷与ALS 联系起来的遗传证据，确定神经元剪接的改变在ALS 的重要性［44］。 关于C9orf72 基因与ALS 之间关系的研究，Fortier 等［45］对c9orf72 相关ALS 病理学的斑马鱼模型进行了概括总结，讨论了在理解疾病的发病机制方面的价值以及在药物研发中的潜在用途。

2.5 脊髓性肌萎缩

脊髓性肌萎缩（spinal muscular atrophy，SMA）是一种常染色体隐性遗传的神经退行性疾病。 患者的临床表现为进行性对称性以肢体近端为主的广泛性弛缓性麻痹和肌肉萎缩，但其智力发育及感觉均正常。 研究证明，SMA 的发病机制与维持运动神经元存活的蛋白（survival motor neuron，SMN）水平下降有关。 与人类拥有SMN1 和SMN2 两个基因不同，斑马鱼只有一个smn基因。 Boyd 等［46］报道了在斑马鱼SMA 模型中，体内生物能量状态调控运动神经元的敏感性和疾病病理进程。 斑马鱼SMA 模型经荧光相关光谱学分析显示其运动神经元轴突中并不存在SMN 的主动转运［47］。 在斑马鱼中，exosc9 基因的改变可以表现出人类脊髓性肌萎缩病的一些特征，影响RNA 外泌体，导致大脑半球萎缩［48］。 上述研究表明，斑马鱼SMA 模型的成功建立，为明确该病的发病机制，进行有效的预防和治疗提供了新思路。

2.6 遗传性痉挛性截瘫

遗传性痉挛性截瘫 （ hereditary spastic paraplegia，HSP）是一种比较少见的家族遗传性疾病，以常染色体显性遗传多见。 其病理改变主要是胸段脊髓双侧皮质脊髓束的轴索变性和/或脱髓鞘导致的进行性神经系统退行性疾病。 Wood 等［49］对容易引起HSP 的第4 个基因座SPG4 突变和该基因表达产物微管切割蛋白（spastin）的研究证明了对斑马鱼的spg4 基因敲除会导致明显的运动神经元的突触障碍和其他类型神经元连接性下降及广泛的中枢神经细胞凋亡。 这些研究成果有助于明确HSP 的发病机制。REEP1 是与HSP 发病相关的另一基因。 在斑马鱼幼鱼中，reep1 基因敲除导致运动神经元轴突生长缓慢，运动障碍、线粒体功能失常和氧化应激［50］。 Naef 等［51］对斑马鱼模型在HSP研究中的应用进行了概述。

2.7 斑马鱼模型在其他神经系统相关疾病研究中的应用

斑马鱼除了用于上述常见神经退行性疾病的研究，还用于其他与神经系统相关疾病的研究［52-61］。这些研究进一步证明，斑马鱼是一种广泛被认可的模式动物，助力医学发展与进步（见表1）。

表1 斑马鱼模型用于其他神经系统相关疾病的研究Table 1 Application of zebrafish models in the study of other nervous system related diseases

3 结语

斑马鱼模式动物本身也存在不足和应用局限性，如缺乏人类某些重要组织器官，给药途径受限制，国际尚无斑马鱼行为学检测和分析判断的统一标准，检测斑马鱼的抗体制备繁琐且数量较少等，但是此种模式动物的建立为人类明确某些疾病，尤其是神经退行性疾病的发病机制提供了新选择和新途径。 斑马鱼不但已经成为研究神经退行性疾病发病机制的一种理想的模式动物，而且在昼夜节律和学习记忆等复杂行为学研究和现代分子遗传机制研究中，也初步成为一种具有潜在应用价值的动物模型。 未来，随着新研究技术手段的不断发现和研究策略的改进与完善，斑马鱼这一模式动物的应用将成为早日明确人类神经退行性疾病的发病机制，开发和评价治疗药物的技术工具。