小鼠血浆中黄卡瓦胡椒素B 的HPLC-MS/MS 定量分析方法建立与药代动力学特征研究

吴启鑫赵小亮焦玥罗明珠王怡婷李晶哲王靖怡马琰岩李涛刘长振*

（1. 中国中医科学院医学实验中心，北京市中医药防治重大疾病基础研究重点实验室，北京 100700；2. 中国中医科学院中药研究所，北京 100700）

卡瓦胡椒（Piper methysticum）是一种原产于南太平洋地区的药食同源植物，属胡椒科，入药部位主要为根及根茎。 在当地，卡瓦胡椒作为一种失眠、焦虑和更年期症状的自然疗法，现临床多用于镇静催眠、抗痉挛、局部麻醉、抗真菌等方面［1-2］。近年，其相关制剂已作为非处方药或食品添加剂进入欧美国家，我国亦有相关报道［2］。 黄卡瓦胡椒素B（Flavokawain B，FKB）是从卡瓦胡椒中分离出来的一种天然甲氧基化查耳酮，具有抗炎［3-4］、抗癌［5-6］、镇痛［7］、抗血管生成［8-9］和免疫调节等多种治疗作用。 FKB 在治疗恶性肿瘤方面表现出色，尤其是胃癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌，其开发前景令人瞩目，引起了全球的广泛关注［5，10-14］。 另外，FKB 有潜在的肝毒性报道［9，15］。 但截至目前，对FKB 的体内过程了解尚不充分，为阐明FKB 的药代动力学特征，本研究利用高效液相色谱-质谱联用（HPLCMS/MS）建立血药浓度定量分析方法，并进一步比较了静脉给药、腹腔注射和灌胃给药后血浆中FKB的药代动力学特征和生物利用度数据，这将为FKB药理机制、安全性研究和进一步开发提供方法和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

168 只SPF 级雄性KM 小鼠，7 ～8 周龄，体重（31.0 ± 1.5）g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司【SCXK（京）2019-0008】。 在昼夜交替照明、恒温（23 ～ 25℃）、恒湿（49% ～ 51%）环境中喂养3 d，适应饲养环境，自由饮食饮水。 实验前禁食12～16 h，自由饮水。 所有动物饲养于中国中医科学院中医基础理论研究所【SYXK（京）2021-0017】，实验均经过中国中医科学院医学实验中心伦理委员会批准（ERCCACMS21-2106-08）。

1.1.2 主要试剂与仪器

木犀草素（批号：RDD-00702005014）、黄卡瓦胡椒素B（批号：RDD-H-02802301004）购于成都瑞芬思德丹生物科技有限公司，纯度均大于98%；二甲基亚砜（Sigma 公司，批号：103209528），羧甲基纤维素钠（国药集团，批号：20120330），Tween80（MCE 公司，批号：HYS000006634），PEG-300（MCE 公司，批号：HYW000084018）；甲醇、乙腈（LC/MS 级，北京迪马公司），甲酸（LC/MS 级，美国Sigma 公司），甲酸铵（LC/MS 级，美国Sigma 公司），其他试剂均为分析纯。

Targin VX-Ⅲ多管涡旋振荡器（北京踏锦科技有限公司）；Milli-Q Integral 5 超纯水制备仪（美国Millipore 公司）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Rotanta 460R 高速冷冻离心机（德国Hettich 公司）。 HPLC-MS/MS 系统（美国AB Sciex 公司），包括ExionLC-20AC 高效液相色谱仪、Ion DriveTMTurbo V 离子源、Sciex6500＋三重四极杆检测器、Analyst 1.7 数据采集系统和MutiQuant 3.0.3 数据处理系统等。

1.2 方法

1.2.1 药品配制

（1）尾静脉注射组和腹腔注射组：称取适量的FKB，加入所需药液体积的4%二甲基亚砜，充分振荡使药物完全溶解，再加入所需药液体积的40%PEG-300 和5% Tween80，最后加入剩余体积的生理盐水，振荡并超声处理60 s，配制成4 mg/mL、8 mg/mL、12 mg/mL 的FKB 溶液。

（2）灌胃组：称取适量的FKB，加入4%二甲基亚砜和5% Tween80，混合后溶于0.5%羧甲基纤维素钠，振荡并超处理声60 s，最终配制成40 mg/mL、80 mg/mL、120 mg/mL 的FKB 溶液。

1.2.2 动物实验

7 周龄雄性KM 小鼠，随机分成7 个组：（1）尾静脉注射组（i．v．20 mg/kg）、（2）低剂量腹腔注射组（i．p．20 mg/kg）、（3）中剂量腹腔注射组（i．p．40 mg/kg）、（4）高剂量腹腔注射组（i．p．60 mg/kg）、（5）低剂量灌胃组（i．g．200 mg/kg）、（6）中剂量灌胃组（i．g．400 mg/kg）、（7）高剂量灌胃组（i．g．600 mg/kg），每个组由24 只小鼠组成11 个取血时间点（每只小鼠3 个取血时间点），每个时间点平行6 只小鼠。 实验于小鼠给药后0、5、30 min 及1、2、4、6、8、12、16、24 h，于眼底静脉丛取血100 μL，迅速装入EDTA·Na2抗凝管中，在4℃4362 r/min 条件下离心15 min，弃沉淀，取上层血浆装于新Ep 管中，-80℃保存备用。

1.2.3 样品溶液配制

（1）对照品溶液配制：精密称取FKB 对照品约10 mg，倒入5 mL 容量瓶中，加入甲醇，超声5 min助溶，将溶液稀释至刻度，摇匀即得。 所配制贮备液浓度为2 mg/mL，逐级稀释后得到1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、61.5、125.0、250.0、500.0、1000.0、2000.0 和4000.0 ng/mL 浓度的对照品系列溶液，置于-80℃保存备用。

（2）内标溶液配制：精密称取木犀草素对照品约10 mg，倒入5 mL 容量瓶中，后加入甲醇，超声5 min 助溶，将溶液稀释至刻度，摇匀即得内标母液，-80℃冰箱中备用。 临用前用甲醇将内标母液稀释成10 μg/mL 的内标溶液。

（3）质量控制（QC）样品的配制：取低、中、高3 个浓度的对照品溶液，加入一定量的空白血浆充分混合，摇匀即得低浓度质控（LQC，0.5 ng/mL）、中浓度质控（MQC，20 ng/mL）和高浓度质控（HQC，600 ng/mL）样品，置于-80℃条件下保存备用。

1.2.4 血浆样品的处理

血浆样品在室温下融化后，充分混匀，精密量取50 μL，置于0.6 mL 干净离心管中，精密加入10 μL 内标溶液和140 μL 乙腈，6000 r/min 涡旋混合5 min，4℃13 795 r/min 离心10 min，取上清液，4℃13 795 r/min 再次离心10 min，取上清待测。

1.2.5 HPLC-MS/MS 条件

（1）色谱条件：色谱柱为XSelect＠HSS T3 色谱柱（2.5 μm，2.1 × 50 mm，美国Waters 公司）；流动相为A（水，含0.1%甲酸） ∶B（乙腈-异丙醇［50 ∶50］），梯度洗脱程序如下：0 ～ 4.0 min，20% ～100% B；4.0 ～6.0 min，100% B ～100% B；6.0 ～6.1 min，100% B ～20% B；6.1 ～8.0 min，20% B～20% B。 柱温为35℃；样品室温度为4℃；流速为0.3 mL/min；进样量为2 μL。

（2）质谱条件：电喷雾离子源（ESI），气帘气（N2）为40 psi，碰撞气（N2）为9 psi，喷雾电压为＋5500 V，雾化温度为550℃，雾化气（GS1，N2）和辅助气（GS2，N2）均为55 psi。 实验采用多反应监测（MRM）模式正离子扫描，FKB 和内标木犀草素离子对及相应的去簇电压、碰撞能量、保留时间等质谱参数见表1。

表1 黄卡瓦胡椒素B 和内标木犀草素优化后的液相色谱质谱参数Table 1 Optimized liquid chromatography-mass spectrometry parameters of Flavokawain B and internal standard luteolin

1.2.6 方法学的建立与验证

（1）选择性：随机取6 只小鼠空白血浆，除不加内标（等体积纯水替代）外，按“1.2.4”项下方法操作，进行HPLC-MS/MS 分析，并记录相应的色谱图。通过色谱图比较定量限（limit of quantification，LOQ）样品、小鼠空白血浆样品和小鼠给药后血浆样品，考察该方法的选择性。

（2）线性范围及定量限：取FKB 对照品系列溶液，分别随机加入小鼠空白血浆，得到0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.1、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0 和800.0 ng/mL 的模拟生物样品，同样按“1.2.4”项下方法操作，进行HPLC-MS/MS 分析。横坐标X 为血浆样品中待测物的浓度，纵坐标Y 为待测物与内标的峰面积比值，1/X 为权重系数，回归分析采用加权最小二乘法，最终得到各成分的标准曲线和线性范围。 各成分的LOQ 经信噪比S/N ＝10 计算，并以LOQ 作为标准曲线的最低浓度点。

（3）基质效应与提取回收率：取QC 和LOQ 样品，每一浓度配制6 份，按“1.2.4”项下方法操作，进样分析得到FKB 与内标的色谱峰面积比值A；取用纯水配制以上等浓度的样品，进样分析得到FKB与内标的色谱峰面积比值B；另随机取空白血浆，按“1.2.4”项下方法操作，上述相应等浓度的对照品和内标溶液分别加入于经提取的上清液中，进样分析后可得FKB 与内标的色谱峰面积比值C。A 与B 的比值即基质效应，A 与C 的比值即提取回收率。

（4）准确度与精密度：LOQ 样品和QC 样品1 d之内测定6 次，且连续3 d 检测，计算日内、日间精密度及准确度。

（5）残留：取定量上限样品，按“1.2.4”项下方法操作，然后进样空白样品；该循环连续操作3 次，之后统一分析各待测物的残留。

（6）稀释可靠性：配制6 份模拟生物样品，约10倍QC 样品浓度（6000 ng/mL），稀释到600 ng/mL（使用空白血浆稀释），如“1.2.4”的步骤操作，进样以分析，并计算稀释后样品的准确度及精密度。

（7）稳定性：配制3 份相同浓度的QC 样本，按“1.2.4”步骤操作，考察室温稳定性是通过室温放置0.5 h 和2 h；考察后期稳定性是通过4℃条件下放置12 h 和24 h；考察冻融稳定性是通过-80℃冻存，室温融化，重复3 次；考察长期稳定性是通过-80℃冻存1 个月。

取QC 样品，每一浓度配制3 份，并按“1.2.4”项下方法操作，在4℃放置12 h 和24 h，考察后期稳定性；在室温下放置0.5 h 和2 h，考察室温稳定性；经历3 次冻融（-80℃冻存，室温融化），考察冻融稳定性；在-80℃条件下冷冻1 个月，考察长期稳定性。

1.3 统计学分析

本实验使用MutiQuant（版本：3. 0. 3，美国AB Sciex 公司）处理数据，Origin Pro 2016（版本：b9. 3.226，美国OriginLab 公司）和ChemBioDraw Ultra（版本：14. 0，美国PerkinElmer 公司）绘图DAS 软件（版本：3.0，上海博佳医药）的非房室模型计算药代参数。 最大血药浓度（Cmax）和达峰时间（Tmax）均为实测值，采用梯形法计算时间浓度曲线下面积（AUC），使用AUC0-t和相应给药剂量进行多剂量线性关系分析。

2 结果

2.1 质谱分析

选择低分子质量模式下进行FKB 的质谱分析，结果正离子模式监测优于负离子模式，在正离子模式下FKB 主要生成［M ＋H］＋峰。 对［M ＋H］＋峰的主要碎片离子进行扫描分析，结果见图1。

图1 质谱碎片及可能的裂解过程Figure 1 Product ion spectra and chemical structures with the fragmentation pattern

选择丰度最高且稳定性好的离子对（285.1/181.1）作为定量离子对用于FKB 的定量分析，另外选择一对丰度高且稳定性好的离子对（285.1/131.1）作为定性离子对用于FKB 的确认。

由于FKB 尚无商业化的稳定同位素标记物可供使用，本实验选择的内标是黄酮类化合物木犀草素，在正离子模式下对木犀草素进行离子扫描和离子对优化，结果见图1。 在MRM 模式下，FKB 和内标木犀草素的各离子对的保留时间、碰撞能量和去簇电压等液相-质谱参数结果见表1。

2.2 方法学考察

2.2.1 残留效应

使用含高浓度FKB 的模拟生物样品（800 ng/mL）及内标，考察XSelect＠HSS T3、XSelect＠HSS PFP 等不同色谱柱的残留，结果XSelect＠HSS T3 色谱柱残留最少；考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-异丙醇-水等不同洗脱体系下系统的残留，结果乙腈-异丙醇-水洗脱条件下残留最少，结果见图2。 因此使用XSelect＠HSS T3 色谱柱以乙腈-异丙醇-水为洗脱相来进行方法学的验证。

注：AⅠ，AⅡ：黄卡瓦胡椒素B（800 ng/mL）/内标（IS）在甲醇-水洗脱体系下残留的离子流图；BⅠ，BⅡ：黄卡瓦胡椒素B（800 ng/mL）/内标（IS）在乙腈-水洗脱体系下残留的离子流图；CⅠ，CⅡ：黄卡瓦胡椒素B（800 ng/mL）/内标（IS）在乙腈-异丙醇-水洗脱体系下残留的离子流图。图2 不同洗脱体系下的残留色谱图Note. AⅠ，AⅡ. Extracted ion chromatogram of Flavokawain B （800 ng/mL） / internal standard（IS） in methanol-water elution system. BⅠ，BⅡ. Extracted ion chromatogram of Flavokawain B （800 ng/mL） / internal standard （IS） in acetonitrile-water elution system. CⅠ，CⅡ.Extracted ion chromatogram of Flavokawain B （800 ng/mL） / internal standard （IS） in acetonitrile isopropanol water elution system.Figure 2 Carry-over results under different elution systems

2.2.2 提取溶剂选择

将含FKB 的模拟生物样品（100 ng/mL）按“1.2.4”项下方法操作，考察FKB 和内标木犀草素在3 倍甲醇和3 倍乙腈提取条件下的提取率。 提取率结果表明3 倍乙腈（FKB 为97.08% ± 6.60%、IS为92.12% ± 4.24%）稍优于3 倍甲醇（FKB 为84.70% ± 1.89%、IS 为96.83% ± 4.50%），因此采用3 倍乙腈作为提取溶剂进行后续方法学验证。

2.3 方法学确证

2.3.1 方法的选择性

如图3 所示，待测成分峰形和分离效果较好，FKB 出峰时间约为4.06 min，内标出峰时间约为2.65 min，小鼠血浆和脑组织中的内源性物质、代谢产物等基本不干扰以上成分的检出。

注：A，F：空白血浆样品提取离子流图；B，G：空白血浆样品加入内标（IS，木犀草素）和FKB（LOQ 浓度，0.2 ng/mL）的提取离子流图；C，H：小鼠尾静脉注射给药0.083 h 后的血浆样品提取离子流图；D，I：小鼠腹腔注射给药0.083 h 后的血浆样品提取离子流图；E，J：小鼠灌胃给药0.083 h 后的血浆样品提取离子流图。图3 血浆中黄卡瓦胡椒素B 和内标的MRM 色谱图Note. A，F. Extracted ion chromatogram of blank plasma sample. B，G. Blank plasma samples spiked with internal standard （IS，luteolin） and Flavokawain B （LOQ concentration，0.2 ng/mL）. C，H. Extracted ion chromatogram of plasma sample obtained 0.083 h after intravenous injection in mice. D，I. Extracted ion chromatogram of plasma sample obtained 0.083 h after intraperitoneal injection in mice. E，J. Extracted ion chromatogram of plasma sample obtained 0.083 h after intragastric administration in mice.Figure 3 Multiple reactions monitoring chromatogram of Flavokawain B and internal standard in plasma

2.3.2 线性范围及定量限

血浆中FKB 典型的标准曲线回归方程为Y＝0.010X＋0.0033，相关系数r为0.9995，在0.2 ～800 ng/mL 范围内线性关系良好，经信噪比S/N ＝10 计算的LOQ 为0.2 ng/mL。

2.3.3 基质效应与提取回收率

LOQ 样品及各浓度QC 样品的基质效应为88.68% ～ 102.04%，提取回收率在95.42% ～101.55%，表明样品提取和分析方法良好。

2.3.4 准确度与精密度

结果显示，LOQ 相对误差在- 4.45% ～12.50%，各浓度QC 样品相对误差在-8.50% ～9.70%；日内和日间精密度LOQ 样品的RSD 在13.00%以内，各浓度QC 样品的RSD 在10.00%以内，表明分析方法准确、稳定可行。

2.3.5 残留与稀释效应

进样高浓度QC 样品后，空白样品的残留均低于内标响应的0.03%，低于LOQ 样品的11.03%；稀释后样品准确度为2. 43% ～8. 62%，精密度为2. 48%，表明分析方法的残留及稀释可靠性良好。

2.3.6 稳定性

测定低、中、高浓度QC 样品在不同处理条件的稳定性，实验结果表明FKB 在室温放置2 h（回收率：92.89% ～109.20%），经过3 次冻融（回收率：95.69% ～103.98%），-80℃条件下储存1 个月（回收率：90.86% ～103.46%），及处理后的样品在进样室内放置24 h（回收率：109.04% ～111.70%），稳定性基本良好。

2.4 药代动力学结果

小鼠在静脉（20 mg/kg）、腹腔注射（20、40 和60 mg/kg）和灌胃（200、400 和600 mg/kg）给药后未发现明显不良反应，FKB 的平均药时浓度曲线见图4，计算的主要药代动力学参数见表2。 FKB 在小鼠体内吸收速度很快，各给药组在第1 个采血时间点0.083 h 即为峰值；体内滞留时间MRT0-t较短，为2.78 ～4.51 h；表观分布容积较大，均高于243.63L/kg。 与尾静脉注射和腹腔注射给药（半衰期：4.89 ～9.70 h；清除率：22.25 ～44.23 L/（h·kg）相比，FKB 灌胃给药体内半衰期（1.71 ～2.78 h）明显减小；清除率（1263.38 ～2001.95 L/（h·kg））明显加快。 与静脉给药相比，腔腔注射FKB 的绝对生物利用度为46.31% ～62.06%，灌胃FKB 的绝对生物利用度仅为1.14% ～1.81%。 腹腔注射和灌胃给药FKB 多剂量线性关系分析结果见图5，可知小鼠在腹腔注射20 ～60 mg/kg 及灌胃200 ～600 mg/kg 给药剂量范围内，药代动力学过程呈明显的线性关系（Pearson’sr＞0.97）。

表2 小鼠尾静脉注射、腹腔注射和灌胃黄卡瓦胡椒素B 后血浆中药代动力学参数（±s，n ＝6）Table 2 Pharmacokinetic parameters of plasma Flavokawain B in mice after intravenous injection，intraperitoneal injection，and intragastric administration （±s，n ＝6）

表2 小鼠尾静脉注射、腹腔注射和灌胃黄卡瓦胡椒素B 后血浆中药代动力学参数（±s，n ＝6）Table 2 Pharmacokinetic parameters of plasma Flavokawain B in mice after intravenous injection，intraperitoneal injection，and intragastric administration （±s，n ＝6）

参数Parameter i．v．20（g/kg）i．p．20（mg/kg）i．p．40（mg/kg）i．p．60（mg/kg）i．g．200（mg/kg）i．g．400（mg/kg）i．g．600（mg/kg）AUC0-t（h·ng/mL）852.940529.320786.9601436.280154.490217.640292.130 AUC0-∞（h·ng/mL）898.820578.840898.5601437.080158.310341.190299.710 MRT0-t（h）4.5104.2203.2705.0903.7303.5802.780 MRT0-∞（h）6.0605.8306.3505.1003.99011.2503.090 t1/2z（h）7.6004.8908.3302.0401.8108.8402.180 Tmax（h）0.0830.0830.0830.0830.0830.0830.083 Vz/F （L/kg）244.060243.630534.920122.950329.0801495.880630.400 CLz/F L/（h·kg）22.25034.55044.52041.750126.340117.240200.200 C5 min or Cmax（ng/mL）503.860294.160532.460602.39062.29097.510211.440 F（%）-62.06046.13056.1301.8101.2801.140

注：A：小鼠尾静脉注射给药后黄卡瓦胡椒素B 的平均药时浓度曲线；B：小鼠腹腔注射给药后黄卡瓦胡椒素B 的平均药时浓度曲线；C：小鼠灌胃给药后黄卡瓦胡椒素B 的平均药时浓度曲线；D：小鼠腹腔注射给药后黄卡瓦胡椒素B 在0 ～4 h 的平均药时浓度曲线局部放大图；E：小鼠灌胃给药后黄卡瓦胡椒素B 在0 ～4 h 的平均药时浓度曲线局部放大图。图4 小鼠给药后黄卡瓦胡椒素B 的平均药时浓度曲线（x¯±s，n ＝6）Note. A. Mean concentration-time curve of Flavokawain B after intravenous injection in mice. B. Mean concentration-time curve of Flavokawain B after intraperitoneal injection in mice. C. Mean concentration-time curve of Flavokawain B after intragastric administration in mice. D. Partially enlarged plot of the mean concentration-time curve of Flavokawain B from 0 ～4 h after intraperitoneal injection in mice； E. Partially enlarged view of the mean concentration-time curve of Flavokawain B in mice after intragastric administration from 0 ～4 h.Figure 4 Mean concentration-time curve of Flavokawain B in mice after administration（x¯±s，n ＝6）

注：A：小鼠腹腔注射给药后血浆中黄卡瓦胡椒素B 的AUC0-t 与给药剂量间的线性关系；B：小鼠灌胃给药后血浆中黄卡瓦胡椒素B 的AUC0-t与给药剂量间的线性关系。图5 小鼠给药后血浆中黄卡瓦胡椒素B 的AUC0-t与给药剂量间的线性关系（x¯±s，n ＝6）Note. A. The linear relationship between AUC0-t and dosage of Flavokawain B in plasma after intraperitoneal injection in mice. B. The linear relationship between AUC0-t and dosage of Flavokawain B in plasma after intragastric administration in mice.Figure 5 Linear relationship between AUC0-t and the dosage of Flavokawain B in the plasma of mice after administration（x¯±s，n ＝6）

3 讨论

关于卡瓦胡椒相关制剂中FKB 的含量测定方法有多种，如HPLC-紫外光谱法、高效薄层色谱法、核磁共振波谱法和HPLC-MS 法等［16-19］，但FKB 在生物样品中检测方法的报道相对较少。 Kanumuri等［17］报道了健康志愿者血浆中FKB 的超高效液相（UHPLC）-MS 方法，Yang 等［20］报道了大鼠血浆中FKB 的UHPLC-MS 方法，以上检测方法的血浆样品来源分别为人和大鼠，定量限分别为0.25 ng/mL 和0.53 ng/mL，在小鼠血浆中FKB 的检测方法尚未见报道。 为深入了解FKB 在小鼠体内的药代动力学特征，本研究利用HPLC-MS/MS 建立灵敏、准确度高的血药浓度分析方法，并进一步探讨该方法在小鼠尾静脉注射、腹腔注射和灌胃给药不同剂量后血药浓度分析的适用性，这将为后期FKB 在小鼠体内药理机制和安全性研究提供依据。 在前期实验中，发现FKB 容易在色谱柱残留，因此优化了不同色谱柱和不同洗脱条件的残留，提高了FKB 的检测准确度，同时还考察了样品的稀释效应，控制定量上限，达到进一步减少FKB 残留的目的。 并且，通过色谱柱等液相条件和质谱参数的优化，本方法检测FKB的LOQ 低至0.20 ng/mL，和上述方法相比有一定的提高。 本文建立的FKB 的HPLC-MS/MS 分析方法，经验证符合中国药典《生物样品分析方法指导原则》的要求［21］，可同时满足小鼠尾静脉注射、腹腔注射和灌胃给药不同剂量FKB 后血浆中药物浓度的样品检测（0.34 ～1814.32 ng/mL），并完整绘制了各给药途径血浆中FKB 的药时曲线，成功用于FKB 的药代动力学特征及生物利用度研究。

文献报道FKB 小鼠灌胃剂量为500 mg/kg［22］，在此基础上依据初步的急性毒性结果对剂量进行了探索，FKB 的最终剂量范围设计为腹腔注射20 ～60 mg/kg、灌胃200 ～600 mg/kg，尾静脉注射为20 mg/kg。 在整个实验过程中小鼠状态良好，未发现明显不良反应。

小鼠灌胃和腹腔注射后，FKB 吸收速度很快，血药浓度在给药后第一个采血时间点5 min 即为峰值，通过PubChem 网站查询FKB 的油水分配系数LogP 为3.8，说明FKB 的脂溶性高、渗透性高，这可能是其体内迅速吸收的重要原因。 FKB 表观分布容积（高于243.63 L/kg）远大于小鼠的体液体积（0.73 L/kg）［23］，说明FKB 在小鼠体内的分布极为广泛。 FKB 灌胃给药的绝对生物利用度极差（1.38%），这与灌胃给药的体内消除半衰期较短及清除率较快有关。 文献报道查尔酮等黄酮类成分代谢稳定性差，口服后以原型形式吸收入血少，并且药物极易受胃酸、消化酶和肠道菌群的影响［24-25］，亦能导致进入体循环的药量相对变少，这提示在后期FKB 的相关制剂开发过程中对生物利用度需要特别关注。 另外，在FKB 质谱检测的285.1/181.1 离子对通道上约2.69 min 处有一色谱峰（图3H ～3J），并随FKB 的浓度变化而呈规律性变化，推断可能是FKBⅡ相代谢物，如FKB 的葡萄糖醛酸苷等进一步电离而形成的。 关于FKB 体内主要代谢物及相关活性的研究，课题组未来将进一步探索。 FKB 腹腔注射给药的绝对生物利用度为53.29%，相比灌胃给药有很大提升，并且在20 ～60mg/kg 给药剂量范围内呈现线性的药代动力学过程，这为使用腹腔给药进行FKB 相关药理机制的探索提供了依据。

在研究中，发现受试药物FKB 溶解度低（0.012 g/L，25℃），几乎不溶于水，因而使用5% Tween80和4% DMSO 辅料助溶。 虽然Tween80 和DMSO 是科研常用的助溶剂，但我国近年临床研究发现，不少品种中药注射剂出现的严重不良反应均与使用了Tween80 相关［26-27］。 此外，高剂量的DMSO 静脉注射可能也会带来副作用［28］。 因此，本研究中静脉注射方式给药在助溶剂用量上存在一定的不足之处。 在未来研究中，将尝试通过化学修饰等手段增加FKB 溶解度或减少药物起效浓度等方式来减少助溶剂的用量，进而再次开展其药代动力学相关研究。 总之，本研究建立的HPLC/MS-MS 测定小鼠血浆中FKB 的方法简便、准确、灵敏度高，适用于FKB在小鼠血浆中药代动力学特征和生物利用度研究，研究结果为FKB 相关制剂的进一步研究开发提供了新方法和数据参考。