不同干预因素建立小鼠动脉粥样硬化模型的研究进展

2023-12-04白旭峰王姝雯曹清雨刘亚丽胡慧明

中国实验动物学报 2023年10期

白旭峰王姝雯曹清雨刘亚丽胡慧明

（1. 江西中医药大学，南昌 330004；2. 南昌医学院，南昌 330052；3. 江西省中医药管理局抗炎类中药药效与质量评价重点研究室，南昌 330052；4. 江西省卫生健康药效与安全性评价重点实验室，南昌 330052）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是心脑血管疾病的潜在危险因素，是全球死亡和发病的主要原因［1］。 AS 被认为是由多种因素引起的，包括遗传和环境因素，其特征是动脉腔硬化和狭窄，因在动脉内壁上形成了称为斑块的脂肪沉积物［2］。人类AS的起始机制虽未被完全阐明，但从AS 病变标本和动物模型角度来看，AS 已被定义为一种慢性炎症性疾病，涉及内皮细胞功能障碍、脂质浸润、巨噬细胞募集和血管平滑肌细胞迁移［3］。

研究表明，高水平的血浆低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL-C）是AS 最主要的危险因素之一［4］。 LDL-C 倾向于积聚在动脉壁的内皮下空间，通过逐步氧化过程，产生最小修饰的低密度脂蛋白（minimally modified low density lipoprotein，mm-LDL），其中只有脂质成分被氧化，然后是完全氧化的低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）［5］。 ox-LDL 通过氧化低密度脂蛋白受体-1（oxidized low-density lipoprotein receptor-1，LOX-1）

作用于内皮细胞，从而诱发内皮功能障碍，细胞表面粘附分子过表达，包括血管细胞粘附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）、细胞内粘附分子 1 （ intracellular adhesion molecule 1，ICAM-1）和内皮白细胞粘附分子（endothelial leukocyte adhesion molecule，E-selectin），最终诱导动脉壁的炎症反应［6］。炎症反应促使循环单核细胞附着在受损的内皮上，将单核细胞迁移到脉管系统内皮下基质下方的内膜层，浸润的单核细胞进一步分化为巨噬细胞，巨噬细胞通过清道夫受体识别和摄取ox-LDL 形成泡沫细胞，这种泡沫细胞内皮下的积聚也被称为“脂肪条纹形成”，这就是AS 形成的早期阶段［7-8］。炎症反应还能促进循环单核细胞和T 细胞的募集，刺激血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）从血管壁内侧层迁移到内膜层，表现出异常高的增殖并分泌细胞外基质蛋白，在AS 晚期形成纤维帽以稳定脆弱的斑块［9-10］。在AS 晚期，随着斑块的进化，泡沫细胞和VSMC 发生死亡，细胞外脂质从垂死或死细胞的碎片中积聚并积累脂蛋白，在许多斑块中形成脂质核心。纤维帽通常在脂质核心上方形成，由于合成减少和细胞外基质大分子（如胶原蛋白）的分解增加，使得这种纤维帽变薄，形成薄帽AS［11］。这种高风险脆弱斑块的纤维帽一旦破裂，叠加的血栓形成可能会阻塞动脉腔并破坏血流，最终导致心肌梗死、中风或猝死，这也是AS 发病率和死亡率最高的原因之一［12］。

AS 动物模型是提高对AS 斑块形成与斑块破裂及其相关心血管事件发生认识的重要工具。因此，选择合适的AS 动物模型至关重要。理想的AS动物模型应尽可能与人类临床发病机理相似，并可用于医学与药物研究，且成本合理、重复性高。小鼠是AS 研究中使用最广泛的动物模型，具有繁殖性强、遗传性高、转基因的可塑性好、以及AS 病变部位形成快等优势［13］。本文简要介绍饮食、转基因、新技术、遗传和环境等不同干预因素对小鼠AS模型的研究进展并进行比较分析，以期为AS 的基础研究提供新的参考和思路。

1 饮食与小鼠AS 模型

AS 是一种慢性的炎症过程，饮食对高脂血症促进AS 斑块形成的影响颇大［14］。长期高胆固醇饮食会引起小鼠血清胆固醇（total cholesterol，TC）水平升高，其与主动脉病变的不断加剧呈正相关［15］。自20 世纪90 年代以来，21%脂肪结合0.15%胆固醇的西方饮食是AS 动物模型常用的饲料配方［16］。

早在20 世纪60 年代末，学者们就开始探究小鼠AS 模型建立的方法。 Vesselinovitch 等［17］通过高脂饮食、辐射诱导CF1 小鼠AS 病变。但是，在高脂饮食和辐射及环境因素的共同作用下，使得这项研究个体差异极大，甚至伴随着较高死亡率。随后，Thompson［18］率先采用高胆固醇高脂肪（high-fat/high-cholesterol，HFHC）的饲料喂养近交系小鼠（C57BL/6）诱导AS，25 周后，小鼠的存活率高达100%，并且发现AS 模型小鼠泡沫细胞普遍出现在主动脉瓣区域。从此，近交系小鼠逐渐成为AS 模型的研究基础［19］。 1985 年，Paigen 等［20］以（15%脂肪＋1.25%胆固醇＋0.5%胆酸）饮食诱导10 种近交系C57BL/6，结果发现小鼠14 周后就形成高胆固醇血症，且主动脉瓣大量细胞内脂肪沉积，并含有大量泡沫细胞，同时病变已开始侵入下层介质形成脂肪条纹。以半合成高脂肪饮食诱导9 种近交系小鼠18 周，同样发现C57BL/6 是最容易发生AS 病变的小鼠［21］。可见，C57BL/6 小鼠是AS 模型基础研究的常用研究对象。

2 基因敲除小鼠AS 模型

2.1 经典ApoE-/-、LDLR-/-AS 模型

载脂蛋白E（ApoE）是一种双域抗AS 脂质转运蛋白，作为低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）受体的配体，可以介导含载脂蛋白 B（apolipoprotein B，ApoB）的致AS 脂蛋白的清除，包括极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）、中密度脂蛋白（ intermediate-density lipoprotein，IDL）的受体，从而降低血浆脂质水平［22-23］。 Plump 等［24］基于C57BJ/6 菌株制备了ApoE-/-小鼠模型。该模型身体健康，在外形上与C57BJ/6 小鼠并无差异。采用普通饮食分别喂养ApoE-/-和C57BJ/6 小鼠16 周后，ApoE-/-小鼠的LDL、TC 水平较C57BJ/6 小鼠升高数倍，同时ApoE-/-小鼠主动脉血管伴随脂质沉积［25］。这表明在没有环境刺激的情况下，ApoE 的缺乏能引起脂蛋白代谢的巨大变化。研究发现，ApoE-/-小鼠在正常饮食下，10 周后出现了动脉僵硬，15 周后TC 水平提高了50%，20 周后斑块出现在胸主动脉及其主要的分叉节点处；而在西方饮食下则会加快ApoE-/-小鼠AS 病变的进程，如大量胶原沉积、主动脉僵硬程度成倍增加、钙化严重，40 周后主动脉完全受损［26-27］。

低密度脂蛋白受体敲除（LDLR-/-）小鼠是另一种常用的AS 研究的动物模型。 LDLR 是一种膜受体，可介导含有载脂蛋白ApoB100 或ApoE 的血浆脂蛋白的肝清除率，从而维持血浆LDL 的水平［28］。1994 年，Ishibashi 等［29］率先建立了LDLR-/-小鼠模型，与ApoE-/-小鼠不同，LDLR-/-小鼠不会在普通饮食的基础上发生AS 病变，但TC 水平通常保持在250 mg/dl 左右［30-31］。而采用西方饮食（21%的脂肪、0.15%的胆固醇）喂养LDLR-/-小鼠12 周后，小鼠血浆TC、甘油三脂（triglyceride，TG）、LDL-C 的水平远远高于普通饮食喂养的LDLR-/-小鼠，并且其主动脉根部有大量脂质沉积［32］。

2.2 复杂ApoE-/-、LDLR-/-AS 病变模型

研究表明，采用高脂饲料喂养ApoE-/-与LDLR-/-双敲除小鼠（dKO），结果发现小鼠溶栓活性因素减少，增加了AS 的进展；采用普通饲料喂养ApoE-/-与LDLR-/-受体双敲除小鼠，其AS 的形成或病变比单敲除ApoE-/-小鼠更明显，说明ApoE-/-与LDLR-/-受体双敲除小鼠比ApoE-/-单敲除小鼠更易形成AS［33-34］。亦有学者研究发现，IL-19/LDLR dKO 小鼠和LDLR-/-小鼠高脂饲料共同喂养14 周后，IL-19/LDLR dKO 小鼠巨噬细胞和VSMC 的炎症因子表达增加，油红O 染色发现IL-19/LDLR dKO小鼠主动脉根部病变的面积是LDLR-/-小鼠的2倍，这表明在LDLR-/-的基础上缺乏IL-19 更易形成或加重AS 的病变［35］。 ApoE-/-小鼠与含有原纤维蛋白-（Fbn1）基因的突变（C1039G ＋/-）的小鼠杂交，成为ApoEFbn1-/-C1039G＋/-小鼠，其中原纤维蛋白-1 的Fbn1 基因突变导致马凡综合征（MFS），突变的FBN1 蛋白可能导致弹性结构不稳定，从而扰乱TGF-β 信号通路，导致主动脉表型受累更严重，主动脉根部直径更大，扩张速度更快，死亡和夹层风险往往增加［36-39］，同时加剧了ApoE-/-小鼠AS 高度不稳定斑块表型形成。在西方饮食的影响下，ApoEFbn1-/-C1039G＋/-小鼠核心扩大，纤维帽薄，胶原纤维大量损失，在头臂动脉、升主动脉均发生了斑块破裂，表现出临床终末期AS 患者的许多特征。随着西方饮食的饲养周期延长，ApoEFbn1-/-C1039G＋/-小鼠不可避免地出现了1/5 的死亡［39］。 Wang等［40］研究发现，将Fbn1-/-C1039G＋/-小鼠与LDLR-/-小鼠杂交以获得AS 易感斑块的新模型，相较于ApoEFbn1-/-C1039G＋/-小鼠在整个高脂肪饮食喂养期间，所有小鼠都处于良好状态，并且没有记录到神经系统并发症或急性心血管事件，避免了在ApoE-/-小鼠中观察到的高死亡率问题。但是LDLRFbn1-/-C1039G＋/-实验研究仅使用少量小鼠用于斑块染色实验，缺乏有力的证据。

2.3 SR-BI-/-AS 模型

清道夫受体B 类Ⅰ型（SR-BI/SCARB1）最初被发现是一种清除蛋白，可与一系列天然和修饰的脂蛋白结合，同时SR-BⅠ是一种高亲和力高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）生理膜蛋白受体，其通过肝细胞介导 HDL 颗粒中胆固醇酯（cholesteryl ester，CEs）的选择性摄取［41］。 SR-BⅠ是促进细胞和 HDL 之间游离胆固醇（free cholesterol，FC）的双向通量［42］。除肝外，SR-BⅠ在巨噬细胞和内皮细胞中大量表达［43］。研究表明，SR-BⅠ和ATP 结合盒转运蛋白A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）负责胆固醇从单核细胞衍生巨噬细胞向HDL 外排［44］。采用高胆固醇饲料喂养SR-BⅠ敲除（SR-BⅠ-/-）小鼠，结果发现小鼠血浆VLDL 大小范围内富含FC 和ApoE 的HDL 颗粒显著积累，血浆胆固醇接近1000 mg/dl，促进了AS 的发展［45］。因此，SR-BⅠ-/-高脂血症背景的小鼠能促进AS 的形成，但其更容易导致冠状动脉闭塞、心肌梗死甚至死亡［46］。

2.4 载脂蛋白（Apo）E3-Leiden AS 模型

突变的ApoE 亚型ApoE3-Leiden 与人类显性遗传形式的β-脂蛋白血症有关，过表达ApoE3-Leiden的转基因小鼠极易发生饮食诱导的高脂血症和AS，还能表现出从胸主动脉和腹主动脉的早期脂肪条纹到主动脉弓的晚期病变［47-50］。因此，ApoE3-Leiden 转基因小鼠也可以用作AS 的模型。转基因ApoE3-Leiden.CETP 小鼠是人类脂蛋白代谢的成熟模型，具有人源化的脂蛋白代谢和对AS 病变的异质反应，含ApoB 脂蛋白中的胆固醇更多，HDL 胆固醇水平相对较低，类似于人类，能导致肝对循环中富含甘油三酯的脂蛋白残留物的摄取减少［49］。与ApoE3-Leiden 小鼠相比，高脂饲料喂养19 周后，ApoE3-Leiden.CETP 小鼠体内VLDL 和LDL 水平明显升高，主动脉根部AS 病变面积增加，是评估AS药物治疗的成熟模型［50］。

2.5 一种MicroRNA AS 模型的新探索

MicroRNA（miRs）是一类短的非编码RNA，与RNA 诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）结合，并与靶mRNA 的互补序列（通常在3’UTR 中）结合，通过抑制转录和转录后编码基因的表达来影响许多生物学途径，许多miRNA 已被证明参与生物途径并影响发病机制［51］。 miRNA参与调节脂质代谢、炎症反应、细胞周期、氧化应激、血小板活化、内皮及VSMC 功能，从而影响AS的发生与发展［52］。研究表明，miR-33 在体内的拮抗作用会增加循环HDL 和RCT，从而抑制AS 的发生与发展，并增强其消退［53］。采用高脂饲料喂养C57BL/6 小鼠和miR-33（miR-33-/-）敲除小鼠12周，结果发现miR-33-/-小鼠体内TG 水平和肝中的脂质积累增多，引发了中度肝脂肪变性和高甘油三酯血症［54］。此外，miR-27b、 miR-144 也代表了miRNA 作为胆固醇稳态的关键介质，其可能作为AS 的潜在生物标志物［55］。研究显示高脂肪饮食诱导miR-144 基因敲除小鼠（miR-144-/-）的AS 病变是正常小鼠的1.5 倍［56］。

3 新技术AAV-PCSK9 的AS 模型

作为脂蛋白代谢的关键调节因子，蛋白转化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin kexin 9，PCSK9）可以增强肝LDL 受体的降解，从而导致LDL 水平升高［57］。腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）载体可以有效地、特异性地将转基因递送到肝，且能够持续表达［58］。 AAV-PCSK9 小鼠是10 年前开发的一种无种系基因工程的致AS 小鼠模型新品系［59］，高脂喂养同时注射AAV-PCSK9 的C57BL/6N 小鼠3 个月，显示TC 浓度升高至1000 mg/dl 以上，远远高于普通饮食组小鼠TC 浓度，油红O 染色结果显示接受AAV-PCSK9 注射的小鼠主动脉根部斑块和脂肪明显增加；同时确定，在西方饮食的基础上注射AAV-PCSK9 病毒载量为1.0 ×1011VG 是诱发AS 病变的最佳剂量［60］。与ApoE-/-或LDLR-/-小鼠的常规杂交相比，单次AAV 注射足以在更快的时间内产生新的AS 小鼠模型。

4 遗传和环境因素

4.1 母体遗传导致后代AS 病变发展

长期以来，人们一直认为胎儿发育期间的致病事件会影响AS 相关的疾病［61］。研究发现，不论在人类还是动物体内，AS 病变在胎儿期间开始形成，并且这一病变过程因母亲高胆固醇血症而加速［62］。通过以C57BL/6J 雌性小鼠为研究对象，在其整个交配、妊娠期与哺乳期之间，补充外源性胆固醇，观察其雄性后代，结果发现雄性后代血清VLDL 颗粒数量与大小均增加，肝脂谱的早期变化（单不饱和脂肪酸浓度较低，多不饱和脂肪酸浓度较高），并持续到成年期［63］。研究人员给8 周龄ApoE-/-雌鼠在妊娠与哺乳期间喂养高脂饲料，6 个月后其生产的雄性后代中，整个主动脉AS 病变是普通饲料喂养的雌鼠组的2 ～3 倍［64］。

4.2 慢性应激加速AS 的发展

慢性应激是指当身体长时间受到各种内部和外部的负面因素刺激下发生的非特异性全身反应。长期以来，在慢性应激下暴露的生理反应一直被认为与AS 发生有着密切联系［65］。研究表明，慢性应激能增加血管疾病的发展及冠状动脉疾病的发病率和死亡率，其机制可能是由于慢性应激引起内皮损伤，直接激活巨噬细胞，促进泡沫细胞形成并产生AS 斑块［66］。 Figueiro 等［67］给予LDLR-/-小鼠高脂饮食的同时，每周连续4 d 的逆转明暗、3 d 的常规明暗（rotating shift schedules，RSS）模式，持续11周，结果发现RSS 模式下的小鼠出现较大的AS 病变，同时，原纤维胶原减少，并增加了内质网应激、细胞凋亡和病变内的坏死区域，加速了LDLR-/-小鼠AS 的发展。此外，ApoE-/-在轻度慢性应激暴露12 周后，与未暴露ApoE-/-小鼠相比，暴露的ApoE-/-小鼠的AS 斑块面积增加了一倍［68］。说明慢性应激和高脂饮食复合因素对基因编辑小鼠AS病变发展具有很强的协同作用。

5 结语

综上，实验性AS 小鼠模型复制方法种类较多，且不同干预因素建立小鼠AS 模型各有优劣（表1）。 ApoE-/-小鼠可以自发性的产生AS 病变，是建立AS 的经典模型。 LDLR 受体的缺失更加符合高脂血症诱导的AS，但其需要高脂喂养或物理操作才能较好地实现AS 病变。 ApoE3-Leiden.CETP小鼠克服了经典小鼠模型中非人类脂蛋白代谢的缺陷，但仍需要高脂喂养。 SR-BI-/-、ApoE/LDLR dKO、IL-19/LDLR dKO 小鼠TC 水平升高，加速AS 斑块形成，是实现AS 快速造模的方法，但易造成严重管腔闭塞，导致过早死亡。而ApoEFbn1-/-C1039G＋/-、LDLRFbn1-/-C1039G＋/-小鼠模型能够自发性AS 斑块破裂，给晚期病变和自发性斑块破裂在经典小鼠中的发生提供了可用模型，但复杂病变的证据较少，尚待进一步深入研究。 MicroRNA 敲除小鼠能加快AS 病变的进程，但目前并未见到MicroRNA 在小鼠体内动态影响AS 病变的报道，仍需进一步研究。除基因缺失，以AAV 为载体注射PCSK9，导致体内LDL 积聚，从而建立AS 小鼠模型，该模型操作简便，但可能存在抗病毒宿主免疫反应。从现有的小鼠AS 模型来看，用于评价或筛选防治AS 中药新药研发的模型动物是经典的ApoE-/-小鼠，同时结合高脂饲料长期喂养，则更易形成AS 斑块破裂或心肌梗死。