脾虚湿蕴证溃疡性结肠炎模型构建及T 淋巴细胞变化的研究

肖秋萍钟友宝喻松仁李姗姗罗小泉刘漩陈丽玲*

（1. 江西中医药大学药学院，南昌 330004；2. 江西中医药大学实验动物科技中心，南昌 330004；3. 江西中医药大学方证中心，南昌 330004）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）属于慢性非特异性肠道炎症［1］，临床上多表现为消化不良、腹泻、脓血便、腹痛、里急后重等症状，使患者生活质量明显下降［2］。 近年来，随着工业化进程加快、饮食结构西化、生活方式转变，我国UC 的发病率和患病率逐年攀升［3］。 反复发作、迁延不愈等典型特征是当前治疗UC 的主要困境之一［4］。 因此，寻找更安全、有效、易获取的UC 治疗策略迫在眉睫。 中医学将UC 列为“痢疾”“泄下”“肠辟”等范畴，中医药在治疗UC 上展现了良好疗效，然而其模糊的作用机制制约发展。

中华中医药学会脾胃病分会制定了《UC 中医诊疗共识意见》，将UC 辨证分为脾虚湿蕴证、大肠湿热证、热毒炽盛证、脾肾阳虚证、寒热错杂证、阴血亏虚证和肝郁脾虚证7 型［5］；据流行病学调查，脾虚湿蕴证是UC 临床发病的主要证型之一［6-8］。脾虚湿蕴证动物模型常采用大黄、芒硝和番泻叶诱导，具腹泻症状，但结肠病理变化不明显；葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium salt，DSS）自由饮水法常用于诱导小鼠UC［9］，容易复制且稳定性好，但此法仅部分结肠炎小鼠表现为脾虚湿蕴证。 因此，既贴合临床症状又符合病理变化的脾虚湿蕴证型UC 动物模型仍待开发，此模型的成功建立将有利于阐明中医药治疗UC 的有效性，助力中医药现代化和国际化发展。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

60 只7 周龄SPF 级雄性C57BL/6 小鼠，体重20 ～24 g，购买于南京集萃药康生物科技股份有限公司【SCXK（苏）2018-0008】。 小鼠自由饮水和采食标准全价饲料，昼夜各半，温度22 ～24℃，湿度50% ～60%，饲养于江西中医药大学实验动物科技中心SPF 屏障环境内【SCXK（赣）2022-0002】。 本研究方案得到江西中医药大学动物伦理委员会的批准（JZLLSC2020-344），整个实验操作过程遵守实验动物标准操作规范。

1.1.2 主要试剂与仪器

番泻叶（江苏永健医药，300174-170226）；DSS（美国MP Biomedicals，16011）；4%多聚甲醛、苏木素-伊红染色液、BCA 蛋白检测试剂盒、RMPI1640培养基（北京索莱宝）；小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、TGF-β1 酶联免疫吸附试验试剂盒（美国Thermo）；流式细胞PerCP-Anti-Mouse CD3、BV510-Anti-Mouse CD4、 PE-Anti-Mouse CD4、 FITC-Anti-Mouse CD8、AF488-Anti-Mouse CXCR3、BV421-Anti-Mouse CCR4、BV510-Anti-Mouse CCR6、AF647-Anti-Mouse CD25、PE-Cy7-Anti-Mouse Foxp3 抗体（美国BD Biosciences）。

全自动包埋机（Leica，型号：HistoCore_Arcadia，德国）；石蜡切片机（Leica，型号：Leica2245，德国）；徕卡多人共览显微镜（Leica，型号：DM2500，德国）；全波长酶标仪（Thermo，型号：Multiskan Spectrum，美国）；MinQ 超纯水仪（密理博，型号：Milli-Q Advantage A10，美国）；流式细胞仪（BD，型号：FACS Verse，美国）。

1.2 方法

1.2.1 造模试剂制备

100 g 番泻叶，置于500 mL 的水浸泡30 min，加热至沸腾后持续10 min，四层纱布过滤收集药液［10］。 将药液浓缩至生药含量为0.2 g/mL，置于4℃冰箱中保存。 DSS 溶液直接溶于正常饮用水中，每天现配现用。

1.2.2 动物分组与模型建立

将60 只小鼠随机分成Control 组、FXY 组、3%DSS 组、FXY ＋3%DSS 组和FXY ＋2%DSS 组，每组12 只，适应性饲养3 d 后开始持续21 d 的实验。5 组的小鼠处置方法如图1 所示。

图1 小鼠分组及模型建立方法Figure 1 Methods of grouping and model establishment of mice

1.2.3 脾虚湿蕴证辨证分型标准

小鼠脾虚湿蕴模型体征诊断标准［11］：（1）黏液脓血，白多赤少；粪便时软、时溏。 （2）便溏泄泻，夹有不消化食物。 （3）食少纳呆，消瘦，体重减轻。（4）神态萎靡，四肤不收，毛色枯槁。 （5）脘腹胀满，腹部隐痛，卷缩聚堆。 （6）易疲劳。 第（1）（2）项为主证，第（3） ～（6）项为兼证。 具备2 项主证和2项兼证时，即认为造模成功。

1.2.4 疾病活动指数测定

实验过程中，每天同一时间对小鼠称重，并观察粪便粘稠度、便血情况，进行DAI（disease activity index）评价观察，DAI ＝体重损失评分＋粪便粘稠度评分＋便血情况评分，标准执行：体重损失依据无明显下降、下降1% ～5%、下降6% ～10%、下降11% ～20%、下降超过20%依次评判为0 ～4 分；粪便粘稠度：正常粪便为0 分、松软便（干性）为2 分、稀便或腹泻（水样便）为4 分；便血情况：无出血为0分、大便潜血阳性为2 分、粪便带血为3 分、肛门出血为4 分。

1.2.5 结肠及脾指数测定

第21 天小鼠2%戊巴比妥钠深度麻醉安乐死，分离结肠、脾，测量结肠长度；脾、结肠称重并计算其重量指数（脾重量指数＝脾重量/小鼠体重× 100%，结肠重量指数＝结肠重量/小鼠体重× 100%）。

1.2.6 结肠组织损伤评分

近端结肠组织经4%多聚甲醛溶液固定、冲洗、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，制成4 μm厚切片，常规苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，病理学家基于炎性细胞浸润和溃疡形成［12］，随机盲法对结肠病理图片进行病理损伤评分。

1.2.7 炎性细胞因子水平检测

结肠组织经裂解、匀浆、离心后取上清液，BCA法检测上清总蛋白浓度，根据ELISA 检测试剂盒说明书，测定结肠组织中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 和TGF-β1 浓度。

1.2.8 流式细胞术检测T 细胞水平

收集小鼠肠系膜淋巴结，经碾磨、过滤、洗涤后制备为单细胞悬液；CD16/CD32 抗体封闭15 min；流式抗体（CD3、CD4、CD8、CXCR3、CCR4、CCR6），室温避光孵育30 min；stain buffer 洗涤2 次，Fix/Perm 溶液孵育30 min 固定；stain buffer 重悬，Perm/Wash 溶液孵育15 min 破核；流式抗体Foxp3 室温孵育30 min 胞内染色；Perm/Wash 溶液重悬，stain buffer 洗涤2 次；stain buffer 定容500 μL，流式上机检测；Flowjo 7.6.1 软件分析流式结果。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析，计量资料以平均值± 标准差（±s）表示；采用单因素方差分析（One-way ANOVA）组间差异，P＜0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 脾虚湿蕴证型结肠炎小鼠体重及DAI 的变化

整个实验期内Control 组小鼠被毛光泽、饮水、采食及精神状态良好，FXY 组小鼠被毛粗糙、腹泻严重。 3%DSS 组结肠炎小鼠精神沉郁、蜷缩、采食下降、消瘦，50%小鼠伴有肛血且OB 检测阳性。FXY ＋3%DSS 组和FXY ＋2%DSS 组小鼠精神很差、水样腹泻、便血且OB 检测呈强阳性。 与Control组（图2A）相比，FXY 组、3%DSS 组、FXY ＋3%DSS组和FXY ＋2%DSS 组小鼠体重从在实验中均有显著下降（P＜0.001）。 与Control 组小鼠DAI（图2B）相比，FXY 组从实验第3 天开始显著上升，3%DSS 组、FXY ＋3%DSS 组和FXY ＋2%DSS 组从实验第2 天开始显著上升（P＜0.001）。 与FXY 组小鼠DAI 相比，FXY ＋3%DSS 组从第7 天开始显著上升，3%DSS 组和FXY ＋2%DSS 组从实验第8 天开始显著性上升（P＜0.001）。 可见，FXY ＋3%DSS组和FXY ＋2%DSS 组小鼠符合脾虚湿蕴证辨证分型标准。

注：Control 组（n ＝12）、FXY 组（n ＝11）、3%DSS 组（n ＝8）、FXY ＋3%DSS 组（n ＝6）和FXY ＋2%DSS 组（n ＝9）；LSD 法进行组间两两比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001。 （下图同）图2 小鼠体重和DAI 的变化趋势（x¯±s）Note. Control group （n ＝12），FXY group （n ＝11），3%DSS group （n ＝8），FXY ＋3%DSS group （n ＝6） and FXY ＋2%DSS group （n ＝9）. LSD method for comparisons between two groups，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001. （The same in the following figures）Figure 2 Trends in daily body weight and DAI of mice for each group（x¯±s）

2.2 脾虚湿蕴证结肠炎小鼠生存率、结肠和脾指数

如图3A 所示，Control 组、FXY 组、3%DSS 组、FXY ＋2%DSS 组和FXY ＋3%DSS 组小鼠的生存率依次为 100%、 91.67%、 75%、 66.67%、 50%。 与Control 组结肠长度（图3B，3C）相比，FXY 组、3%DSS组、FXY ＋3%DSS 组和FXY ＋2%DSS 组显著下降（P＜0.001）；与FXY 组结肠长度相比，3%DSS 组、FXY＋3%DSS 组和FXY ＋2%DSS 组显著下降（P＜0.01）。 与Control 组结肠重量（图3D）相比，3%DSS组和FXY ＋2%DSS 组显著上升（P＜0.05）；与FXY＋3%DSS 组结肠重量相比，3%DSS 组和FXY ＋2%DSS 组显著上升（P＜0.05）。 FXY、DSS 干预后结肠重量/结肠长度、结肠重量指数、脾重量及其指数亦出现了显著增加（P＜0.05）（见图3E ～3H）。

图3 各组生存率、结肠和脾指数的比较Figure 3 Comparison of survival rates，colon index and spleen index parameters among groups

2.3 脾虚湿蕴证结肠炎小鼠结肠组织病理分析

Control 组结肠组织黏膜完整，隐窝清晰可见，无明显炎性细胞浸润；FXY 组结肠组织黏膜较完整，偶见少量炎性细胞弥散性浸润，未见明显溃疡形成；3%DSS 组、FXY ＋3%DSS 组和FXY ＋2%DSS组结肠组织黏膜上皮脱落，隐窝增生，有明显的溃疡形成，大量的炎性细胞浸润，其病理组织损伤评分均高于Control 组和FXY 组（P＜0.001）（见图4）。

图4 结肠组织形态结构Figure 4 Histomorphological structure of the colon in each group

2.4 脾虚湿蕴证结肠炎小鼠结肠组织炎性细胞因子表达

促炎性细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和抗炎性细胞因子（IL-10、TGF-β1）动态失衡导致的炎性因子风暴是UC 发病的典型特征［13］。 如图5 所示，3%DSS 组、FXY ＋3%DSS 组和FXY ＋2%DSS 组结肠组织中的促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的浓度均显著性高于Control 组和FXY 组，而抗炎性细胞因子IL-10、TGF-β1 显著性下降（P＜0.05）。 此外，Control 组的炎性细胞因子与FXY 组相比，无显著性差异（P≥0.05）。

2.5 脾虚湿蕴证结肠炎小鼠肠系膜淋巴结中的T细胞水平

与Control 组和FXY 组比，3%DSS 组、FXY ＋3%DSS 组和FXY ＋2%DSS 组的CD3＋CD4＋CD8-T细胞百分比（图6A）均显著性上升（P＜0.05）。 3%DSS 组、FXY ＋3%DSS 组和FXY ＋2%DSS 组的T细胞百分比（图6B）均显著性低于Control 组（P＜0.05），而与FXY 组比，无显著性差异（P≥0.05）。

图6 各组肠系膜淋巴结中的T 细胞水平Figure 6 Levels of T cells in mesenteric lymph nodes of various groups

2.6 脾虚湿蕴证结肠炎小鼠肠系膜淋巴结中的Th1/Th2 和Th17/Treg 细胞水平

3%DSS 组、FXY ＋3%DSS 组和FXY ＋2%DSS组的CD45＋CD4＋CXCR3＋Th1 细胞（图7A）百分比均显著高于Control 组和FXY 组（P＜ 0.05）。3%DSS 组、FXY ＋3%DSS 组和FXY ＋2%DSS 组的CD45＋CD4＋CCR4＋Th2 细胞（图7B）百分比均显著低于Control 组（P＜0.05），而与FXY 组相比，无显著性差异（P≥0.05）。 与Control 组相比，FXY 组、3%DSS组、FXY ＋3%DSS 组和FXY ＋2%DSS 组CD45＋CD4＋CCR6＋Th17 细胞百分比均显著性上升（P＜0.05）；此外，FXY ＋3%DSS组和FXY ＋2%DSS 组的Th17 细胞百分比均显著性高于FXY 组（P＜0.05）（见图7C）。 与Control 组相比，FXY 组、3%DSS 组、FXY ＋3%DSS 组和FXY ＋2%DSS 组的CD45＋CD4＋Foxp3＋Treg 细胞百分比均显著性下降（P＜0.05）；此外，FXY ＋ 3%DSS 组和FXY ＋2%DSS组的Treg 细胞百分比亦显著性低于FXY 组（P＜0.05）（见图7D）。

图7 各组肠系膜淋巴结中的Th1/Th2 和Th17/Treg 细胞水平Figure 7 Levels of Th1/Th2 和Th17/Treg cells in mesenteric lymph nodes of various groups

3 讨论

脾胃运化水谷精微，转化精、气、血、津液并维持生命活动。 脾居中央，喜燥恶湿，脾虚则易被湿邪所困［12］。 UC 的病位在大肠，但其病机根本在脾。饮食不节，损伤脾胃，运化失健，湿浊内生，形成脾虚湿蕴证［11］。 脾虚湿蕴证UC 的主要病机为脾虚湿困、湿阻中焦，症见脘腹胀满，食欲不振，神疲乏力，肢体困重，大便溏薄或泄泻，脉缓等［5］。

UC 已被世界卫生组织列入十大难治性疾病［14-15］，主要累及结直肠，表现为浅表性、弥漫性结肠炎症，光学显微镜下可观察到结肠组织明显的溃疡及炎性细胞浸润［2，16］。 本研究发现，单用番泻叶或DSS 不足以诱导典型的脾虚湿蕴证UC，番泻叶诱导的小鼠多表现为体重下降、腹泻；3%DSS 诱导的小鼠多表现为便血、消瘦；而采用番泻叶联合DSS诱导的小鼠多表现出黏液脓血、便溏泄泻、消化不良、体重减轻、精神萎靡、卷缩聚堆等症状，呈典型的脾虚湿蕴证UC。

尽管番泄叶可诱导小鼠结肠重量指数显著性增大，但结肠组织的溃疡形成和炎性细胞浸润并不明显，且炎性细胞因子没有显著性差异。 然而，番泻叶联合DSS 诱导的脾虚湿蕴证UC 小鼠不仅出现结肠缩短并增重，结肠组织还存在明显的溃疡及大量炎性细胞浸润，促炎性细胞因子浓度显著上升，而抗炎性细胞因子显著下降。 值得一提的是，这些指标变化在FXY ＋3%DSS 组与FXY ＋2%DSS 组之间无显著性差异，但FXY ＋3%DSS 组小鼠生存率更低（66.67% VS 50%）。 综合考虑模型的临床吻合度及动物损耗，认为番泻叶联合2%DSS 诱导脾虚湿蕴证UC 效果更佳。

众所周知，UC 的发病机制涉及遗传易感性、肠道菌群失调及免疫反应异常等［17］。 近年来，T 淋巴细胞亚群分化异常在UC 的发病机制中备受关注［18］。 UC 患者的外周血液中CD3、CD4、CD8 T 淋巴细胞显著高于健康个体，而活动期UC 患者结肠固有层组织亦存在此种变化［19-21］。 在DSS 和三硝基苯磺酸诱导的实验性结肠炎模型中，脾和肠系膜淋巴结中的CD4、CD8 的数量明显增多，结肠固有层CD4＋T 细胞高表达IFN-γ、IL-17A［22］。 本研究首次发现脾虚湿蕴证结肠炎小鼠肠系膜淋巴结中的CD3＋CD4＋CD8-T 淋巴细胞明显增多，而CD3＋CD4-CD8＋T 细胞明显减少。

UC 过度的炎症反应是由多种类型的免疫细胞所介导的，包括CD4＋T 细胞，在UC 的发生、维持、缓解中扮演关键性角色［23］；而效应性T 细胞亚群（Th1、Th2 和Th17 细胞）和调节亚群（Treg 细胞）通过调节肠道的免疫平衡而影响UC 的进程［24］。 肠道巨噬细胞分泌的IL-12 和IL-18 刺激Th1 细胞表达T-bet 转录因子，并诱导分泌IL-2 和IFN-γ［25］。Th2 细胞表达GATA3 并分泌IL-4、IL-5 和IL-13，其中IL-4 有助于维持免疫耐受，而IL-13 参与肠道炎症反应［26］。 Th17 细胞的发育和分化需要两个关键的转录因子，即维甲酸相关孤儿受体（ROR）γt 和RORα，并分泌IL-17、IL-21 和IL-22［27］。 另外，Treg细胞主要表达转录调节因子Foxp3，同时分泌IL-10和TGF-β1 抑制宿主的免疫反应，从而诱导自我耐受，而Treg 细胞功能缺陷或遏制能力低下可导致UC 更易复发［28］。 活动期UC 患者外周血中Th1、Th17 细胞的百分比显著增多，而Th2、Treg 细胞明显减少，DSS 诱导的结肠炎小鼠结肠组织中Th1/Th2 细胞和Th17/Treg 细胞明显失衡［29］，本研究中DSS 诱导的结肠炎小鼠肠系膜淋巴结中亦表现出了此失衡状态。 另外，研究发现脾虚湿蕴证结肠炎小鼠肠系膜淋巴结中CD45＋CD4＋CXCR3＋Th1、CD45＋CD4＋CCR6＋Th17 细胞显著增多，而CD45＋CD4＋CCR4＋Th2、CD45＋CD4＋Foxp3＋Treg 细胞显著减少，Th1/Th2 细胞和Th17/Treg 细胞失衡程度也严重于单纯DSS 诱导的结肠炎。

综上，番泻叶联合2%DSS 能成功建立脾虚湿蕴证溃疡性结肠炎小鼠模型，且表现出典型的T 细胞失衡特征。 后期，将应用此模型探讨中医药治疗脾虚湿蕴证UC 的疗效及机制，同时验证此模型的稳定性和有效性。