评价白蛋白相关药物动物模型的研究进展

资崯，宁丽，周小青，唐成程

（广东省医学大动物模型重点实验室，华南生物医药大动物模型研究院，生物科技与大健康学院，五邑大学，广东江门 529000）

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是血浆中含量最丰富的蛋白质，占血浆蛋白总量的40%，与脂肪酸、激素和化学药物在内的多种物质进行可逆结合，调节这些物质在体内的运输，因此也是一种天然的运输载体［1］。 白蛋白体内半衰期为19 d［2-4］，远高于除免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）以外的其他血浆蛋白，FcRn 受体（neonatal Fc receptor ，FcRn）是白蛋白半衰期的主要调节因子［5-8］。 FcRn 受体最初发现于肠道，功能主要为新生幼体提供被动免疫。 随后发现FcRn 是血液中IgG 和白蛋白的特异性受体，几乎表达在所有细胞表面［9-11］。 FcRn 与白蛋白的结合具有pH 依赖性，弱酸性环境下结合，中性或碱性条件下解离［12-13］。血管内皮细胞是FcRn 介导白蛋白再循环的主要场所，包含白蛋白的细胞外液被血管内皮细胞非特异性胞饮后，白蛋白与含有FcRn 的酸化内体结合形成复合物，随后该复合物被转运至细胞膜表面，暴露于血液中，由于血液中pH 值为微碱性，复合物解离，白蛋白再次被释放至血液循环。 而在酸化内体中未能与FcRn 相结合的蛋白则会被运送至溶酶体中降解［7］。

由于在血浆中含量丰富、结合位点多、半衰期长、不会产生免疫原性等诸多优势使得白蛋白被广泛应用于药物载体研究，以延长药物的半衰期，改善药物的药代动力学特征［14-15］。 目前基于白蛋白的药物研发主要有两种：（1）重组白蛋白药物：重组白蛋白药物又包括两类，一类是通过共价键作用针对白蛋白的氨基酸进行修饰，如目前正处于三期临床实验用于治疗癌症和关节炎疾病的人血清白蛋白偶联甲氨蝶呤（ methotrexate-human serum albumin，MTX-HSA）［16］；另一类是通过基因融合技术［17］将治疗性多肽或者蛋白与白蛋白融合，这些治疗性多肽或者蛋白包括凝血因子［18］、干扰素［19］等。（2）白蛋白结合药物，即将药物进行脂肪酸化或亲白蛋白有机小分子修饰后，药物通过脂肪酸或有机小分子与内源性白蛋白结合位点结合，如已经上市的用于治疗糖尿病的药物 Levemir［20］和Victoza［21-22］，用于治疗癌症的Abraxane［23］等。

建立用于评价白蛋白相关药物的动物模型是白蛋白相关药物开发与研究中的重要环节。 随着对白蛋白认识的深入、实验动物学的不断发展以及基因编辑等技术的高速进步，用于评价白蛋白相关药物动物模型种类也更加全面。 本综述概括了用于评价白蛋白相关药物药代动力学的啮齿类与非啮齿类动物模型，为白蛋白相关药物进一步研究发展提供一定参考。

1 白蛋白相关药物啮齿类动物模型

啮齿类动物模型因其操作简便、获得容易、繁殖周期短，具有经济、可重复性高等优势，被广泛应用于药物临床前药效评价。 目前，白蛋白相关药物啮齿类动物模型主要包括野生型鼠模型和基因修饰小鼠模型两大类。

1.1 野生型小鼠模型

野生型（wild type，WT）小鼠（表1）具有遗传背景明确、品系多、价格便宜等优势，此外，鼠与人类有大约90%的相似基因，许多生理通路在临床上是相关的［24］，成为早期白蛋白相关药物药代动力学研究的一线模型［25］。 例如，研究人员通过将锚蛋白重复结 构 域 （ designedankyrin repeat proteins，DARPins）［26-29］与鼠白蛋白（mouse serum albumin，MSA）共价结合后注入到野生型小鼠中，使其血浆半衰期从原来的几分钟延长到50 h 左右，而在进一步将与白蛋白结合的DARPins 结构域与其他DARPins 结构域结合时，白蛋白相关药物在小鼠的半衰期进一步提高了48%［30-31］。 除此之外，在WT小鼠中检测白蛋白结合多肽融合到其他蛋白质结构域的体内代谢，如将链球菌蛋白G 结构域（albumin-binding domain，ABD）与Herceptin 的Fab（fragment of antigen binding，Fab）片段、二抗或者小螺旋蛋白结合，在小鼠体内检测发现血浆半衰期分别从2.1 h 延长到20.9 h、5.6 h 延长到47.5 h 和30 min 延长到41 h［32-36］。

表1 白蛋白相关药物评价实验动物比较Table 1 Comparison of albumin-related drugs in laboratory animals

FcRn 是白蛋白长半衰期的主要调节因子，体外研究表明小鼠FcRn（mouse FcRn，mFcRn）对MSA的结合能力比对HSA 的结合能力高25 倍［17，37］。 因此，虽然白蛋白相关药物体内血浆半衰期延长在WT 小鼠模型中被成功模拟，但mFcRn 对于体内MSA 的高结合力可能会使与mFcRn 结合的白蛋白相关药物明显减少，导致用野生型小鼠评价重组白蛋白药物的半衰期所获得的数据可能低于实际值。已经证明，在低白蛋白患者中注射重组人白蛋白的循环半衰期相较于正常患者增加了4 ～5 倍，这可能是由于患者中内源性白蛋白对FcRn 受体的竞争较少［38］，导致注射的重组人白蛋白与FcRn 受体的结合增加，从而导致其半衰期相较于正常患者有所增加。

mFcRn 对于MSA 及HSA 结合力的高差异性，使得WT 小鼠模型用于评价白蛋白相关药物受到质疑，为此科学家开发了一系列的基因修饰动物模型用于白蛋白相关药物的药代动力学评价。

1.2 基因修饰小鼠模型

基因修饰小鼠模型是指通过基因编辑对小鼠特定基因进行改造而获得表达目的基因的小鼠，该类模型广泛应用于各类药物临床前研究。 目前用于评估白蛋白相关药物药代动力学的基因修饰小鼠包括以下3 类：（1）人FcRn（humanFcRn，hFcRn）单基因修饰（hFcRn＋/＋）小鼠；（2）hFcRn、小鼠白蛋白基因（mousealbumin，mAlb） 敲除双基因修饰（hFcRn＋/＋，mAlb-/-） 小鼠；（3）hFcRn、人白蛋白（humanalbumin，hAlb） 双基因修饰（hFcRn＋/＋，hAlb＋/＋）小鼠。

1.2.1hFcRn单基因修饰（hFcRn＋/＋）小鼠

已有研究表明mFcRn 对MSA 及HSA 的结合能力存在明显差异，为了更好地模拟白蛋白与FcRn之间的相互作用，科研工作者构建了hFcRn＋/＋小鼠模型，主要包括Tg276 和Tg32［39-40］。 这两类小鼠都是通过在mFcRn第一外显子处插入Neomycin 破坏小鼠内源性mFcRn的完整表达。 并且用hFcRn替换小鼠mFcRn基因。 Tg276 小鼠在CAG 启动子的控制下表达hFcRn基因cDNA，而Tg32 小鼠则在hFcRn启动子的控制下表达含有完整hFcRn基因组DNA 序列［41］。 HSA 的血浆半衰期对比于WT 小鼠62.4 ± 2.4 h，在Tg32 的血浆半衰期为139.2 ±12 h［42-44］，与HSA 在人类中的血浆半衰期更加接近，说明该模型相较于WT 小鼠能够很好地模拟HSA 在人体中的代谢情况。 Tg32 小鼠高FcRn 亲和力白蛋白变体（K573P）的血浆半衰期与WT 小鼠相比，从30.6 h 延长到了95.2 h［43］；具有3 种氨基酸取代的白蛋白突变体QMP（E505Q/T527 M/K573P）Tg32 小鼠中的血浆半衰期（4.8 d）比WT HSA 在该小鼠模型中（2 d）的两倍还多［12］。 在hFcRn＋/＋Tg276 小鼠中，也观察到了相似的结果。 Schmidt等［42］采用另外两种对FcRn 具有高亲和力的白蛋白突变体：HSA5（V547A）和HSA7（V547A/E505 G）于Tg276 小鼠中检测相应的血浆半衰期，发现这两种HSA 突变体的半衰期分别为46.2 h 和44.9 h，相较于WT HSA 的半衰期（29.2 ～31.4 h）均延长了1.5倍左右。 以上结果表明hFcRn＋/＋小鼠能更好地模拟对hFcRn 具有较高亲和力的HSA 变体在人体内的代谢情况。 除此之外，hFcRn＋/＋小鼠对比于WT小鼠也能够更好地模拟重组白蛋白物在人体内的药代动力。 例如，Lombardi 等［45］利用QMP 与凝血因子Ⅶ结合，并在Tg32 小鼠中检测，发现对比于与HSA 结合的凝血因子Ⅶ（2 d），其显著延长了血浆半衰期（7 d）。

尽管hFcRn＋/＋小鼠增强了其对HSA 的结合能力，能够更好地模拟包括HSA 变体及重组白蛋白药物在人体内的代谢，但是已有研究表明MSA 对hFcRn 的结合力是HSA 的5 倍［25，37，43］。 因此，hFcRn＋/＋小鼠中内源性MSA 会与HSA 竞争性地结合hFcRn，从而影响白蛋白药物药代动力学评估［17］。

1.2.2hFcRn、mAlb双基因修饰（hFcRn＋/＋，mAlb-/-）小鼠

为了克服内源性MSA 与HSA 竞争性的结合hFcRn 对白蛋白药物药代动力学评价带来的负面影响，Roopenian 等［44］通过TALEN 技术在FcRn人源化（Tg32）小鼠的基础上进一步构建缺乏自身白蛋白表达的品系（Tg32-Alb-/-），即在Tg32 小鼠的基础上敲除小鼠内源性MSA基因4 号外显子2bp，使其过早形成终止密码子来实现自身白蛋白表达的缺陷，该小鼠模型排除了内源性MSA 的影响，更加适合用于评估HSA 药代动力学。 借助该小鼠模型发现HSA 的血浆半衰期为24 d，与在人体中的半衰期（19 d）相当。 因此，认为这种hFcRn＋/＋、mAlb-/-（Tg32-Alb-/-）小鼠模型是一种能够很好地模拟人体评估白蛋白药物药代动力学的啮齿类动物模型，这也说明了hFcRn 的存在和缺乏竞争的内源性MSA 竞争可有效地保护WT HSA，防止被降解。

虽然hFcRn＋/＋、mAlb-/-小鼠模型能够使HSA的血浆半衰期延长至与在人体中相当，且在白蛋白药物评估中发挥着巨大作用，但是给白蛋白药物后，外源性白蛋白与内源性HSA 会竞争性结合FcRn 受体，而hFcRn＋/＋、mAlb-/-小鼠不能正常模拟内源性竞争，致使该类模型用于白蛋白药物评价受到质疑。

1.2.3hFcRn、hAlb双基因修饰（hFcRn＋/＋，hAlb＋/＋）小鼠

虽然hFcRn＋/＋小鼠模型及hFcRn＋/＋、mAlb-/-小鼠可以模拟hFcRn 对HSA 的结合能力，但是hFcRn＋/＋小鼠MSA 对hFcRn 的亲和力远高于HSA对hFcRn 的亲和力［25］，使内源性MSA 比HSA 更易结合hFcRn 受体［17］，hFcRn＋/＋、mAlb-/-小鼠缺乏内源性白蛋白与外源性白蛋白竞争性结合hFcRn 受体。 为了更加真实地模拟人体内白蛋白药物及HSA 与hFcRn 受体的竞争结合，Viuff 等［25］于2016年建立了第一个由内源性启动子控制并且同时携带hFcRn和HSA基因（hFcRn＋/＋，hAlb＋/＋）的双转基因小鼠模型，通过将hFcRncDNA 定点插入到鼠mFcRn基因的2 号外显子处，同时将编码HSA的cDNA 序列定点插入小鼠MSA基因1 号外显子处，因此，hFcRn和HSA的表达都受到小鼠对应基因内源性启动子的控制。 该小鼠模型的血清HSA 浓度为17 mg/mL，而另外30 种血清成分的水平与野生型小鼠相当，体外实验发现来源于该基因修饰小鼠的血清白蛋白（501.9 ± 101.2 nmol/L）、来源于人的血清白蛋白（641.1 ± 89.7 nmol/L）和天然序列的重组人血清白蛋白（797.9 ± 155.0 nmol/L）对hFcRn 有着相似的结合能力。 进一步采用hFcRn＋/＋，hAlb＋/＋小鼠进行体内实验，发现与FcRn具有低结合能力的低结合蛋白（low binding protein，LB）血清半衰期为29 ± 3 h，高结合蛋白（high binding protein ，HB）的半衰期为80 ± 18 h，重组白蛋白半衰期为57 ± 13 h［45］，当中LB 的血浆半衰期最短，HB 的血浆半衰期最长。

该模型同时克服了FcRn 和白蛋白结合存在物种差异及外源性与内源性白蛋白与FcRn 结合存在竞争这两个难题，能更好地模拟人类生理条件，是白蛋白关联药物的药代动力学研究中较好的模型。

2 白蛋白相关药物非啮齿类动物模型

啮齿类动物虽然在药物药代动力学临床前研究中发挥着巨大作用，为白蛋白药物临床前研究提供了良好模型，但是啮齿类动物在生理特征上与人类之间差异较大，与之相对应的非啮齿类动物具有与人类更加接近的生理特征，可以更好地反映药物在体内的药代动力学特征。 目前，用于研究白蛋白相关药物的非啮齿类动物主要为食蟹猴、犬儒猴、猕猴等非人灵长类动物（nonhuman primates，NHPs）。

NHPs（食蟹猴、犬儒猴、猕猴等）在生理、病理等多方面与人类高度相似，其遗传物质最高可以与人类达到98.5%的同源性［46-47］，因此，NHPs 能够更好地模拟人类体内代谢条件，有望促进各种HSA 药物药代动力学研究进展。

在食蟹猴中，HSA 的半衰期为131 ～169 h ，而食蟹猴白蛋白在食蟹猴中的血浆半衰期为144 h［2，42-43］，说明HSA 在食蟹猴体内有着与食蟹猴白蛋白相似的竞争力。 例如，Steiner 等［30］将DARPins结构域与白蛋白结合，使其在食蟹猴中的血浆半衰期相较于在WT 小鼠中（3.42 d）延长至20.7 d，这与类比到人体中的50.3 d 更加接近，另一项报道中通过将凝血因子Ⅷ（FⅧ）与人白蛋白融合后静脉注射到犬儒猴中，发现重组FⅧ的半衰期达到56.1 ～66.1 h，比未重组的FⅧ增加2.6 ～5.0 倍［48］。

虽然NHPs 对比于非啮齿类动物与人之间有着更加接近的亲缘关系，体型更大更便于监测，但是有研究表明，食蟹猴血清白蛋白对猴FcRn 的亲和力高于人血清白蛋白对猴FcRn 的亲和力［25］，这在一定程度上阻碍了猴FcRn 与HSA 的结合，同时由于伦理和经济的限制，猴子在非临床试验的广泛应用受到一定限制。

3 总结与展望

白蛋白作为药物载体的主要优势是通过与FcRn 受体的相互作用来延长药物的血浆半衰期。动物模型作为研究药物药代动力学的重要工具是药物研究中不可或缺的一部分，目前用于评估白蛋白相关药物药代动力学的动物模型包括啮齿类（野生型小鼠、基因修饰小鼠模型）与非啮齿（猴）两大类。 由于白蛋白与FcRn 的结合存在物种差异，导致无论是使用野生型小鼠还是hFcRn＋/＋小鼠得到的药代动力学数据都不能很好地模拟白蛋白相关药物在人体内的药代动力学。 因为内源性的小鼠白蛋白也会竞争性地与FcRn 受体结合，为了更加真实地模拟人体内白蛋白药物及HSA 与hFcRn 受体的竞争结合，制备FcRn和白蛋白双人源化的动物模型至关重要，因此，Howard 团队建立了FcRn 和白蛋白双人源化的小鼠模型，为白蛋白相关药物研究提供了较好的小鼠模型［25］。

但小鼠与人类在生长发育、生理代谢、体型大小等方面都相差较大，获得的实验数据不能真实反映蛋白药物在人体内的代谢过程。 我国的《化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则》要求：新药临床前药代动力学研究应选用至少两种动物，包括啮齿类和非啮齿类。 然而，迄今为止，基于白蛋白和FcRn双人源化的非啮齿类动物模型尚未建立，严重阻碍了白蛋白药物研究。 双人源化小鼠模型为白蛋白评估模型提供了新的思路，该模型在一定程度上模拟了HSA 与FcRn 在人体内的相互作用及白蛋白相关药物进入人体后与源性HSA 竞争性结合FcRn 受体的生理状态。 NHPs 与人有着极高的相似性，包括生理代谢水平等，在未来是否可以在伦理道德允许的范围构建HSA与FcRn双人源化的NHPs 模型，理论上这种双人源化NHPs 模型可以作为最理想的评价白蛋相关药物药代动力学的动物模型。

总之，对于药物临床前研究，动物模型发挥着巨大作用，建立能够更好地模拟人类生理学特征的动物模型是任重道远的。 随着各种实用技术的发展与检测水平的提高，评价白蛋白相关药物动物模型将会更加完善，也能更真实地模拟临床特征，推进白蛋白药物更进一步的研究与发展。