基于OPG/RANK/RANKL 信号通路探讨铁筷子对CIA 大鼠骨破坏的防护作用

单文婷，王潇，杨晓龙，艾飞，刘杨，魏鑫，刘霞

（贵州中医药大学，贵阳 550025）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）属于一种慢性进行自身免疫性疾病［1］，其病理特点包括慢性炎症浸润、血管翳形成、进行性骨侵蚀、骨丢失和关节破坏，在疾病晚期可导致多脏器的并发症［2］，且RA 女性的发病率高于男性，致残率约占全球人口的1% ～2%［3］。 目前临床上用于治疗RA 主要以抗风湿病药物、糖皮质激素及生物制剂为主，如甲氨蝶呤、肿瘤坏死因子（TNF）α 抑制剂、白细胞介素（IL-6）抑制剂、羟氯喹、甲泼尼龙［4］，这些药物对于RA 的关节改善有限，而脏器的不良反应较多且价格昂贵，因此需要找到在治疗RA 方面更具有临床意义和研究价值的药物。

中医认为RA 引起骨破坏的发生与发展属于气滞血瘀证范畴，而活血化瘀、理气止痛类药物在该类疾病的临床应用中可取得较好疗效［5］。 苗药铁筷子（helleborus thibetanusfranch）又名黑毛七、小桃儿七、九龙丹、见春花、九朵云、九莲灯，为腊梅科腊梅（ Chimonanthus） 属植物腊梅（ chimonanthus praecox L. Link）及山腊梅（chimonanthusitens Oliv）的干燥根［6］。 药用部位为植物干燥的根部，性温味辛，具有理气止痛、活血化瘀的功效［7］，是苗族人民常用于治疗RA、跌打损伤、疮疡肿毒的传统用药。目前临床研究和实验研究均已证明铁筷子醇提物能够显著改善血管翳异常增生以及骨关节的生理特性和功能异常［8］，但目前对其作用机制的认识还不够深入。

骨保护素（osteoprotegerin，OPG）是肿瘤坏死因子受体（tumor necrotic factor receptor，TNFR）之一，通过与核因子κB 受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）竞争性结合RANK（NF-κB 受体激活子），阻断RANK 与其配体结合，抑制破骨细胞的活化和成熟，诱导破骨细胞凋亡［9］。 由此，OPG/RANKL/RANK 信号通路构成新的调控网络，不仅调控破骨细胞的激活和骨重建，还在骨破坏相关疾病中起至关重要的作用。研究表明，类风湿关节炎组织中破骨细胞数量与活性明显增加，提示活化的破骨细胞参与RA 的骨破坏。 可见抑制破骨细胞的活化可能是治疗该疾病的关键。 基于此，本研究采用胶原和不完全弗氏佐剂复制CIA 大鼠模型［10］，通过观察铁筷子对CIA 大鼠的治疗效果及OPG/RANK/RANKL 信号通路关键因子的检测，以探讨铁筷子对模型大鼠骨组织的防护机制，为铁筷子治疗RA 奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

60 只5 周龄SPF 级Wistar 雌性健康大鼠，体重110 ～150 g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供【SCXK（京）2019-0010】。 本研究于室内温度21～25℃，相对湿度40% ～50%，每日光照时间5 h环境进行，饲养于贵州中医药大学动物研究实验中心【SYXK（黔）2021-0005】，通过贵州中医药大学实验动物伦理委员会的批准（20220108）。

1.1.2 药物

铁筷子购于贵阳市乌当区三江镇农场，经贵州中医药大学药学院生药教研室进行初步鉴定，铁筷子为山腊梅科腊梅属植物腊梅的根茎。 购来的铁筷子用水清洗弃其杂质后，进行晒干，将其打成粗粉。 称取粉碎后铁筷子1000 g，7 倍量甲醇回流提取2 次，每次3 h，甲醇热回流提取蒸干，将混合的滤液过滤以获得总提取物，减压浓缩后在水浴锅将提取物平铺于托盘蒸干浓缩得浸膏，将其放入4℃冰箱保存，动物给药时用25%乙醇溶解以达到所需生药浓度，以0.25、0.50、1.00 g/kg 作为后续实验的药物浓度，记为低剂量组、中剂量组、高剂量组。

1.1.3 主要试剂与仪器

甲氨蝶呤（上海上药信谊药厂有限公司，197220704）；牛Ⅱ型骨胶原蛋白（美国chondrex 公司，20022）、不完全弗氏佐剂（美国chondrex 公司，7002 ）； Molpure®Cell/Tissue Total RNA Kit（YEASEN 公司，19221ES50）；PrimeScriptRTreagent Kit（宝日医生物技术有限公司，RR047A）、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）（宝日医生物技术有限公司，RR820A）；苏木素染液（武汉塞维尔生物科技有限公司，G1004）；伊红染液（合肥博美生物科技有限责任公司，YE2080）；TRAP 染色试剂盒（德国Sigma-Aldrich，387A-1KT）；预染蛋白Marker（abclonalRM，19001）、RANKL（abclonal，A2550）、βactin（abclonal，AC033）、OPG（abclonal，A12997）、RANK（abclonal，A2100）、HRP Goat Anti-Mouse IgG（ H ＋ L） （ abclonal，AS003）； TNF-α （ boster，BA0131）； BMP-2 （proteintech，66383-1-Ig）； Goat Anti-Rabbit IgG （H ＋L） HRP（Affinity，S0001）。 实时荧光定量（qRT-PCR）仪（四川西陇科学有限公司）；转轮式切片机（2016 德国徕卡）；组织包埋机（常州郊区中威电子仪器）；JY-SCZ4 ＋型垂直电泳槽（北京君意东方电泳设备有限公司）；超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及实验干预

随机将大鼠分为正常组（Control）、模型组（Model）、阳性药物组（MTX）、低剂量组、中剂量组和高剂量组，共6 组，每组10 只。 用戊巴比妥钠（50mg/kg）对正常组以外的剩余大鼠进行腹腔注射麻醉后，进行第1 次免疫（Day 0）：在每只大鼠的尾根部3 cm 的位置进行皮下注射0.2 mL 的牛Ⅱ型胶原蛋白乳剂；在1 次免疫后7 d 进行2 次免疫：在大鼠的尾根部3 cm 的位置用0.4 mL 牛Ⅱ型胶原蛋白乳剂以加强免疫刺激。 胶原蛋白乳剂的配制：将等体积的2 mg/mL 牛Ⅱ型胶原溶液与1 mg/mL 不完全弗氏佐剂混合在冰浴状态下用匀浆器搅拌均匀，使其充分混合乳化，待牛Ⅱ型胶原蛋白乳液完全乳化后（乳化条件为：乳液滴水面成球状，不分散），置于冰上待用，以避免胶原蛋白的变性和失活。 CIA 模型构建成功后（模型成功标准：用游标卡尺法测定造模大鼠踝关节肿胀≥6 mm），于一次免疫第14天，正常组与模型组分别灌胃10 mL/（kg·d）浓度0.9%生理盐水；阳性药物组给予MTX，每周3 次，均按照实时体重计算给药量；低剂量组、中剂量组和高剂量组大鼠，0.25、0.50、1.00 g/kg 浓度铁筷子每天1 次，连续灌胃给药25 d。

1.2.2 形态指标检测及取材

末次给药后，禁食禁饮1 d，用戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射全麻基础下断颈处死大鼠，于冰上取左踝关节骨组织，做好标记，放入-80℃冰箱中保存。 取右踝关节骨组织，多聚甲醛固定一部分骨组织，做石蜡切片。 将包埋好的石蜡切成6 μm 厚的石蜡切片备用。 于冰上取骨组织并置入配制好10% EDTA 脱钙溶液中1 个月。 PBS 缓冲液冲洗3次，将1 mL 蛋白提取液添加到试管中，骨组织蛋白液超声匀浆化，离心，取上清，以备测定。

1.2.3 一般情况的观察

大鼠体重、进食量、行为状态、毛发等一般状况。 用游标卡尺分别在7、14、20、26、32、38 d 测量大鼠双侧后肢肿胀程度。

1.2.4 Micro-CT 检测

造模成功后RA 大鼠取材，对各组大鼠关节损伤进行Micro-CT 检测，扫描胫骨和踝关节骨组织获取骨体积分数（bone volume/tissuevolume，BV/TV）、骨密度（bone mineral density，BMD）及骨表面体积比（bone surface area/bone volume，BS/BV）。

1.2.5 踝关节组织病理学观察（HE 染色）

4%多聚甲醛将大鼠踝关节骨组织固定48 h后，将组织取出放入配制好的10% EDTA 脱钙溶液中1 个月。 脱钙组织置于75%乙醇脱水30 h、85%乙醇脱水4 h、95%乙醇脱水8 h、100%乙醇脱水2 h、 100%乙醇脱水1 h，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各45 min 进行透明处理后进行石蜡包埋，石蜡切片（厚为4 μm），用常规脱蜡至水，将各标本的蜡块各取5 张切片，再于苏木精-伊红（HE）染色下用光学显微镜观察，收集图像并进行分析。

1.2.6 踝关节组织病理学观察（TRAP 染色）

石蜡切片常规脱蜡至水，切片于纯水洗5 min后，吸水纸吸干。 置于盛有纯水的湿盒中，用纯水37℃孵育2 h。 倒去组织上纯水后，切片重新放入湿盒，加现配好的trap 工作液完全覆盖于切片组织上，放于37℃烤箱避光染色20 ～30 min。 倾去染液，水洗玻片，用抗酒石酸酸性磷酸酶浸染1 ～2 min（破骨细胞呈酒红色，细胞核呈蓝色）水洗；切片经3 次无水乙醇，每次5 min，放入二甲苯2 次，每次5 min。待染色切片透明后，滴加中性树胶封片剂密封切片，切片干燥后在显微镜下对其进行观察，并进行图像采集和分析。

1.2.7 qRT-PCR 技术测定踝关节组织中OPG、RANK、RANKL、TNF-α、BMP-2 基因表达

从-80℃超低温冰箱取出冻存的踝关节骨组织，液氮下研磨成粉，按TRIzol 试剂盒说明提取总RNA，根据逆转录试剂盒说明书进行操作获取cDNA，以β-actin 作为内参。 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计并合成，序列如表1 所示。 RT-qPCR 扩增体系为20 μL；Template（DNA）2 μL，上下游引物各0.8 μL，加无菌蒸馏水6.4 μL。 反应条件：42℃预变性2 min；扩增反应：95℃反应35 s，55℃反应30 s，72℃反应30 s，收集荧光信号，共45 个循环；熔点曲线55 ～95℃，扩增反应在QuantStudio 多重实时荧光定量PCR 仪上进行。采用2-ΔΔCt方法，比较各组OPG、RANKL、RANK、BMP-2、TNF-αmRNA 相对表达水平。

表1 实时定量荧光PCR 引物Table 1 Real-time quantitative fluorescent PCR primers

1.2.8 Western Blot 技术检测踝关节组织中OPG、RANK、RANKL、TNF-α、BMP-2 蛋白表达

在-80℃下，将保存的骨组织放入含有2%SDS裂解液的Ep 管中，试管内加入钢珠，用匀浆装置研磨，室温放置20 min，在室温下以10 000 r/min 离心30 min。 取上清液，用BCA 蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量，并对其总浓度进行测定，各实验组取50 μL，在95℃条件下变性15 min，取30 μg 蛋白样品，用10% SDS-PAGE 电泳分离1 h，之后将样品转移到PVDF 膜上，在室温下，用5%脱脂奶粉将PVDF膜封闭1 ～2 h，TBST 洗膜3 次，并在4℃时加入针对靶蛋白OPG（1 ∶2000）、RANK （1 ∶2000）、 RANKL（1 ∶2000）、TNF-α（1 ∶2000）、BMP-2（1 ∶2000）、 β-actin（1 ∶50000）的一抗孵育过夜，将膜用TBST 洗涤3 次后，与辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗体IgG 稀释缓冲剂（1 ∶5000）在室温孵育2 ～3 h，采用ECL 荧光显像技术，以β-actin 的表达量作为内参，应用Image J 软件进行条带灰度值分析，并以正常组结果为1，对各组蛋白表达结果进行归一化处理。

1.3 统计学分析

结果用平均值± 标准差（±s）表示，所有数据均使用SPSS 26.0 和GraphPad Prism 6 统计软件展开数据分析。 两组样本间的比较采用t检验；以单因子方差分析/重复计量方差分析（ANOVA）进行多组之间的比较，以P＜0.05 为具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状况及足肿胀度的影响

药物铁筷子有毒性，将总提取物以0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00 g/kg 的浓度梯度进行动物急性毒性检测，发现1.00 g/kg 以上浓度可致大鼠死亡，在急性毒性浓度梯度进行动物检测时发现1.00 g/kg 以上大鼠出现毒性反应，将1.00 g/kg记为安全范围。 故选择低剂量组（0.25 g/kg）、中剂量组（0.50 g/kg）、高剂量组（1.00 g/kg）。

一次免疫的第7 天记录测量足肿胀度、关节炎指数、体重（表2），各组大鼠体重增长率变化情况（图1A）、足底厚度改变情况（见图1B，1C）。 正常组大鼠发育良好、被毛致密光亮，日常活动及食、水摄入量均正常；与正常组相比，模型组大鼠在二次免疫后，被毛变黄无光泽，精神躁动不安，食、水摄入量减少，后肢沉重呈拖行状态、四肢明显肿胀，体重下降（P＜0.05）；与模型组相比，阳性药物组与高剂量组大鼠一般状况、体重（P＜0.05）、足肿胀度（P＜0.05）均显著改善。

图1 铁筷子对RA 大鼠体重和足肿胀度的影响（±s，n ＝10）Figure 1 Effect of helleborus thibetanus franch on body mass，foot and plantar swelling in rats with RA（±s，n ＝10）

表2 给药结束时各组小鼠的体重、足趾肿胀度测定结果（±s，n ＝10）Table 2 Results of body mass and toe swelling of mice in each group at the end of drug administration were measured（±s，n ＝10）

表2 给药结束时各组小鼠的体重、足趾肿胀度测定结果（±s，n ＝10）Table 2 Results of body mass and toe swelling of mice in each group at the end of drug administration were measured（±s，n ＝10）

注：与正常组相比，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05。 （下图/表同）Note. Compared with normal group，aP ＜0.05. Compared with model group，bP ＜0.05. （The same in the following figures and tables）

组别Groups左足趾肿胀度（mm）Swelling of left toe（mm）右足趾肿胀度（mm）Swelling of right toe（mm）关节炎评分（分）Arthritis score（score）体重（g）Wight（g）正常组Normal group2.24 ± 0.212.23 ± 0.190233.37 ± 3.75模型组Model group5.33 ± 0.83a5.32 ± 0.87a7.30 ± 1.57a194.08 ± 1.52a阳性药物组Positive drug group4.21 ± 0.54b4.87 ± 0.865.00 ± 2.08b192.94 ± 4.20低剂量组Low dose group4.83 ± 1.034.78 ± 0.915.67 ± 1.91b203.49 ± 5.06中剂量组Medium dose group4.41 ± 1.024.67 ± 1.155.33 ± 2.07b200.96 ± 3.72高剂量组High dose group3.75 ± 0.76b3.80 ± 0.73b5.03 ± 2.26b208.46 ± 3.07b

2.2 踝关节microCT 的影响

正常组踝关节表面光滑、外形完整（图2）。 与正常组比，模型组踝关节表面凹凸不平、外形不完整，骨组织表面出现啃噬样骨质破坏。 骨密度（BMD）和骨体积分数（BV/TV）均显著下降（P＜0.05），骨表面积体积比（BS/BV）则明显升高（P＜0.05）。 与模型组比，阳性药物组踝关节表面光滑，外形完整。 相比BS/BV 均降低（P＜0.05）；BMD、BV/TV 升高（P＜0.05）。 与阳性药物组相比，低、中剂量组踝关节表面较凹凸不平，外形不完整，骨组织表面出现啃噬样骨质破坏；BS/BV 降低（P＜0.05）；BMD、BV/TV 升高较明显（P＜0.05）。 高剂量组踝关节表面光滑，外形完整。 BS/BV 明显降低（P＜0.05），BMD、BV/TV 明显升高（P＜0.05），高剂量组效果与阳性药物组接近（表3）。 可见随着铁筷子剂量加大，BS/BV 降低更加明显，BMD、BV/TV升高明显，说明铁筷子药物作用呈量效关系。

注：白色箭头：骨组织破坏。图2 铁筷子对类风湿关节炎大鼠骨组织Micro-CT 的影响（x¯±s，n ＝3）Note. White arrow. Bone tissue destruction.Figure 2 Effect of helleborus thibetanus franch on Micro-CT of bone tissue in rheumatoid arthritis rats（x¯±s，n ＝3）

表3 铁筷子对类风湿关节炎大鼠骨组织Micro-CT 的影响（±s，n ＝3）Table 3 Effect of helleborus thibetanus franch on Micro-CT of bone tissue in rheumatoid arthritis rats（±s，n ＝3）

组别Groups骨量百分比（%）Bone mass percentage（%）骨表面体积（%）Bone surface volume（%）骨密度（%）Bone density （%）正常组Normal group84.07 ± 4.816.87 ± 0.280.76 ± 0.01模型组Model group59.66 ± 7.21a12.41 ± 1.90a0.59 ± 0.09a阳性药物组Positive drug group69.71 ± 2.85b10.77 ± 0.76b0.68 ± 0.15b低剂量组Low dose group83.87 ± 7.04b8.25 ± 1.97b0.76 ± 0.07b中剂量组Medium dose group81.21 ± 9.38b7.80 ± 2.05b0.76 ± 0.10b高剂量组High dose group83.18 ± 3.55b7.10 ± 0.52b0.78 ± 0.02b

2.3 踝关节组织病理学的影响（HE 染色）

正常组大鼠踝关节骨组织中的成骨细胞和骨细胞均有规整排列，且结构完整，滑膜表面光滑，没有明显增生，亦无炎性浸润（见图3）；模型组骨关节腔内有大量的成纤维细胞和大量的炎症细胞浸润，滑膜表面可见“啃噬”样病理改变，滑膜上的细胞排列不规则，关节腔增生、肿胀明显。 低、中、高剂量组较模型组明显减轻了滑膜的炎性细胞浸润和增生；其中，铁筷子高剂量组对踝关节滑膜组织和骨组织有显著的保护作用。

注：黑色箭头：啃噬样骨破坏；蓝色箭头：炎症细胞浸润；绿色箭头：骨关节腔滑膜组织。图3 各组大鼠踝关节不同组织病理形态学观察（HE 染色）（x¯±s，n ＝3）Note. Black arrow. Gnawing bone destruction. Blue arrow. Inflammatory cell infiltration. Green arrow. Synovial tissue.Figure 3 Observations on different histopathologic morphology of ankle joints of rats in various groups（HE staining）（x¯±s，n ＝3）

2.4 踝关节组织（TRAP 染色）

铁筷子低、中、高剂量组作用于RA 大鼠，破骨细胞的TRAP 染色结果，正常组破骨细胞数目明显较少；模型组破骨细胞数目显著增加（图4），有明显的骨破坏形成；与模型组相比，铁筷子中剂量组和铁筷子高剂量组干预下破骨细胞数量减少，大鼠骨损伤程度减轻，证明了铁筷子可以抑制RANK 诱导的破骨细胞的生成。

注：蓝色箭头：破骨细胞。图4 各组大鼠踝关节破骨细胞活化情况观察（TRAP 染色）（x¯±s，n ＝3）Note. Blue arrow. Osteoblasts.Figure 4 Observation of osteoclast activation in the ankle joint of rats in each group（TRAP staining）（x¯±s，n ＝3）

2.5 踝关节骨组织OPG、RANK、RANKL、TNFα、BMP-2 基因表达的影响

采用qRT-PCR 对类风湿关节炎大鼠踝关节骨组织中TNF-α、RANKL、RANK、OPG、BMP-2 mRNA水平进行检测（图5）。 结果显示，与正常组相比（表4），模型组大鼠踝关节骨组织OPGmRNA 表达水平显著下降（P＜0.05），TNF-α、RANKL、RANK、BMP-2 mRNA 表达显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，铁筷子高剂量组大鼠踝关节骨组织OPG、BMP-2 mRNA表达升高，TNF-α、RANKL、RANK表达降低，改善效果最为明显（P＜0.05）。 与阳性药物组相比，铁筷子中剂量组OPG、BMP-2 mRNA 表达升高（P＜0.05），TNF-α、RANK表达降低（P＜0.05）；铁筷子低剂量组大鼠踝关节骨组织OPG、BMP-2 mRNA 表达升高，TNF-α表达降低，具有一定的改善作用（P＜0.05）。

注：Ⅰ：正常组；Ⅱ：模型组；Ⅲ：阳性药物组；Ⅳ：低剂量组；Ⅴ：中剂量组；Ⅵ：高剂量组。图5 铁筷子对类风湿关节炎大鼠骨组织中OPG/RANK/RANKL 通路关键蛋白表达水平（x¯±s，n ＝3）Note. Ⅰ. Normal group. Ⅱ. Model group. Ⅲ. Positive drug group.Ⅳ. Low dose group. Ⅴ. Medium dose group. Ⅵ. High-dose group.Figure 5 helleborus thibetanus franch on the Western Blot expression level of OPG/RANK/RANKL pathway in bone tissue of rheumatoid arthritis rats（x¯±s，n ＝3）

表4 铁筷子对类风湿关节炎大鼠骨组织中OPG/RANK/RANKL 通路mRNA 表达水平（±s，n ＝3）Table 4 Effects of helleborus thibetanus franch on mRNA expression levels of OPG/RANK/RANKL pathway in bone tissue of rheumatoid arthritis rats（±s，n ＝3）

表4 铁筷子对类风湿关节炎大鼠骨组织中OPG/RANK/RANKL 通路mRNA 表达水平（±s，n ＝3）Table 4 Effects of helleborus thibetanus franch on mRNA expression levels of OPG/RANK/RANKL pathway in bone tissue of rheumatoid arthritis rats（±s，n ＝3）

组别GroupsOPGRANKRANKLBMP-2TNF-α正常组Normal group1.00 ± 0.001.00 ± 0.001.00 ± 0.001.00 ± 0.001.00 ± 0.00模型组Model group0.27 ± 0.05a1.63 ± 0.02a2.59 ± 0.28a0.46 ± 0.07a4.46 ± 0.04a阳性药物组Positive drug group0.76 ± 0.09b1.04 ± 0.12b1.05 ± 0.13b0.34 ± 0.01b1.02 ± 0.13b低剂量组Low dose group0.28 ± 0.011.94 ± 0.03b2.76 ± 0.050.23 ± 0.01b3.44 ± 0.06b中剂量组Medium dose group0.31 ± 0.041.60 ± 0.061.41 ± 0.05b0.29 ± 0.02b2.27 ± 0.08b高剂量组High dose group0.60 ± 0.02b0.88 ± 0.14b1.00 ± 0.04b0.31 ± 0.02b1.42 ± 0.05b

2.6 踝关节骨组织OPG、RANK、RANKL、TNFα、BMP-2 蛋白表达的影响

与正常组相比（表5），模型组大鼠踝关节骨组织中TNF-α、RANKL、RANK蛋白表达水平升高（P＜0.05），OPG、BMP-2 蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，阳性药物组、铁筷子中、高剂量组大鼠踝关节滑膜组织中TNF-α、RANKL、RANK蛋白表达水平降低（P＜0.05），OPG、BMP-2 蛋白表达水平升高（P＜0.05），而铁筷子低剂量组与阳性药物组比较差异无显著性（P＞0.05）。

表5 铁筷子对类风湿关节炎大鼠骨组织中OPG/RANK/RANKL 通路关键蛋白表达水平（±s，n ＝3）Table 5 Expression levels of key proteins of OPG/RANK/RANKL pathway in the bone group of rheumatoid arthritis rats by helleborus thibetanus franch（±s，n ＝3）

表5 铁筷子对类风湿关节炎大鼠骨组织中OPG/RANK/RANKL 通路关键蛋白表达水平（±s，n ＝3）Table 5 Expression levels of key proteins of OPG/RANK/RANKL pathway in the bone group of rheumatoid arthritis rats by helleborus thibetanus franch（±s，n ＝3）

组别GroupsOPGRANKRANKLBMP-2TNF-α正常组Normal group1.25 ± 0.130.24 ± 0.020.50 ± 0.090.64 ± 0.040.11 ± 0.01模型组Model group0.44 ± 0.05a0.56 ± 0.05a0.78 ± 0.07a0.19 ± 0.02a0.59 ± 0.04a阳性药物组Positive drug group1.06 ± 0.11b0.40 ± 0.03b0.64 ± 0.060.56 ± 0.03b0.28 ± 0.01b低剂量组Low dose group0.69 ± 0.050.51 ± 0.030.73 ± 0.060.31 ± 0.03b0.47 ± 0.03b中剂量组Medium dose group0.91 ± 0.08b0.43 ± 0.03b0.64 ± 0.050.40 ± 0.03b0.41 ± 0.02b高剂量组High dose group1.03 ± 0.08b0.41 ± 0.04b0.61 ± 0.07b0.52 ± 0.04b0.34 ± 0.02b

3 讨论

RA 是一种以关节腔内滑膜异常增生、血管翳组织增多，骨破坏为病理特征的对称性慢性自身免疫疾病［11］。 其基本病理机制是滑膜组织炎症过程中滑膜细胞增生，伴有血管翳形成，软骨和骨受损，最后导致关节畸形和功能丧失［12］。 病理变化可能是由滑膜细胞损伤、滑膜组织浸润过程中炎症细胞释放的促炎细胞因子、趋化因子等因素共同作用引起的［13］。 有研究报道，炎症因子在RA 的发展中起着重要作用［14］。 RA 发病初期患者会感到关节肿胀、屈伸不利、晨僵产生疼痛、关节变形、严重会导致残疾并伴随全身性并发症、脏腑功能的紊乱［15］。尽管RA 在临床治疗中取得一定的进展，如利用生物制剂、激酶抑制剂、MTX 等进行治疗，但上述药物均存在因众多不良反应，总体疗效仍不理想，因此寻找副作用小且疗效确切的抗RA 药物十分重要。

在RA 的模型中，CIA 模型被研究得最为广泛，与人类RA 在形态学上有许多相似之处，包括血管翳的形成、滑膜炎和软骨的模式以及骨侵蚀［16］。 因此，本研究采用抗体牛Ⅱ型胶原和不完全弗氏佐剂配成胶原蛋白乳剂诱导RA 大鼠模型，模型组大鼠出现食欲不振、体重减轻、足爪肿胀度升高等典型症状，提示RA 大鼠模型的成功建立。

苗药铁筷子是一种具有理气止痛、祛风解毒作用的药物，主治风湿痹痛、胃痛、腹痛等常见的疼痛病症，是苗族常用于治疗风湿痹痛、跌打损伤的药物之一，对于消除关节肿胀，改善关节功能具有较好的疗效［17］。 在此疗效上，贵州许多医药企业还在此基础上以铁筷子为主开发了“筋骨伤喷雾”“通络骨宁”等药物，具有祛风除湿、通经活血、败毒止痛的功效，此外，铁筷子还是苗药透骨香方中的主要方药［18］。

研究证实，铁筷子具有抗菌、抗炎症、抗肿瘤和止痛等多方面的功能，其提取物对RA 有着较好的治疗作用，能减轻关节肿胀程度、抑制血清炎症因子TNF-α、IL-1β、PAF，还能明显下调关节组织中HIF-1α 及VEGF、MMP-3 的表达［19-20］。

RA 局灶骨破坏主要发生在关节表面骨血管翳附着处和软骨及骨小梁处，且破坏处组织中破骨细胞数量与活性明显增加［21］，研究显示破骨细胞的活化是RA 的骨质破坏的关键环节。 RANKL/RANK/OPG 信号通路是破骨细胞分泌的一种跨膜信号分子，在RA 发病的骨破坏过程中发挥着重要作用。RANKL、RANK 及OPG 均属于糖蛋白，RANKL、OPG在成骨细胞中发挥重要作用，抑制破骨细胞的分化和活性。 而RANK 蛋白在破骨细胞前体细胞有高表达。 RANKL 可以通过诱导破骨细胞参与促进骨质破坏，而OPG 则可以通过抑制RANKL 与其受体RANK 的结合来阻止骨质破坏，RA 病理过程中产生的多种促炎细胞因子上调该信号通路，刺激破骨细胞的活性，从而导致骨破坏。 因此防治RA 骨破坏的调节RANKL 和OPG 表达之间的相对平衡有助于预防和治疗骨破坏。 本实验通过Micro-CT 检测：在铁筷子各治疗组中，相对于低剂量组，高剂量组铁筷子的大鼠骨量和骨密度明显增高，骨表面体积指数显著降低；高剂量组对RA 大鼠的关节骨质破坏起到了保护作用［22］。 TRAP 染色结果提示：与低剂量组相比，中剂量组和高剂量组干预下TRAP 染色阳性破骨细胞数量减少，铁筷子有效抑制了RA 大鼠关节破骨细胞的生成和活化。 进一步检测结果显示：在qRT-PCR 结果中，铁筷子不同剂量3 组对比，只有铁筷子高剂量组OPG mRNA 相对表达明显上调（P＜0.05），证明铁筷子可以有效抑制RANK的转录和表达，同时促进OPG、BMP-2 的转录和表达，其中以铁筷子高剂量组改善效果最为明显。 上述结果提示，铁筷子可能通过调节OPG/RANKL/RANK 信号通路，抑制破骨细胞的生成与活化，从而对RA 大鼠的骨关节起到保护作用。

本项目以RANKL/RANK/OPG 系统为切入点，从防治骨质破坏的角度，综合运用植物化学、药理学以及分子生物学等研究手段，观察铁筷子对RA的治疗作用，探索其治疗机制，为充实铁筷子治疗RA 的科学内涵提供新的思路。